Name: Stripe Assay pour étudier lactivité attractive ou répulsive dun substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Apprenez le stripe assay pour étudier l'attraction ou la répulsion axonale en utilisant des neurones hippocampiques dissociés de souris. Cette méthode permet d'analyser simultanément de nombreux cônes de croissance.

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Ce travail a été soutenu par des subventions pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (23700412, 25122707 et 26670090 à S.Y.).

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Hamamatsu. 1. Préparation des matrices <ol><li> Faire bouillir 4-8 matrices de silicone dans un micro-ondes ou sur une plaque chauffante pendant 5 minutes et laissez-les sécher complètement pendant 1 h sous flux laminaire (côté rayé vers le haut). Remarque: Les procédures suivantes doivent être effectuées sous flux laminaire. </li><li> Souffler de l&#39;air comprimé ou d&#39;utiliser du ruban adhésif transparent pour enlever toute la poussière du côté rayé des matrices. Gardez le côté rayé propre afin qu&#39;il puisse adhérer fermement à la surface de la plaque. </li><li> Placez délicatement les matrices sur des boîtes en plastique de 6 cm en appuyant avec un doigt (une matrice par plat, côté bande vers le bas). Évitez les bulles d&#39;air entre la matrice et le plat. Marquer la position des bandes sur le côté inférieur de la boîte de culture. </li><li> Si la matrice ne parvient pas à joindre, répéter de l&#39;étape 1.2. </li></ol>2. Stripe Generation et laminine revêtement pour Neuron Culture <ol><li> Préparer une protéine recombinante marquée par fluorescence (25 pi chacun pour injection [étape 2.2] ou 100 ul chacun pour le procédé de mise en place [étape 2.2.1]) en mélangeant la protéine Fc-étiquetée (10 à 50 ug / ml) et une dye- fluorescente un anticorps anti-Fc humain conjugué (1 à 3, le rapport: 30 à 150 pg / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS). Ensuite, laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> En utilisant une seringue de 22 G, l&#39; injection de 25 ul de la protéine recombinante préparée dans l&#39;étape précédente (2,1) à travers le petit trou sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E). <ol><li> En variante, placer 100 pi de la protéine recombinante dans la fente supérieure de la matrice et aspirer environ la moitié de la solution du petit trou (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E), de sorte que la protéine recombinante reste dans les régions rayées. </li></ol></li><li> Incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Placer 300 ul de PBS dans la fente supérieure (figure 1B) et aspirer du petit trou situé sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, C et E) pour éliminer les protéines recombinantes seules. Ne pas aspirer le PBS complètement, parce que les protéines vont sécher. Répéter deux fois cette étape. (3 fois au total) </li><li> Retirez délicatement la matrice et placer immédiatement ~ 100 ul de protéine de contrôle (10-50 pg / ml; Fc) pour couvrir la zone rayée entier, créant un revêtement alternatif. Ensuite, laisser incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Après lavage de la surface de la boîte à trois reprises avec du PBS, enduire ~ 100 pi de 20 pg / ml de laminine dans du PBS. Remarque: laminine doit être décongelé sur de la glace pour empêcher la solidification. </li><li> Laisser incuber le plat pendant 1 h à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Laver la surface de la boîte à trois reprises avec PBS et ajouter la culture medium. Placer le récipient revêtu de milieu de culture dans un incubateur à CO2 à 5% à 37 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. La culture hippocampique Neurones de E15.5 embryons de souris <ol><li> Euthanasier mère par dislocation cervicale et d&#39;isoler trois E15.5 embryons. </li><li> Couper la peau et le crâne sagittale sur la ligne médiane de la tête avec des ciseaux, et retirer le cerveau à l&#39;aide d&#39;une petite cuillère. Transférer le cerveau soigneusement dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> L&#39; utilisation d&#39; un scalpel, découper les hémisphères , y compris le cortex, l&#39; hippocampe et le striatum (figure 2A). Puis, disséquer la région hippocampique en retirant soigneusement les méninges, et transférer les tissus hippocampiques disséqués à un tube centrifuge de 15 ml contenant 2 ml de solution HBSS, sur la glace (figure 2B-C). Collecter 6 hippocampes de 3 embryons dans le tube, qui sont suffisantes pour la culture de neurones dans 8 plats. </li><li> Remplacer le Hla solution BSS avec une solution de trypsine / EDTA (2 ml) et on incube le tube à 37 ° C pendant 15 min dans un bain d&#39;eau. Remarque: Aspirer HBSS sans centrifugation et ne décante la solution HBSS en inclinant le tube. </li><li> Neutraliser l&#39;activité de la trypsine en ajoutant 500 pi de sérum de fœtus bovin (FBS). </li><li> Centrifuger le mélange à 100 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant et on lave le culot avec 2 ml de milieu de culture. Répétez cette étape une fois de plus. </li><li> Pipet les hippocampes de haut en bas 10 fois dans un milieu de culture à l&#39;aide d&#39;une pointe de 1000 pi avec un grand trou (coupe-tip) de dissocier le tissu. </li><li> Passez à une base régulière (uncut) pointe de 1000 pi et pipeter le tissu dissocié de haut en bas pour obtenir une suspension à cellule unique. </li><li> Séparer les cellules individuelles en les faisant passer à travers un tamis à mailles cellule-80-100 pm. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire unique filtré à 150 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le pellet (neurones) dans 2 ml de milieu de culture. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre avec une coloration au bleu trypan pour déterminer la densité et la viabilité. Ensuite, la plaque de 10.000 neurones dans 150 ul de milieu de culture pour chaque ensemble de stripes.The suspension doit être soigneusement placé pour couvrir la région de bande entière. </li></ol> 4. Visualisation des organes et des axones par immunofluorescence cellulaires en utilisant un anticorps anti-Tau1 <ol><li> Après 24 h de culture, aspirer le milieu sans perturber les cellules adhérentes, et fixer les neurones avec pré-chauffé 4% de paraformaldehyde (PFA) / 4% de saccharose / PBS à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Si vous le souhaitez, utiliser un stylo hydrofuge pour dessiner un cercle autour de la région rayée pour diminuer la quantité d&#39;anticorps nécessaire. </li><li> Perméabiliser les neurones avec 0,3% de Triton X-100 / PBS pendant 5 min. </li><li> Incuber les neurones avec une solution de blocage contenant 3% de sérum d&#39;âne et 0,1% de Triton X-10030 min suivi d&#39;une incubation avec un anticorps anti-Tau1 (1: 200) dans le sérum d&#39;âne à 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N à 4 ° C. </li><li> Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Incuber les neurones avec un anticorps IgG anti-souris conjugué à un fluorophore dans 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS pendant 30 min. </li><li> Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Couvrir la région rayée avec un 18 mm verre de couverture x 18 mm en utilisant 50 pl de antifade solution. éviter les bulles d&#39;air, qui interfèrent avec la formation d&#39;image. </li><li> Obtenir des images fluorescentes avec un microscope à fluorescence en utilisant le système approprié, par exemple, x10 objectif, jeux de filtres pour la GFP et RFP, et le temps d&#39;exposition de 1000 msec (Figure 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit un test de bande qui utilise une protéine recombinante et les neurones dissociés de l&#39;hippocampe de souris E15.5. Ce dosage permet d&#39;observer l&#39;efficacité des réactions de répulsion, attirant ou neutre de neurones à une protéine recombinante d&#39;intérêt placé dans un motif rayé. Un avantage majeur de ce protocole est le procédé simple pour produire des bandes, dans lequel la protéine est directement imprimée sur la surface d&#39;une boîte en matière plastique, par rapport à la méthode t...

L&#39; orientation Axon est le processus par lequel les neurones nouvellement formés envoient des axones à leur cible au cours du développement du système nerveux 1,2. axones en développement portent une structure très mobiles à leur extrémité appelée cône de croissance. Le cône de croissance détecte les signaux extracellulaires pour naviguer le chemin de l&#39;axone. Molécules d&#39;orientation, telles que fente, sémaphorine et ephrines, peuvent attirer ou repousser les axones en fonction de leur interaction avec des récepteurs appropriés et co-récepteurs sur l&#39;axone 1,3,4. Les récepteurs activés transfèrent des signaux au cône de croissance qui affectent son organisation du cytosquelette pour axone et la croissance cône mouvements. Diverses méthodes ont été mises au point pour évaluer l&#39;action des molécules répulsives et attractives. Chemo-attractants et insectifuges peuvent être administrés dans le milieu de croissance / culture avec une concentration de gradient (par exemple., La chambre de Dunn ou u-slides) 5,6, dans un endroit très concentré par des micro-pipette (par exemple., essai tournant) 7 ou à une concentration homogène par application de bain (par ex., le dosage de l&#39; effondrement du cône de croissance) 8,9. D&#39; autres procédés comprennent un essai de rayure ou de l&#39; impression par microcontact (uCP), dans lequel un chimio-attractant ou répulsive est appliquée sur la surface d&#39;une plaque de substrat 10 à 12. Thestripe essai a été initialement développé par Bonhoeffer et ses collègues en 1987 pour analyser la cartographie topographique dans le poussin système rétino-tectal 13. La méthode originale nécessitait un système de vide pour des protéines d&#39;enveloppe sur des membranes Nucleopore polycarbonate en utilisant des matrices et des rayures maillés. Dans les versions ultérieures, les protéines recombinantes ont été imprimées directement sur ​​la surface d&#39;une plaque de culture dans un motif rayé en utilisant fente étroite matrices de silicium 14,15. Récemment, divers groupes de recherche ont appliqué avec succès ce test de bande à l&#39;analyse des activités de molécules de guidage axonal 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Ici, nous présentons le protocole détaillé pour un essai de bande qui mesure l&#39;attraction ou la répulsion des molécules de guidage axonal pour les neurones hippocampiques dissociées. En particulier, cette méthode peut être appliquée dans des conditions de laboratoire très peu équipés. Pour ce dosage, des bandes alternées d&#39;un substrat marqué de manière fluorescente et une protéine de contrôle sont générés sur une boîte en matière plastique en utilisant une matrice de silicium avec des fentes 90 um et recouvertes de laminine. Dans notre démonstration, dissociées les neurones hippocampiques de souris E15.5 ont été cultivées sur des bandes de ectodomaine recombinant de la fibronectine et la leucine-riche en protéines 2 transmembranaire (FLRT2) et le contrôle de la protéine Fc 21 alternance. Après 24 h de la culture, à la fois les axones et les corps cellulaires des neurones ont été fortement repoussés par les bandes de FLRT2. Coloration avec un anticorps anti-Tau1 ~ a révélé que 90% des neurones ont été distribués sur les régions Fc revêtues, par rapport à environ 10% sur la FLRT2-Fc, ce qui indique que FLRT2 a une forte répulsionfonction pour les neurones hippocampiques 21.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 15 ml</td><td>Violamo&nbsp ;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA) à 4 %</td> <td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorps IgG anti-humain pour chèvre</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anticorps IgG anti-souris pour âne</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Tau1</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>Dilution 1/200</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Possibilité d’utiliser d’autres milieux de montage</td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Dilution 1/50</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Machine de centrifugation</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm N° 1</td><td></td></tr><tr><td>Stylo DAKO</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Stylo hydrofuge alternatif</td></tr><tr><td>Scalpel jetable</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Pince n° 5</td><td>Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Hamilton Seringue</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>22 gauge, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>IgG humaines, Fc Fragment</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Neurobasal</td><td> Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Boîte de culture en plastique, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Matrices</td><td></td><td></td> <td>en siliconeDisponible et disponible à l’achat auprès du Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Pointe, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif transparent</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Du ruban adhésif alternatif peut être utilisé</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan, 0,4 %</td> <td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td><td>de culture Neurobasal supplémenté en B27, GlutaMAX et pénicilline-streptomycine.</td></tr></tbody></table>

stripe assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique neurones

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Les axones en croissance développent une structure très mobile à leur extrémité, appelée cône de croissance. Le cône de croissance entre en contact avec des signaux environnementaux extracellulaires pour naviguer dans la croissance axonale. La nétrine, la fente, la sémaphorine et les éphrines sont des molécules de guidage connues qui peuvent attirer ou repousser les axones lors de la liaison aux récepteurs et corécepteurs de l’axone. Les récepteurs activés initient diverses molécules de signalisation dans le cône de croissance qui modifient la structure et le mouvement du neurone. Ici, nous décrivons le protocole détaillé d’un test de bande pour évaluer la capacité d’une molécule de guidage à attirer ou à repousser les neurones. Dans cette méthode, des neurones dissociés de l’hippocampe de souris E15.5 sont cultivés sur des boîtes enrobées de laminine traitées avec des bandes alternées d’ectodomaine de fibronectine et de protéine transmembranaire riche en leucine 2 (FLRT2) et de protéine de région cristallisable (Fc) de fragment d’immunoglobuline G (IgG). Les axones et les corps cellulaires ont été fortement repoussés des régions de bandes recouvertes de FLRT2 après 24 h de culture. L’immunomarquage avec tau1 a montré que ~90 % des neurones étaient répartis sur les bandes recouvertes de Fc par rapport aux bandes recouvertes de FLRT2-Fc (~10 %). Ce résultat indique que FLRT2 a un fort effet répulsif sur ces neurones. Cette méthode puissante est applicable non seulement aux neurones primaires cultivés, mais également à une variété d’autres cellules, telles que les neuroblastes.

Neurones hippocampiques dissociées de souris E15.5 ont été étalées et cultivées pendant 24 h sur des bandes de contrôle marquées par fluorescence Fc (figure 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figure 3D-F) en alternance avec Fc non marqué contrôle. Dans les deux cas, les neurones ont été agrégées et ont étendu leurs axones sous forme de faisceaux. Sur le contrôle des bandes Fc / Fc, les neurones ont été distribués uniformément sur ​​les bandes marquées par fluorescence e...

Les molécules de guidage axonal régulent la migration neuronale et la navigation ciblée des cônes de croissance. Nous présentons une méthode puissante, le stripe assay, pour évaluer la capacité des molécules de guidage à attirer ou à repousser les neurones. Dans ce protocole, nous démontrons le test de bande en montrant la capacité de FLRT2 à repousser les neurones de l’hippocampe en culture.

Stripe Assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

L'objectif général du test en bandes est d'évaluer la capacité de protéines spécifiques, telles que les molécules de guidage, à attirer ou à repousser les neurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine du guidage des axones, comme la manière dont les neurones peuvent migrer ou étendre leurs axones en réponse à l'environnement cellulaire externe. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer un grand nombre de neurones au cours d'une seule expérience et d'analyser simultanément de nombreux cônes de croissance.En préparation, faites bouillir quatre à huit matrices en silicone dans de l'eau pendant cinq minutes. Laissez-les sécher complètement à l'air sous une hotte à flux laminaire, côté rayé vers le haut. Cette étape prend environ une heure.Continuer à travailler sous la hotte. Utiliser de l'air comprimé ou du ruban adhésif pour éliminer toute poussière présente sur le côté rayé des matrices. Puis placer délicatement chaque matrice dans un plat en plastique de six centimètres de diamètre, le côté rayé vers le bas.Appuyez fermement sur chaque matrice avec un doigt. Évitez de piéger des bulles d'air entre la matrice et la boîte. Si la matrice n'adhère pas, répétez le processus.Une fois fixés, marquer l'emplacement des bandes sur la face inférieure de la boîte de culture. Préparer les protéines recombinantes marquées de façon fluorescente dans le PBS. Préparer 25 microlitres pour chaque boîte présentant des bandes.Laisser le mélange incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, pour chaque boîte, charger une seringue de calibre 22 avec 25 microlitres de protéine diluée et l'injecter à travers le petit trou sur le côté de la matrice. Éviter l'injection de bulles d'air dans les matrices, car elles perturberaient la fixation des protéines sur leurs boîtes.Incubez maintenant les boîtes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture cellulaire. Après l'incubation, déposez 300 microlitres de PBS dans la fente supérieure de chaque matrice. Aspirez ensuite le PBS par un petit trou situé sur le côté de chaque matrice afin d'éliminer toutes les protéines recombinantes non fixées.Ne pas aspirer complètement le PBS car les protéines s'assécheraient. Effectuer ce rinçage au PBS un total de trois fois. Ensuite, retirer soigneusement la matrice de chaque boîte. Ensuite, ajoutez immédiatement environ 100 microlitres de protéine contrôlée sur toute la zone rayée, créant ainsi un revêtement alterné sur chaque boîte. Incubez ensuite les boîtes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, décongelez sur de la glace la laminine et le PBS à 20 microgrammes par millilitre.Après 30 minutes, laver les boîtes trois fois avec du PBS. Ensuite, recouvrir chaque boîte d'environ 100 microlitres de laminine froide et replacer les boîtes dans l'incubateur pendant une heure supplémentaire. Une heure plus tard, laver à nouveau les boîtes trois fois avec du PBS.Après le troisième lavage, ajouter environ 150 microlitres de milieu de culture dans chaque boîte. Incuber ensuite les boîtes dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 °C jusqu’à leur prochaine utilisation. Après l’euthanasie d’une souris donneur E15,5, inciser la peau et le crâne de façon sagittale dans la ligne médiane de la tête à l’aide de ciseaux chirurgicaux, puis prélever le cerveau à l’aide d’une micro-spatule.Transférez délicatement le cerveau dans une boîte de Pétri de 60 millilitres contenant trois millilitres de HBSS. Dans la boîte, utilisez un scalpel pour découper les hémisphères, y compris le cortex, l'hippocampe et le striatum. Ensuite, isolez les régions hippocampiques en retirant soigneusement les méninges.Transférez les tissus hippocampiques disséqués dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant deux millilitres de solution HBSS sur de la glace. Six hippocampes provenant de trois embryons suffisent pour cultiver des neurones dans huit boîtes. Une fois tous les tissus hippocampiques réunis, aspirez le HBSS et remplacez-le par deux millilitres de trypsine-EDTA.Incubez ensuite le tube pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, neutralisez l'activité de la trypsine en ajoutant 500 microlitres de sérum de veau fœtal. Puis centrifugez le mélange à 100 Gs pendant cinq minutes.Éliminer le surnageant et laver le culot avec deux millilitres de milieu de culture. Puis centrifuger à nouveau le mélange et remplacer le milieu par du milieu frais. Dissocier maintenant le tissu par une trituration douce à l’aide d’une pipette de un millilitre à embout coupé.Faites passer les tissus de haut en bas à travers l'embout du pipeteur environ 10 fois. Ensuite, utilisez un embout de un millilitre non coupé et répétez la trituration pour obtenir une suspension de cellules individuelles. Isolez maintenant les cellules individuelles en faisant passer la suspension à travers un tamis cellulaire de 80 à 100 microns.Ensuite, centrifuger la suspension filtrée à 150 G pendant cinq minutes, aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans deux millilitres de milieu de culture. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et ensemencer 10 000 neurones dans 150 microlitres de milieu de culture sur chaque plaque striée préparée. Déposer délicatement la suspension afin de recouvrir entièrement la région striée.Des neurones hippocampiques dissociés provenant de souris E15,5 ont été ensemencés et cultivés pendant 24 heures sur des bandes de protéine témoin marquée de façon fluorescente FC, ou bien les neurones ont été ensemencés sur des bandes alternées de FLRT2 FC et de protéine témoin FC non marquée. Dans les deux cas, les neurones se sont regroupés et ont étendu leurs axones en faisceaux. Sur le témoin FC, les neurones étaient répartis uniformément et étendaient leurs axones dans des directions aléatoires. En revanche, lorsqu'ils étaient cultivés avec des bandes de FLRT2 FC, les axones évitaient de croître sur les régions contenant le FLRT2 FC.Ainsi, les axones en croissance se sont principalement développés sur les bandes de FC. Une augmentation du grossissement montre que les axones se sont développés le long de la frontière avec les bandes de FC FLRT2, mais ne se sont pas étendus dans le territoire de FLRT2. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer un tapis rayé des protéines recommandées et d'évaluer l'activité attractive ou paralysante à l'aide de neurones hippocampiques dissociés.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement.

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Stripe Assay pour étudier l'activité attractive ou répulsive d'un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

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