Name: Une approche pour améliorer lalignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Apprenez à améliorer l'alignement axonal et la myélinisation des neurones du ganglion spinal chez le rat en utilisant un système de culture cellulaire pré-étiré. Cette méthode optimise la réparation nerveuse.

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Les auteurs tiennent à remercier Eric Vasco pour son aide dans la préparation des substrats PDMS, le Dr Shiyong Wang dans le laboratoire du Dr Marina Mata à l&#39;Université du Michigan pour des suggestions et de la formation de l&#39;isolement de DRG utiles, et le Dr Mark Tuszynski et le Dr . W. Marie Campana à l&#39;UC San Diego pour des suggestions utiles et le protocole pour l&#39;isolement de SC. Cette étude a été financée en partie par la National Science Foundation (CBET 0.941.055 et 1.510.895 CBET), l&#39;Institut national de la santé (R21CA176854, R01GM089866 et R01EB014986).

Toutes les procédures pour l&#39;isolement des cellules ont été approuvées par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à Michigan State University. 1. Préparation des pré-étiré Surface anisotrope <ol><li> Mélanger 10: 1 solution de base et l&#39;agent de durcissement et de verser le mélange dans une boîte de culture tissulaire (12 cm de diamètre). Utilisez 4,900 mg de base et 490 mg d&#39;agent de durcissement pour le mélange de réticulation totale. </li><li> Maintenir le mélange de gel sous vide pendant 20 minutes pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Placer le mélange de gel dans le four pour un durcissement pendant une nuit à 60 ° C. </li><li> Après les cures de membrane PDMS, traiter la surface avec un plasma d&#39;oxygène à l&#39; aide d&#39; un système de nettoyage / de gravure par plasma pendant 3 min à 165 mTorr et 65 flux de sccm d&#39;O 2. </li><li> Coupez un morceau de membrane rectangulaire (5 x 3,5 cm) de l&#39;antenne, tout en étant conscient de quel côté est l&#39;oxygène traité, assurez-vous du côté de l&#39;oxygène traité est orientée vers le haut et le fixer sur un cadre d&#39;étirage. Placez le cadre sur un<html> étirement scène et étirer uniformément en tournant le bouton sur la scène jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne 10% d&#39; allongement (ou d&#39; un autre tronçon prédéterminé; l&#39;allongement peut être lue directement à partir du stade d&#39; étirage) dans l&#39;axe plus 9. Fixer le tronçon en serrant les vis sur le cadre. </li><li> Retirez le cadre de la scène. Vérifiez que la surface de la membrane est sèche et exempte de poussière, puis placer une chambre de silicone sur la membrane permettant le côté collant de la chambre d&#39;attacher solidement à la membrane. Remarque: La chambre de silicone fournit un puits pour retenir le milieu de cellules sur la membrane PDMS. La conception du dispositif est représenté sur la figure 1. </li><li> Stériliser la surface avec des UV pendant 10 min. </li><li> Ajouter 1 ml de poly-L-lysine (PLL) (0,01% dans un tampon phosphate salin) à la surface du PDMS intérieur de la chambre, dans les 6 heures de traitement par plasma et laisser incuber pendant 2 heures à 37 ° C avant l&#39;ensemencement des neurones DRG. Cela améliore la fixation des cellules. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. Isolement des DRG <ol><li> Préparer un milieu de croissance standard pour les neurones DRG. </li><li> Préalablement à l&#39;isolement, dans un autoclave de l&#39;équipement et des réactifs d&#39;isolement de filtre. Ajouter 5 ml de tampon d&#39;isolement dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits, et placez la plaque sur la glace. Préparer 10 ml de milieu de dissociation en ajoutant 1 ml de collagénase A (500 U / ml) à 9 ml de 0,05% de trypsine-EDTA (1 mg / ml), on filtre la solution avec un filtre 0,22 pm et placer sur de la glace. </li><li> Utiliser dix à douze 5-7 rats Sprague-Dawley &quot;jours pour l&#39;isolement. Vaporiser les chiots avec 75% d&#39;isopropanol, et le sacrifice par décapitation. </li><li> Coupez la peau recouvrant la moelle épinière de l&#39;arrière et retirez tout excès de tissu autour de la colonne vertébrale. Sous une loupe chirurgicale avec les lumières de tache chirurgicales sur, faire la première incision du cou, puis une coupe le long de la colonne vertébrale sur les deux côtés avec des ciseaux. Détachez la colonne vertébrale du corps des chiots et enlever l&#39;excès de muscles. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le long de la long axe de la colonne vertébrale et de l&#39;utilisation des pinces pour ouvrir la colonne vertébrale complètement et extraire la moelle cord.Remove la pointe d&#39;une pipette pour créer une plus grande ouverture pour transférer les DRG avec un tampon d&#39;isolement dans un tube de 15 ml stérile. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une belle paire de pinces à épiler, retirez le ganglion de la poche de l&#39;os et de recueillir environ 10 - 16 DRG des deux côtés. Couper les racines nerveuses et transférer les noyaux dans le tampon d&#39;isolement glacée. </li><li> Retirer la pointe d&#39;une pipette pour créer une plus grande ouverture pour transférer les DRG avec un tampon d&#39;isolement dans un tube de 15 ml stérile. Après la dissociation chimique, centrifuger les ganglions à 900 x g et 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Laissez les tissus se déposent au fond du tube et retirez délicatement le tampon d&#39;isolement sur le dessus et ajouter 10 ml de milieu de dissociation dans le tube. </li><li> Incuber les tissus disséqués dans le milieu de dissociation dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 1 heure en agitant le tube tous les 5 - 10 min. </li><li> Aprèsla dissociation chimique, centrifuger les ganglions à 900 x g et 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de médias de croissance standard et vortex. </li><li> Centrifuger les cellules dissociées comme indiqué à la section 2.9 une fois de plus. </li><li> Retirer le surnageant, remettre en suspension le culot dans 12 ml de milieu de croissance standard et vortex. </li></ol> 3. Culture de DRG sur la surface pré-étiré <ol><li> Avant l&#39;ensemencement des cellules, enlever les solutions PLL de la chambre et rincer la surface de PDMS avec de l&#39;eau stérile et l&#39;air sec. </li><li> Après remise en suspension des cellules, laisser l&#39;ensemble de la suspension pendant 1 - 2 min pour permettre aux débris de se déposer au fond du tube. Ajouter 1,5 ml de suspension cellulaire dans chaque chambre d&#39;étirage et incuber à 37 ° C sous 5% de CO 2. </li><li> Pour éliminer les cellules gliales, à 1 jour in vitro (DIV), ajouter 10 pi (ou 15 pi) mélange de fluoro-2 désoxy-uridine et uridine (FDU-U) Stock solutisur (Voir le tableau des matériaux) dans chaque puits. Après 7 heures, remplacer ce milieu avec un milieu de croissance standard frais et placer le dispositif de culture pré-étiré dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Au cours de la période de culture cellulaire (2 - 3 semaines), changer les médias tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usé avec du milieu frais. Nota: Après culture sur les surfaces tendus et détendus pendant 2 semaines, SCs purifiés sont ajoutés à la chambre et mises en culture pendant une semaine (étape 4.7). </li></ol> 4. Co-culture de cellules de Schwann (SC) avec DRG Neurones sur la surface pré-étiré <ol><li> Isoler SCs tel que décrit par le groupe du Dr Campana 15 auparavant. <ol><li> En bref, isoler le SCs d&#39;un vieux chiot 1 jour. Recueillir et dissocier les nerfs sciatiques à la fois chimiquement (trypsine-EDTA et collagénase A) et mécaniquement (18 aiguille de calibre / 10 ml seringue) 15. </li><li> Ensemencer les cellules dissociées en poly-D-lysine (PDL) coATED flacon T25 et à la culture à 37 ° C sous 5% de CO 2. Le jour 5, purifier les cellules grâce à la sélection d&#39;anticorps en utilisant Anti-thy 1.1 anticorps et complément de lapin et de sous-culture les cellules purifiées au passage 2 - 4. moyen Utilisation de culture contenant du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10% de sérum bovin fœtal (FBS) , 1% de pénicilline / streptomycine (Penn / Strep), 21 pg / ml Extrait pituitaire bovin (BPE) et 4 uM forskoline. </li></ol></li><li> Retirer le milieu de culture à partir de la CS et ajouter 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA dans le ballon. Incuber les cellules à 37 ° C sous 5% de CO2 pendant 2-3 min. </li><li> Vérifiez les cellules au microscope optique en utilisant un objectif 10X pour voir si elles élèvent du flacon, puis ajouter 5 ml de milieu de culture et mélanger avec les cellules dans le flacon. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et on centrifuge à 200 x g et à 20 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et resuspendre le culot dans 7 ml de med de croissance DRG normeia. </li><li> Prendre 10 pl de suspension cellulaire dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation, mélanger avec 10 pi de bleu trypan, puis compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre en microscopie optique en utilisant un objectif 10X. Diluer la suspension cellulaire 5.000 cellules par ml par addition de milieu de croissance DRG. </li><li> Retirer 0,5 ml de milieu de la culture DRG dans la chambre étirée et ajouter 0,5 ml de SC suspension à la culture de DRG. </li><li> Culture des cellules pendant 1 semaine à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer les médias tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usé avec un milieu de croissance standard frais pour DRG. Après 1 semaine de co-culture, processus , les cellules par immunohistochimie 10. </li></ol>

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Pour induire l&#39;alignement axone sur la surface pré-étiré, il y a deux étapes essentielles: 1) la membrane PDMS doit être plat et d&#39;épaisseur homogène; et 2) les cellules gliales doivent être retirés de la DRG. Après le mélange des PDMS et réticulant et le durcissement dans un four, le gel de PDMS réticulé doit être conservé sur un dessus de banc plat et manipulé avec précaution pour éviter tout basculement. Le traitement par plasma d&#39;oxygène de la membrane PDMS doit être suivie dans les 6 h par revêtement PL...

Dans les lésions nerveuses, les proximale et distale nerveuses souches sont souvent empêchés de réalignement direct des faisceaux nerveux en raison du site de la lésion 1-2. Normalement, les secteurs de l&#39;axone sont composés de faisceaux hautement ordonnés et alignés d&#39;axones qui forment des réseaux complexes de connectivité. Cependant, la régénération nerveuse est un processus chaotique due à l&#39; alignement de l&#39; axone mal organisé 3-4. Par conséquent, afin de générer un nombre suffisant de régénération d&#39;axones qui relient le site de la lésion, il est nécessaire d&#39;induire un alignement axonale bien organisé. En outre, la démyélinisation accompagne les lésions nerveuses dues à la mort des cellules myélinisantes au site de la lésion. Depuis démyélinisation affecte fortement la capacité conductrice des axones survivants, traitements ciblant la démyélinisation ou la promotion de la remyélinisation sont importantes pour la récupération fonctionnelle après lésion du nerf 5. Ainsi, l&#39;objectif de ce protocole est d&#39;illustrer une approche d&#39;ingénierie qui répond à ces deux questionsde la régénération nerveuse. Anisotropie de surface, qui est définie comme une différence, lorsqu&#39;elle est mesurée le long d&#39; axes différents, des propriétés physiques ou mécaniques d&#39;un matériau, a été appliqué pour influencer l&#39; alignement des cellules, la croissance et la migration 6-7. En plus de la topographie, il existe d&#39;autres méthodes pour induire une anisotropie. Auparavant, nous avons étudié l&#39;anisotropie de surface induite par mécanique pré-étirement statique de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) membrane. La théorie de la &quot;petite super déformation imposée sur une grande&quot; prédit que la rigidité effective des cellules détectent dans le sens étiré diffère de la direction perpendiculaire, et cette différence de rigidité effective est due à la surface anisotropie 8. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur une membrane PDMS pré-étiré sont capables de détecter l&#39;anisotropie en tirant sur ​​la surface active et en conséquence, d&#39; aligner la direction pré-étiré 9. De même, une surface ar anisotropiqueising à partir d&#39; une surface pré-étiré mécanique affecte l&#39;alignement, ainsi que la croissance et la myélinisation du ganglion de la racine dorsale (DRG) axones 10. Ici , nous fournissons un protocole destiné à induire une anisotropie de surface sur un substrat pré-étiré statique PDMS pour améliorer la régénération axonale 10. Pour obtenir l&#39; alignement des axones, des caractéristiques topologiques avec des motifs souhaités, rapporté à fournir des conseils de contact à travers des fibres et des canaux 6,11-12 alignés, ont été démontrées pour faciliter l&#39; alignement des axones 11,13. Cependant, les techniques permettant d&#39;induire un alignement des axones par les caractéristiques topologiques, telles que des fibres, des canaux et des motifs rapportés, ont été incapables d&#39;allonger et d&#39;augmenter l&#39;épaisseur des axones. En revanche, progressive étirage mécanique a conduit à l&#39; alignement des axones dans la direction d&#39;étirement avec axones longs et plus épais que l&#39; augmentation de l&#39;amplitude du tronçon 14. Cependant, incorporant un dispositif de moteur alimenté in vivo est pasfaisable. En revanche, statique anisotropie induite pré-étiré est moins compliqué et peut être plus facilement incorporé dans les futures conceptions d&#39;échafaudage pour des applications in vivo. Dans ce protocole, un système de culture de cellules pré-étiré statique est utilisé pour induire une anisotropie de surface sans caractéristiques topologiques. Le système de culture pré-étiré est constitué d&#39;une membrane PDMS, un cadre extensible et un étage d&#39;étirage, après quoi la membrane est fixée sur le châssis et un tronçon de grandeur prédéterminée est appliquée à l&#39;étape d&#39;étirage. neurones DRG fraîchement isolées en culture sur la surface pré-étiré jusqu&#39;à 21 jours sont contrôlés pour l&#39;alignement et de l&#39;épaisseur axone. Par la suite, les cellules de Schwann (SC) co-cultivées avec les axones alignés sont surveillés pour la myélinisation. En incorporant de pré-étirement induite surface anisotropie , nous avons pu améliorer la cellule alignement différenciation et axone alignement de croissance des cellules souches mésenchymateuses et les neurones DRG 9-10, respectivement.

<table><tbody><tr><td>Milieu neurobasal 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplément 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveuse-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Trevigen</td><td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-2 désoxy-uridine</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Tampon d’isolement</td></tr><tr><td>Type I Collagénase</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur</td><td>Hyclone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Chambre en silicone</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td><td></td></tr><tr><td>Système de nettoyage/gravure au plasma</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Thy 1.1</td><td>anticorps Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Complément de lapin</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> <td>de croissance standardPour 500 ml de milieu neurobasal 1x, ajoutez 10 ml de B-27 50x, 5 ml de Glutamax-I 100x, 2,5 ml de pénicilline/streptomycine (Penn/Streptomycine), 1 ml d’Albumax-I, et 1 &mu ; l de NGF-- 7S (50 &mu ; g/ml).</td></tr><tr><td>FDU Solution mère</td><td></td><td></td><td>d’uridine FDU 100 mg dans 10 ml de ddH2O (10 mg/ml), filtrer dans la hotte et divisé en 500 &mu ; l aliquotes et conserver à -20 &ordm ;C. Uridine 5 g dans 166,7 ml de ddH2O (33 mg/ml), filtrer dans le capot, diviser en 200 &mu ; l aliquotes et stocker à -20 &ordm ;C.
Prendre 61,5 &mu ; l de FDU (10 mg/ml) et 20,5 &mu ; l d’uridine (33 mg/ml), et ajouter 4 918 &mu ; l de ddH2O jusqu’à une concentration finale de pâte, puis diviser en aliquotes de 1 ml et stocker à -20 &ordm ;C.</td></tr></tbody></table>

une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale neurones

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

La régénération axonale est un processus chaotique dû en grande partie à un alignement axonal non organisé. Par conséquent, pour qu’un nombre suffisant d’axones régénérés comble le site de la lésion, un alignement axonal correctement organisé est nécessaire. Étant donné que la démyélinisation après une lésion nerveuse altère fortement la capacité de conduction des axones survivants, la remyélinisation est essentielle au bon fonctionnement des nerfs régénérés. Précédemment, nous avons démontré que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) alignées sur une surface de pré-étirement induisaient une surface anisotrope parce que les cellules peuvent détecter une rigidité effective plus grande dans la direction étirée que dans la direction perpendiculaire. Nous avons également montré qu’une surface anisotrope résultant d’une surface mécanique pré-étirée affecte de la même manière l’alignement, ainsi que la croissance et la myélinisation des axones. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation d’une surface anisotrope pré-étirée, l’isolement et la culture de neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) sur une surface pré-étirée, et montrons le comportement de myélinisation d’une co-culture de neurones DRG avec des cellules de Schwann (SC) sur une surface pré-étirée.

Le système de culture de cellules pré-étiré promu l&#39; alignement de l&#39; axone 10 DRG. neurones DRG ont été cultivées sur des surfaces pré-étirées et non étirées pendant 12 jours. Les axones ont été colorées pour β-III-tubuline pour démontrer leur alignement. La figure 2 compare l&#39; orientation des axones sur les PDMS pré-étirées et non étirées substrats après 12 jours de culture. Les axones DRG alignés parallèlement à la direction d&#39;étirage, alors...

Ce protocole décrit l’isolement des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) isolés de rats et la culture de neurones DRG sur un système de culture cellulaire statique pré-étiré pour améliorer l’alignement axonal, avec co-culture ultérieure de cellules de Schwann (SC) pour favoriser la myélinisation.

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

L'objectif général de ce protocole est d'améliorer l'alignement des axones et la myélinisation des neurones des ganglions de la racine dorsale à l'aide d'un système de culture cellulaire statique pré-étiré. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire nerveux, telles que l'alignement des axones et la croissance de leur épaisseur. Le principal avantage de cette technique est que la méthode pré-étirée améliore non seulement l'alignement des axones, mais favorise également la myélinisation.Pour commencer cette procédure, versez le mélange de la base et de l'agent de durcissement dans une boîte de culture tissulaire. Maintenez le mélange de gel sous vide pendant 20 minutes afin d'éliminer les bulles d'air. Ensuite, placez le mélange de gel au four à 60 degrés Celsius pour une polymérisation nocturne.Une fois que la membrane en PDMS est polymérisée, traiter la surface avec du plasma d'oxygène dans le système de nettoyage et de gravure par plasma pendant trois minutes. Ensuite, découper un morceau de membrane rectangulaire dans la boîte. La fixer sur un cadre d'étirement avec le côté traité à l'oxygène orienté vers le haut.Ensuite, placez le cadre sur un plateau d'étirement et étirez-le uniformément en tournant le bouton du plateau jusqu'à ce qu'il atteigne un allongement de 10 % sur l'axe le plus long. Fixez ensuite l'étirement en resserrant les vis du cadre. Après cela, retirez le cadre du plateau.Veillez à ce que la surface de la membrane soit sèche et exempte de poussière avant de placer une chambre en silicone sur la membrane. Laissez le côté adhésif de la chambre s'attacher fermement à la membrane. Ensuite, stérilisez la surface par UV pendant 10 minutes.Ensuite, ajouter un millilitre de PLL sur la surface de PDMS dans la chambre dans les six heures suivant le traitement au plasma. Incuber ensuite pendant deux heures à 37 degrés Celsius avant de semer les neurones des ganglions de la racine dorsale afin d'améliorer l'attachement cellulaire. À cette étape, préparer le milieu de culture standard pour les neurones des ganglions de la racine dorsale.Avant l'isolement, stériliser les équipements d'isolement à l'autoclave et filtrer les réactifs. Ajouter cinq millilitres de tampon d'isolement dans un puits d'une plaque à six puits et placer la plaque sur de la glace. Préparer ensuite 10 millilitres de milieu de dissociation en ajoutant un millilitre de collagénase A à neuf millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 %.Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre et placez-la sur de la glace. Ensuite, sacrifiez 10 à 12 rats SD âgés de cinq à sept jours et retirez la peau recouvrant la moelle épinière depuis l’arrière de chacun. Éliminez tout tissu excédentaire autour de la colonne vertébrale.Sous une loupe chirurgicale, effectuez la première incision au niveau du cou, puis réalisez une coupe le long de la colonne vertébrale sur les deux côtés à l’aide de ciseaux. Détachez la colonne vertébrale du corps du petit et retirez les muscles excédentaires. Ensuite, coupez le long de l’axe longitudinal de la colonne vertébrale et utilisez une pince pour ouvrir complètement la colonne afin d’extraire la moelle épinière.Ensuite, retirez le ganglion de la loge osseuse. Taillez les racines nerveuses et transférez les ganglions dans le tampon d'isolement glacé. Collectez environ 10 à 16 ganglions racinaires dorsaux des deux côtés.Répétez la procédure de dissection pour les autres souriceaux. Transférez ensuite les ganglions rachidiens avec le tampon d'isolement dans un tube stérile de 15 millilitres. Laissez le tissu se déposer au fond du tube et retirez délicatement le tampon d'isolement situé en surface.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de dissociation dans le tube. Incubez les tissus disséqués dans le milieu de dissociation au bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure, en agitant le tube toutes les cinq à dix minutes. Après la dissociation chimique, centrifugez les ganglions à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Après cinq minutes, retirez le surnageant, resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu de croissance standard et vortexez. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules dissociées. Puis retirez le surnageant, resuspendez le culot dans 12 millilitres de milieu de croissance standard et vortexez.Avant de semer les cellules, retirez la solution de PLL de la chambre. Rincez la surface en PDMS avec de l'eau stérile et laissez-la sécher à l'air. Après la resuspension des cellules, laissez la suspension reposer une à deux minutes afin que les débris sédimentent au fond du tube.Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque chambre étirée et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2. Pour éliminer les cellules gliales à un jour in vitro, ajoutez 10 microlitres ou 15 microlitres de la solution mère de mélange FDU-U dans chaque puits. Après sept heures, remplacez ce milieu par un milieu de croissance standard frais et placez le dispositif de culture pré-étiré dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous 5 %CO2.Pendant la période de culture cellulaire, changez le milieu tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usagé par du milieu frais. Dans cette procédure, retirez le milieu de culture des cellules de Schwann et ajoutez cinq millilitres de trypsine-EDTA 0,05 % dans le flacon. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de CO2 pendant deux à trois minutes.Observer les cellules au microscope optique à l’aide d’un objectif 10X pour vérifier si elles se détachent du flacon. Ensuite, ajouter cinq millilitres de milieu de culture aux cellules dans le flacon et mélanger. Puis, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 millilitres et centrifuger à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez le culot dans sept millilitres de milieu de croissance standard pour les neurones sensoriels. Transférez ensuite 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Mélangez avec 10 microlitres de bleu de trypan, puis déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hématimètre en utilisant un objectif 10X.Ajouter le milieu de croissance des ganglions rachidiens pour diluer la suspension cellulaire à 5&nbsp;000 cellules par millilitre. Ensuite, retirer 0,5 millilitre de milieu de la culture de ganglions rachidiens dans la chambre étirée et ajouter 0,5 millilitre de suspension de cellules de Schwann à la culture de ganglions rachidiens. Cultiver les cellules pendant une semaine à 37&nbsp;degrés&nbsp;Celsius dans une atmosphère contenant 5&nbsp;% de CO2.Changer le milieu tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usagé par du milieu de croissance standard frais. Après deux semaines de culture sur des surfaces étirées et non étirées, des cellules de Schwann purifiées ont été ajoutées dans la chambre et cultivées pendant une semaine supplémentaire. On observe ici la coloration par la bêta-III tubuline des axones sur la surface étirée.Et ceci est la superposition des colorations de la tubuline bêta-III et de P0 sur la surface étirée, ce qui suggère que les cellules de Schwann sont attachées aux axones et probables les myélinisent. Cette image montre la coloration de la tubuline bêta-III pour les axones sur la surface non étirée. Et la superposition des colorations de la tubuline bêta-III et de P0 sur la surface non étirée suggère que les cellules de Schwann ne sont pas attachées aux axones.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder la membrane en PDMS plate et d'épaisseur homogène. Après cette procédure, des atomiseurs tels que des microcanaux pré-étirés peuvent être réalisés afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la migration des axones et des cellules de Schwann.Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine du génie tissulaire pour explorer le rôle de l'anisotropie de surface sur la régénération nerveuse dans la moelle épinière et le nerf sciatique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire l'alignement des axones et la myélinisation à l'aide d'un dispositif pré-étiré.

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Ganglions de la racine dorsale (DRG) sont des structures contenant les neurones sensoriels du système nerveux périphérique. Lorsqu'ils sont dissociés, ils peuvent être co-cultivées avec des cellules souches du tissu adipeux SC-like (ASC), fournissant un modèle précieux pour étudier in vitro la régénération nerveuse et la myélinisation, imitant l'environnement in vivo au site de la lésion.

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

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Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

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Une approche pour améliorer l'alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

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