Name: Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser lexpression génique et génomique Transformations (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Découvrez le séquençage ARN ciblé pour enrichir des transcrits spécifiques et analyser l'expression génique, les mutations et les fusions géniques. Cette méthode personnalisable offre une approche rentable en biologie moléculaire.

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Nous remercions tout particulièrement Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto et Eric Samorodnitsky pour le soutien technique. Nous tenons également à remercier Jenny Badillo pour son soutien administratif à notre équipe. Nous remercions l’Ohio Supercomputer Center (OSC) de lui fournir de l’espace disque, de la capacité de traitement et du soutien pour exécuter nos analyses. Nous remercions le Comprehensive Cancer Center (CCC) du Wexner Medical Center de l’Université d’État de l’Ohio pour son soutien administratif à ce travail. S.R. et son équipe sont soutenus par l’American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), une bourse de jeune chercheur de la Prostate Cancer Foundation, le NHGRI (UM1HG006508-01A1), la Fore Cancer Research Foundation, l’American Lung Association et Pelotonia.

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<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. reçoit des fonds de Novartis et d’Ariad Pharmaceuticals pour la conduite d’essais cliniques. Les membres de la famille immédiate de S.R. possèdent des actions de Johnson and Johnson.

RNA-seq Capture est une stratégie intermédiaire entre RNA-seq et microarray approches pour l&#39;évaluation d&#39;une partie sélectionnée du transcriptome. Les avantages de la capture comprennent le coût, le délai d&#39;exécution rapide réduits sur un séquenceur de bureau, à haut débit, et la détection des altérations génomiques. Le procédé peut être adapté pour caractériser ARN non-codants 23, détecter seul nucléotide variantes 4-6, examiner épissage de l&#39; ARN, et d&#39;identifier les fusions ...

Le séquençage entier du transcriptome ou de l’ARN (RNAseq) est une méthode de séquençage non biaisée permettant d’évaluer tous les produits ARN. L’objectif du RNAseq ciblé (Capture) est une évaluation ciblée des transcrits sélectionnés avec une sensibilité accrue, une plage dynamique, un coût ou une échelle réduits et un débit accru par rapport au RNAseq standard. À l’instar du RNAseq standard, les approches d’enrichissement ciblé peuvent être utilisées pour évaluer l’expression des gènes, plusieurs espèces d’ARN telles que l’ARNm, le microARN (miARN), lncRNA1, d’autres ARN non codants2, les fusions de gènes3 et les mutations4-6.
La capture implique l’hybridation d’oligonucléotides complémentaires pour enrichir les banques d’ADNc pour le séquençage. La raison d’être de la capture par séquençage de l’ARN est similaire à celle des approches de microréseaux où des oligonucléotides ou des sondes complémentaires sont hybridés à des échantillons, puis mesurés pour leur abondance relative. Pour les technologies de microréseaux, l’expression est basée sur le signal relatif mesuré pour les transcrits se liant à ces sondes. Les microréseaux sont donc limités par la portée, le bruit de fond potentiel dû à la liaison non spécifique et l’hybridation croisée des sondes. De plus, les puces ont une plage dynamique limitée pour les transcrits faibles et fortement exprimés par rapport au RNAseq1. Les microréseaux sont largement utilisés en raison de leur coût réduit et de leur capacité de débit élevée par rapport au RNAseq. 
Ici, nous démontrons une méthode de capture RNAseq qui offre un terrain d’entente entre les approches RNAseq et les approches de microréseaux pour évaluer le transcriptome. RNAseq Capture a un débit intermédiaire, une plage dynamique et une sensibilité supérieures, et est mis à l’échelle pour un délai d’exécution rapide sur les séquenceurs de bureau. RNAseq Capture nécessite également des ressources de calcul réduites en termes d’espace de stockage et de traitement des données.

<table><tbody><tr><td>Thermomixeur R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Éthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs MiSeq v2 (300- cycles)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>Séquenceur de bureau MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Kit d’ARN total torsadé avec RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg ; Bloqueur universel Oligo - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg ; Bloqueur Universel Oligo - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg ; Bloqueur Universel Oligo - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg ; AMPure&reg ; XP - Perles de purification PCR&nbsp ;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg ; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT ADN humain, qualité fluorométrique, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg ; Tubes de dosage&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg ; dsDNA HS Assay</td><td>Kit Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg ; Kits d’hybridation et de lavage EZ&nbsp ; (24 ou 96 réactions)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp ;</td><td>05634261001 ou 05634253001</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit&reg ; 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free</td><td>Water Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade ; Thermocycleur avec 96&ndash ; Well Fast Rection Module</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Kits d’hybridation et de lavage</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcription 200 U/&#956 ; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Échelle de ruban d’écran d’ARN</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillonnage RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Dry Bath</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Réactifs</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

ciblées arn séquençage assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique transformations

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

séquençage de l&#39;ARN (RNA-seq) est une méthode polyvalente qui peut être utilisée pour détecter et caractériser l&#39;expression des gènes, des mutations, des fusions de gènes, et ARNs non codants. Norme exige RNA-seq 30-100000000 séquençage lit et peut inclure plusieurs produits d&#39;ARN tels que l&#39;ARNm et ARN non codantes. Nous démontrons comment ciblée RNA-seq (capture) permet une étude ciblée sur les produits d&#39;ARN sélectionnés à l&#39;aide d&#39;un séquenceur de bureau. RNA-seq capture peut caractériser les transcriptions annotées, faibles, ou exprimés de façon transitoire qui pourraient autrement être manquées en utilisant des méthodes traditionnelles RNA-seq. Nous décrivons ici l&#39;extraction d&#39;ARN à partir de lignées cellulaires, l&#39;ARN ribosomique, l&#39;épuisement de la synthèse d&#39;ADNc, la préparation de bibliothèques de codes à barres, l&#39;hybridation et la capture des produits de transcription cibles, et le séquençage multiplex sur un séquenceur de bureau. Nous présentons également le pipeline d&#39;analyse informatique, qui comprend l&#39;évaluation du contrôle de la qualité, l&#39;alignement, la détection de la fusion, l&#39;expression du gène de quantification et d&#39;identification de simple nucdes variants de leotide. Ce dosage permet un séquençage de transcription ciblé pour caractériser l&#39;expression des gènes, des fusions de gènes et des mutations.

A soulignant schématique des étapes clés dans RNA-seq capture est représenté sur la figure 1. Quatre lignes de cellules cancéreuses avec des mutations connues ont été utilisés pour démontrer l&#39;efficacité de la technique RNA-seq Capture (K562 avec ABL1 fusion, LC2 avec RET fusion, EOL1 avec PDGFRalpha fusion et RT- 4 avec FGFR3 fusion). Les quatre échantillons ont été regroupés et séquencés avec 2x 100 pb lit sur un séquenceur de bu...

Nous décrivons une méthode ciblée basée sur le séquençage de l’ARN qui comprend la préparation de banques d’ADNc indexées, l’hybridation et la capture avec des sondes personnalisées et l’analyse de données pour interroger les transcrits sélectionnés pour l’expression génique, les mutations et les fusions de gènes. Le RNAseq ciblé permet une évaluation rapide et rentable des transcrits sélectionnés sur un séquenceur de bureau.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

L'objectif général de ce test est d'enrichir les transcrits ciblés pour le séquençage de nouvelle génération. Ce test de séquençage ciblé de l'ARN est une procédure en plusieurs étapes qui commence par l'épuisement de l'ARN ribosomique à partir de l'ARN total, suivi d'une fragmentation chimique et de la synthèse d'ADN complémentaire, de la préparation de bibliothèques avec codes-barres, de l'hybridation et de la capture des transcrits ciblés, du séquençage multiplexé, et se termine par l'analyse des données. Cette vidéo démontrera les procédures d'hybridation, de capture ciblée et d'amplification par PCR après capture pour quatre échantillons.Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie moléculaire, comme l'identification de fusions géniques, de variations de nucléotide unique, d'expressions géniques relatives et d'épissages alternatifs impliquant des transcrits ciblés. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être personnalisée pour n'importe quels gènes d'intérêt. Pour commencer la procédure d'hybridation, sortir du congélateur à 20 degrés Celsius et décongeler sur de la glace les éléments suivants : sondes hydratées personnalisées,

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