Name: Stripe Assay pour étudier lactivité attractive ou répulsive dun substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Apprenez le stripe assay pour étudier l'attraction ou la répulsion axonale en utilisant des neurones hippocampiques dissociés de souris. Cette méthode permet d'analyser simultanément de nombreux cônes de croissance.

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Ce travail a été soutenu par des subventions pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (23700412, 25122707 et 26670090 à S.Y.).

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Hamamatsu. 1. Préparation des matrices <ol><li> Faire bouillir 4-8 matrices de silicone dans un micro-ondes ou sur une plaque chauffante pendant 5 minutes et laissez-les sécher complètement pendant 1 h sous flux laminaire (côté rayé vers le haut). Remarque: Les procédures suivantes doivent être effectuées sous flux laminaire. </li><li> Souffler de l&#39;air comprimé ou d&#39;utiliser du ruban adhésif transparent pour enlever toute la poussière du côté rayé des matrices. Gardez le côté rayé propre afin qu&#39;il puisse adhérer fermement à la surface de la plaque. </li><li> Placez délicatement les matrices sur des boîtes en plastique de 6 cm en appuyant avec un doigt (une matrice par plat, côté bande vers le bas). Évitez les bulles d&#39;air entre la matrice et le plat. Marquer la position des bandes sur le côté inférieur de la boîte de culture. </li><li> Si la matrice ne parvient pas à joindre, répéter de l&#39;étape 1.2. </li></ol>2. Stripe Generation et laminine revêtement pour Neuron Culture <ol><li> Préparer une protéine recombinante marquée par fluorescence (25 pi chacun pour injection [étape 2.2] ou 100 ul chacun pour le procédé de mise en place [étape 2.2.1]) en mélangeant la protéine Fc-étiquetée (10 à 50 ug / ml) et une dye- fluorescente un anticorps anti-Fc humain conjugué (1 à 3, le rapport: 30 à 150 pg / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS). Ensuite, laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> En utilisant une seringue de 22 G, l&#39; injection de 25 ul de la protéine recombinante préparée dans l&#39;étape précédente (2,1) à travers le petit trou sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E). <ol><li> En variante, placer 100 pi de la protéine recombinante dans la fente supérieure de la matrice et aspirer environ la moitié de la solution du petit trou (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E), de sorte que la protéine recombinante reste dans les régions rayées. </li></ol></li><li> Incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Placer 300 ul de PBS dans la fente supérieure (figure 1B) et aspirer du petit trou situé sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, C et E) pour éliminer les protéines recombinantes seules. Ne pas aspirer le PBS complètement, parce que les protéines vont sécher. Répéter deux fois cette étape. (3 fois au total) </li><li> Retirez délicatement la matrice et placer immédiatement ~ 100 ul de protéine de contrôle (10-50 pg / ml; Fc) pour couvrir la zone rayée entier, créant un revêtement alternatif. Ensuite, laisser incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Après lavage de la surface de la boîte à trois reprises avec du PBS, enduire ~ 100 pi de 20 pg / ml de laminine dans du PBS. Remarque: laminine doit être décongelé sur de la glace pour empêcher la solidification. </li><li> Laisser incuber le plat pendant 1 h à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Laver la surface de la boîte à trois reprises avec PBS et ajouter la culture medium. Placer le récipient revêtu de milieu de culture dans un incubateur à CO2 à 5% à 37 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. La culture hippocampique Neurones de E15.5 embryons de souris <ol><li> Euthanasier mère par dislocation cervicale et d&#39;isoler trois E15.5 embryons. </li><li> Couper la peau et le crâne sagittale sur la ligne médiane de la tête avec des ciseaux, et retirer le cerveau à l&#39;aide d&#39;une petite cuillère. Transférer le cerveau soigneusement dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> L&#39; utilisation d&#39; un scalpel, découper les hémisphères , y compris le cortex, l&#39; hippocampe et le striatum (figure 2A). Puis, disséquer la région hippocampique en retirant soigneusement les méninges, et transférer les tissus hippocampiques disséqués à un tube centrifuge de 15 ml contenant 2 ml de solution HBSS, sur la glace (figure 2B-C). Collecter 6 hippocampes de 3 embryons dans le tube, qui sont suffisantes pour la culture de neurones dans 8 plats. </li><li> Remplacer le Hla solution BSS avec une solution de trypsine / EDTA (2 ml) et on incube le tube à 37 ° C pendant 15 min dans un bain d&#39;eau. Remarque: Aspirer HBSS sans centrifugation et ne décante la solution HBSS en inclinant le tube. </li><li> Neutraliser l&#39;activité de la trypsine en ajoutant 500 pi de sérum de fœtus bovin (FBS). </li><li> Centrifuger le mélange à 100 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant et on lave le culot avec 2 ml de milieu de culture. Répétez cette étape une fois de plus. </li><li> Pipet les hippocampes de haut en bas 10 fois dans un milieu de culture à l&#39;aide d&#39;une pointe de 1000 pi avec un grand trou (coupe-tip) de dissocier le tissu. </li><li> Passez à une base régulière (uncut) pointe de 1000 pi et pipeter le tissu dissocié de haut en bas pour obtenir une suspension à cellule unique. </li><li> Séparer les cellules individuelles en les faisant passer à travers un tamis à mailles cellule-80-100 pm. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire unique filtré à 150 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le pellet (neurones) dans 2 ml de milieu de culture. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre avec une coloration au bleu trypan pour déterminer la densité et la viabilité. Ensuite, la plaque de 10.000 neurones dans 150 ul de milieu de culture pour chaque ensemble de stripes.The suspension doit être soigneusement placé pour couvrir la région de bande entière. </li></ol> 4. Visualisation des organes et des axones par immunofluorescence cellulaires en utilisant un anticorps anti-Tau1 <ol><li> Après 24 h de culture, aspirer le milieu sans perturber les cellules adhérentes, et fixer les neurones avec pré-chauffé 4% de paraformaldehyde (PFA) / 4% de saccharose / PBS à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Si vous le souhaitez, utiliser un stylo hydrofuge pour dessiner un cercle autour de la région rayée pour diminuer la quantité d&#39;anticorps nécessaire. </li><li> Perméabiliser les neurones avec 0,3% de Triton X-100 / PBS pendant 5 min. </li><li> Incuber les neurones avec une solution de blocage contenant 3% de sérum d&#39;âne et 0,1% de Triton X-10030 min suivi d&#39;une incubation avec un anticorps anti-Tau1 (1: 200) dans le sérum d&#39;âne à 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N à 4 ° C. </li><li> Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Incuber les neurones avec un anticorps IgG anti-souris conjugué à un fluorophore dans 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS pendant 30 min. </li><li> Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Couvrir la région rayée avec un 18 mm verre de couverture x 18 mm en utilisant 50 pl de antifade solution. éviter les bulles d&#39;air, qui interfèrent avec la formation d&#39;image. </li><li> Obtenir des images fluorescentes avec un microscope à fluorescence en utilisant le système approprié, par exemple, x10 objectif, jeux de filtres pour la GFP et RFP, et le temps d&#39;exposition de 1000 msec (Figure 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
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<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit un test de bande qui utilise une protéine recombinante et les neurones dissociés de l&#39;hippocampe de souris E15.5. Ce dosage permet d&#39;observer l&#39;efficacité des réactions de répulsion, attirant ou neutre de neurones à une protéine recombinante d&#39;intérêt placé dans un motif rayé. Un avantage majeur de ce protocole est le procédé simple pour produire des bandes, dans lequel la protéine est directement imprimée sur la surface d&#39;une boîte en matière plastique, par rapport à la méthode t...

L&#39; orientation Axon est le processus par lequel les neurones nouvellement formés envoient des axones à leur cible au cours du développement du système nerveux 1,2. axones en développement portent une structure très mobiles à leur extrémité appelée cône de croissance. Le cône de croissance détecte les signaux extracellulaires pour naviguer le chemin de l&#39;axone. Molécules d&#39;orientation, telles que fente, sémaphorine et ephrines, peuvent attirer ou repousser les axones en fonction de leur interaction avec des récepteurs appropriés et co-récepteurs sur l&#39;axone 1,3,4. Les récepteurs activés transfèrent des signaux au cône de croissance qui affectent son organisation du cytosquelette pour axone et la croissance cône mouvements. Diverses méthodes ont été mises au point pour évaluer l&#39;action des molécules répulsives et attractives. Chemo-attractants et insectifuges peuvent être administrés dans le milieu de croissance / culture avec une concentration de gradient (par exemple., La chambre de Dunn ou u-slides) 5,6, dans un endroit très concentré par des micro-pipette (par exemple., essai tournant) 7 ou à une concentration homogène par application de bain (par ex., le dosage de l&#39; effondrement du cône de croissance) 8,9. D&#39; autres procédés comprennent un essai de rayure ou de l&#39; impression par microcontact (uCP), dans lequel un chimio-attractant ou répulsive est appliquée sur la surface d&#39;une plaque de substrat 10 à 12. Thestripe essai a été initialement développé par Bonhoeffer et ses collègues en 1987 pour analyser la cartographie topographique dans le poussin système rétino-tectal 13. La méthode originale nécessitait un système de vide pour des protéines d&#39;enveloppe sur des membranes Nucleopore polycarbonate en utilisant des matrices et des rayures maillés. Dans les versions ultérieures, les protéines recombinantes ont été imprimées directement sur ​​la surface d&#39;une plaque de culture dans un motif rayé en utilisant fente étroite matrices de silicium 14,15. Récemment, divers groupes de recherche ont appliqué avec succès ce test de bande à l&#39;analyse des activités de molécules de guidage axonal 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Ici, nous présentons le protocole détaillé pour un essai de bande qui mesure l&#39;attraction ou la répulsion des molécules de guidage axonal pour les neurones hippocampiques dissociées. En particulier, cette méthode peut être appliquée dans des conditions de laboratoire très peu équipés. Pour ce dosage, des bandes alternées d&#39;un substrat marqué de manière fluorescente et une protéine de contrôle sont générés sur une boîte en matière plastique en utilisant une matrice de silicium avec des fentes 90 um et recouvertes de laminine. Dans notre démonstration, dissociées les neurones hippocampiques de souris E15.5 ont été cultivées sur des bandes de ectodomaine recombinant de la fibronectine et la leucine-riche en protéines 2 transmembranaire (FLRT2) et le contrôle de la protéine Fc 21 alternance. Après 24 h de la culture, à la fois les axones et les corps cellulaires des neurones ont été fortement repoussés par les bandes de FLRT2. Coloration avec un anticorps anti-Tau1 ~ a révélé que 90% des neurones ont été distribués sur les régions Fc revêtues, par rapport à environ 10% sur la FLRT2-Fc, ce qui indique que FLRT2 a une forte répulsionfonction pour les neurones hippocampiques 21.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 15 ml</td><td>Violamo&nbsp ;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA) à 4 %</td> <td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorps IgG anti-humain pour chèvre</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anticorps IgG anti-souris pour âne</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Tau1</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>Dilution 1/200</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Possibilité d’utiliser d’autres milieux de montage</td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Dilution 1/50</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Machine de centrifugation</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm N° 1</td><td></td></tr><tr><td>Stylo DAKO</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Stylo hydrofuge alternatif</td></tr><tr><td>Scalpel jetable</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Pince n° 5</td><td>Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Hamilton Seringue</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>22 gauge, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>IgG humaines, Fc Fragment</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Neurobasal</td><td> Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Boîte de culture en plastique, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Matrices</td><td></td><td></td> <td>en siliconeDisponible et disponible à l’achat auprès du Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Pointe, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif transparent</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Du ruban adhésif alternatif peut être utilisé</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan, 0,4 %</td> <td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td><td>de culture Neurobasal supplémenté en B27, GlutaMAX et pénicilline-streptomycine.</td></tr></tbody></table>

stripe assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique neurones

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Les axones en croissance développent une structure très mobile à leur extrémité, appelée cône de croissance. Le cône de croissance entre en contact avec des signaux environnementaux extracellulaires pour naviguer dans la croissance axonale. La nétrine, la fente, la sémaphorine et les éphrines sont des molécules de guidage connues qui peuvent attirer ou repousser les axones lors de la liaison aux récepteurs et corécepteurs de l’axone. Les récepteurs activés initient diverses molécules de signalisation dans le cône de croissance qui modifient la structure et le mouvement du neurone. Ici, nous décrivons le protocole détaillé d’un test de bande pour évaluer la capacité d’une molécule de guidage à attirer ou à repousser les neurones. Dans cette méthode, des neurones dissociés de l’hippocampe de souris E15.5 sont cultivés sur des boîtes enrobées de laminine traitées avec des bandes alternées d’ectodomaine de fibronectine et de protéine transmembranaire riche en leucine 2 (FLRT2) et de protéine de région cristallisable (Fc) de fragment d’immunoglobuline G (IgG). Les axones et les corps cellulaires ont été fortement repoussés des régions de bandes recouvertes de FLRT2 après 24 h de culture. L’immunomarquage avec tau1 a montré que ~90 % des neurones étaient répartis sur les bandes recouvertes de Fc par rapport aux bandes recouvertes de FLRT2-Fc (~10 %). Ce résultat indique que FLRT2 a un fort effet répulsif sur ces neurones. Cette méthode puissante est applicable non seulement aux neurones primaires cultivés, mais également à une variété d’autres cellules, telles que les neuroblastes.

Neurones hippocampiques dissociées de souris E15.5 ont été étalées et cultivées pendant 24 h sur des bandes de contrôle marquées par fluorescence Fc (figure 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figure 3D-F) en alternance avec Fc non marqué contrôle. Dans les deux cas, les neurones ont été agrégées et ont étendu leurs axones sous forme de faisceaux. Sur le contrôle des bandes Fc / Fc, les neurones ont été distribués uniformément sur ​​les bandes marquées par fluorescence e...

Les molécules de guidage axonal régulent la migration neuronale et la navigation ciblée des cônes de croissance. Nous présentons une méthode puissante, le stripe assay, pour évaluer la capacité des molécules de guidage à attirer ou à repousser les neurones. Dans ce protocole, nous démontrons le test de bande en montrant la capacité de FLRT2 à repousser les neurones de l’hippocampe en culture.

Stripe Assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

L'objectif général du test en bandes est d'évaluer la capacité de protéines spécifiques, telles que les molécules de guidage, à attirer ou à repousser les neurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine du guidage des axones, comme la manière dont les neurones peuvent migrer ou étendre leurs axones en réponse à l'environnement cellulaire externe. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer un grand nombre de neurones au cours d'une seule expérience et d'analyser simultanément de nombreux cônes de croissance.En préparation, faites bouillir quatre à huit matrices en silicone dans de l'eau pendant cinq minutes. Laissez-les sécher complètement à l'air sous une hotte à flux laminaire, côté rayé vers le haut. Cette étape prend environ une heure.Continuer à travailler sous la hotte. Utiliser de l'air comprimé ou du ruban adhésif pour éliminer toute poussière présente sur le côté rayé des matrices. Puis placer délicatement chaque matrice dans un plat en plastique de six centimètres de diamètre, le côté rayé vers le bas.Appuyez fermement sur chaque matrice avec un doigt. Évitez de piéger des bulles d'air entre la

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Cette vidéo démontre une approche d’alimentation en anticorps pour étudier le trafic des récepteurs du glutamate dans les cultures neuronales primaires de l’hippocampe. Cette approche permet d’observer les populations de récepteurs à la fois au niveau du plasma et des membranes internes. La discrimination entre ces sous-ensembles est obtenue en marquant les récepteurs avant et après la perméabilisation membranaire, en utilisant le même anticorps primaire mais des anticorps secondaires conjugués...

Une technique in vitro pour étudier le trafic des récepteurs du glutamate dans les neurones de l’hippocampe

Cette vidéo présente une méthode permettant d’évaluer l’activité des protéines à l’aide des neurones de l’hippocampe sur des zones protéiques à motifs. Les neurones présentent une répulsion dans les zones protéiques testées et une fixation dans les zones protéiques témoins, mettant en évidence les effets de l’activité protéique attractive ou répulsive.

Évaluation de l’activité attractive ou répulsive des protéines à l’aide des neurones de l’hippocampe

L'addition réversible aux protéines de palmitate est un régulateur important du trafic intracellulaire des protéines. Ceci est d'un intérêt particulier dans les neurones où de nombreuses protéines synaptiques sont palmitoylées. Nous utilisons une méthode simple biochimique pour détecter les protéines dans les neurones en culture palmitoylées, qui peuvent être adaptés à plusieurs types de cellules et de tissus.

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

Nous fournissons un protocole détaillé pour l'induction de la potentialisation à long terme dans la région CA1 de l'hippocampe et l'isolement subséquent de fractions enrichies à partir de la zone nucléaire tétanisée de la tranche. Cette approche peut être utilisée pour déterminer l'activité dépend énormément des importations de protéines nucléaires dans des modèles cellulaires de l'apprentissage et de la mémoire.

Isolement de CA1 nucléaires enrichies fractions de coupes d&#39;hippocampe pour étudier l&#39;activité dépendante nucléaire importation de Synapto nucléaires protéines Messenger

Endocytose Vésicule synaptique est détectée par microscopie de pHluorin fusionnée avec des protéines de la vésicule synaptique et par microscopie électronique de l’absorption de la vésicule.

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

L’excitabilité neuronale peut être modulée par un processus dynamique d’endo - et exocytose des récepteurs du glutamate ionotropiques excitateurs. Décrit ici, est un test accessible, à haute teneur pour quantifier les pools de population de récepteurs de surface et interne.

Un dosage de haute teneur de surveillance AMPA récepteur trafic

Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour purifier la fraction dendritique filopodia-riche de la structure phagocytic de la coupe-comme la saillie sur les neurones hippocampiques cultivés en profitant de l'affinité spécifique et forte entre un filopodial dendritique la molécule d'adhérence, TLCN, et une molécule extracellulaire de matrice, vitronectin.

Purification de la Fraction dendritique filopodia-riche

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Apprenez le stripe assay pour étudier l'attraction ou la répulsion axonale en utilisant des neurones hippocampiques dissociés de souris. Cette méthode permet d'analyser simultanément de nombreux cônes de croissance.

Stripe Assay pour étudier l'activité attractive ou répulsive d'un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

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