Stripe Assay pour étudier l'activité attractive ou répulsive d'un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

L'objectif général du test en bandes est d'évaluer la capacité de protéines spécifiques, telles que les molécules de guidage, à attirer ou à repousser les neurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine du guidage des axones, comme la manière dont les neurones peuvent migrer ou étendre leurs axones en réponse à l'environnement cellulaire externe. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer un grand nombre de neurones au cours d'une seule expérience et d'analyser simultanément de nombreux cônes de croissance.

En préparation, faites bouillir quatre à huit matrices en silicone dans de l'eau pendant cinq minutes. Laissez-les sécher complètement à l'air sous une hotte à flux laminaire, côté rayé vers le haut. Cette étape prend environ une heure.

Continuer à travailler sous la hotte. Utiliser de l'air comprimé ou du ruban adhésif pour éliminer toute poussière présente sur le côté rayé des matrices. Puis placer délicatement chaque matrice dans un plat en plastique de six centimètres de diamètre, le côté rayé vers le bas.

Appuyez fermement sur chaque matrice avec un doigt. Évitez de piéger des bulles d'air entre la matrice et la boîte. Si la matrice n'adhère pas, répétez le processus.

Une fois fixés, marquer l'emplacement des bandes sur la face inférieure de la boîte de culture. Préparer les protéines recombinantes marquées de façon fluorescente dans le PBS. Préparer 25 microlitres pour chaque boîte présentant des bandes.

Laisser le mélange incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, pour chaque boîte, charger une seringue de calibre 22 avec 25 microlitres de protéine diluée et l'injecter à travers le petit trou sur le côté de la matrice. Éviter l'injection de bulles d'air dans les matrices, car elles perturberaient la fixation des protéines sur leurs boîtes.

Incubez maintenant les boîtes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture cellulaire. Après l'incubation, déposez 300 microlitres de PBS dans la fente supérieure de chaque matrice. Aspirez ensuite le PBS par un petit trou situé sur le côté de chaque matrice afin d'éliminer toutes les protéines recombinantes non fixées.

Ne pas aspirer complètement le PBS car les protéines s'assécheraient. Effectuer ce rinçage au PBS un total de trois fois. Ensuite, retirer soigneusement la matrice de chaque boîte.

Ensuite, ajoutez immédiatement environ 100 microlitres de protéine contrôlée sur toute la zone rayée, créant ainsi un revêtement alterné sur chaque boîte. Incubez ensuite les boîtes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, décongelez sur de la glace la laminine et le PBS à 20 microgrammes par millilitre.

Après 30 minutes, laver les boîtes trois fois avec du PBS. Ensuite, recouvrir chaque boîte d'environ 100 microlitres de laminine froide et replacer les boîtes dans l'incubateur pendant une heure supplémentaire. Une heure plus tard, laver à nouveau les boîtes trois fois avec du PBS.

Après le troisième lavage, ajouter environ 150 microlitres de milieu de culture dans chaque boîte. Incuber ensuite les boîtes dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 °C jusqu’à leur prochaine utilisation. Après l’euthanasie d’une souris donneur E15,5, inciser la peau et le crâne de façon sagittale dans la ligne médiane de la tête à l’aide de ciseaux chirurgicaux, puis prélever le cerveau à l’aide d’une micro-spatule.

Transférez délicatement le cerveau dans une boîte de Pétri de 60 millilitres contenant trois millilitres de HBSS. Dans la boîte, utilisez un scalpel pour découper les hémisphères, y compris le cortex, l'hippocampe et le striatum. Ensuite, isolez les régions hippocampiques en retirant soigneusement les méninges.

Transférez les tissus hippocampiques disséqués dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant deux millilitres de solution HBSS sur de la glace. Six hippocampes provenant de trois embryons suffisent pour cultiver des neurones dans huit boîtes. Une fois tous les tissus hippocampiques réunis, aspirez le HBSS et remplacez-le par deux millilitres de trypsine-EDTA.

Incubez ensuite le tube pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, neutralisez l'activité de la trypsine en ajoutant 500 microlitres de sérum de veau fœtal. Puis centrifugez le mélange à 100 Gs pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant et laver le culot avec deux millilitres de milieu de culture. Puis centrifuger à nouveau le mélange et remplacer le milieu par du milieu frais. Dissocier maintenant le tissu par une trituration douce à l’aide d’une pipette de un millilitre à embout coupé.

Faites passer les tissus de haut en bas à travers l'embout du pipeteur environ 10 fois. Ensuite, utilisez un embout de un millilitre non coupé et répétez la trituration pour obtenir une suspension de cellules individuelles. Isolez maintenant les cellules individuelles en faisant passer la suspension à travers un tamis cellulaire de 80 à 100 microns.

Ensuite, centrifuger la suspension filtrée à 150 G pendant cinq minutes, aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans deux millilitres de milieu de culture. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et ensemencer 10 000 neurones dans 150 microlitres de milieu de culture sur chaque plaque striée préparée. Déposer délicatement la suspension afin de recouvrir entièrement la région striée.

Des neurones hippocampiques dissociés provenant de souris E15,5 ont été ensemencés et cultivés pendant 24 heures sur des bandes de protéine témoin marquée de façon fluorescente FC, ou bien les neurones ont été ensemencés sur des bandes alternées de FLRT2 FC et de protéine témoin FC non marquée. Dans les deux cas, les neurones se sont regroupés et ont étendu leurs axones en faisceaux. Sur le témoin FC, les neurones étaient répartis uniformément et étendaient leurs axones dans des directions aléatoires. En revanche, lorsqu'ils étaient cultivés avec des bandes de FLRT2 FC, les axones évitaient de croître sur les régions contenant le FLRT2 FC.

Ainsi, les axones en croissance se sont principalement développés sur les bandes de FC. Une augmentation du grossissement montre que les axones se sont développés le long de la frontière avec les bandes de FC FLRT2, mais ne se sont pas étendus dans le territoire de FLRT2. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer un tapis rayé des protéines recommandées et d'évaluer l'activité attractive ou paralysante à l'aide de neurones hippocampiques dissociés.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement.