Isolement du géant lampbrush Chromosomes de Living oocytes de grenouilles et salamandres

L’objectif global de cette procédure est d’isoler le noyau géant, ou vésicule germinale, d’un ovocyte d’amphibien, et de propager les chromosomes en brosse de lampe et d’autres organites nucléaires sur une lame de microscope pour l’immunomarquage, l’hybridation in citu et d’autres techniques moléculaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la structure de base des chromosomes, des nucléoles et d’autres organites nucléaires, ainsi que sur les détails moléculaires de la transcription, de l’épissage et de l’exportation de l’ARN. Le principal avantage de cette technique est la facilité avec laquelle la structure et la transcription des chromosomes peuvent être examinées par une microscopie optique conventionnelle, en utilisant l’immunofluorescence, l’hybridation in citu et d’autres techniques moléculaires.

La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Zehra Nizami, postdoctorante de mon laboratoire. Après avoir préparé toutes les solutions requises, assemblez des lames de puits, composées de lames de verre sous-stratifiées, auxquelles des puits en plastique ont été fixés avec de la paraffine, comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, prélevez du tissu ovarien préalablement prélevé sur une grenouille femelle adulte ou une salamandre, et remplissez une petite boîte de Pétri avec un milieu de culture d’ovocytes.

Procédez à la mise en place d’une partie du tissu isolé, contenant environ 10 à 20 ovocytes, dans cette plaque. Ensuite, identifiez un seul ovocyte et utilisez deux paires de pinces de bijou pour sectionner la tige qui le relie à la paroi de l’ovaire. Une fois libéré, transférez l’ovocyte dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un milieu d’isolement de vésicule germinale, ou GV.

Sous un faible grossissement, localisez le pôle animal de l’ovocyte, qui peut être identifié par sa coloration foncée. Ensuite, à l’aide d’une pince, percez un grand trou près du pôle de l’animal et procédez à l’extraction douce du noyau transparent de l’ovocyte, également appelé GV. Ensuite, roulez le GV loin de tout jaune qui a également été extrudé. Pour éliminer le jaune qui reste bien collé, aspirez le noyau dans et hors d’une pipette dont l’embout a un diamètre légèrement supérieur à celui du GV. Suite à la collecte d’un GV de grenouille, transférez-le immédiatement dans un milieu de dispersion afin d’éviter le durcissement nucléaire qui interférerait avec les étapes ultérieures.

Ensuite, à l’aide de deux paires de pinces, saisissez l’enveloppe nucléaire près du haut du GV, en prenant soin de ne pas appuyer. Tout en tenant l’enveloppe, séparez les deux pinces et attendez-vous à ce que le contenu du noyau ressorte. Pour recueillir ce contenu, préparez d’abord une pipette réglable de 20 microlitres avec une pointe coupée comme décrit dans le protocole de texte.

Ensuite, à partir du bol, procédez à l’extraction de cinq microlitres de liquide de dispersion suivis de cinq microlitres de solution avec le contenu GV. Une fois que le contenu a été recueilli, transférez-le dans une lame de puits remplie de solution de dispersion. Assurez-vous que le liquide dans la lame a une surface convexe afin d’éviter le piégeage des bulles dans les étapes suivantes.

Ensuite, placez une lamelle de 18 millimètres sur le puits et placez la lame assemblée dans une chambre humide pendant 10 à 60 minutes. Pendant ce temps, attendez-vous à ce que le gel nucléaire se disperse lentement, de sorte que les chromosomes et les organites nucléaires viennent se trouver à la surface du verre. Après avoir retiré un noyau d’un ovocyte de salamandre, laissez-le dans le milieu d’isolement.

Notez que les GV de salamandre, contrairement à celles des espèces de grenouilles utilisées ici, ne durciront pas indûment dans cette solution. Retirer l’enveloppe nucléaire de la salamandre GV à l’aide de la même technique à l’aide de pinces que celle décrite pour les grenouilles. Ensuite, prélevez le contenu nucléaire légèrement gélifié à l’aide d’une pipette à pointe coupée et transférez le gel dans une boîte de Pétri contenant une solution de dispersion.

Rincez rapidement la pipette dans la solution de dispersion et utilisez-la pour recueillir le gel nucléaire. Ensuite, introduisez le gel dans une lame de puits, ajoutez une lamelle et laissez le gel se disperser comme décrit précédemment. Ensuite, utilisez le contraste de phase pour visualiser le contenu nucléaire et identifiez les chromosomes en brosse de lampe, abrégés en LBC, par leur grande taille et leurs boucles latérales appariées.

Après avoir vérifié que les LBC ne sont pas cassés, préparez la lame pour la centrifugation en plaçant un morceau de papier filtre sur la lamelle. Appuyez ensuite pour éliminer l’excès de liquide de la chambre. Ensuite, ajoutez de la vaseline sur chaque bord de la lamelle.

Chauffez une tige métallique à environ 70 à 80 degrés Celsius et utilisez-la pour faire fondre la gelée et sceller la glissière de couverture sur le plastique sous-jacent. Répétez cette procédure pour d’autres lames avec des LBC de bonne qualité. Une fois que toutes les lamelles ont été apposées, positionnez les glissières dans les supports pour la centrifugation et assurez-vous que les supports opposés sont équilibrés.

À l’aide de la fonction de démarrage lent, centrifugez les diapositives comme décrit dans le texte à l’aide de supports personnalisés. Alternativement, une centrifugeuse de table standard peut être utilisée où les lames sont collées sur une plaque et tournées. Pour préparer le contenu nucléaire à l’immunocoloration ou à l’hybridation en citu, essuyez d’abord le joint temporaire de vaseline avec une lame de rasoir, puis placez la lame dans la grille d’un plat de coloration standard à lame.

Ensuite, ajoutez suffisamment de paraformaldéhyde pour couvrir les lames. Lors de l’immersion, utilisez une pince émoussée pour retirer et jeter chaque lamelle. Laissez les lames dans le fixateur pendant 15 à 30 minutes.

Après la fixation, placez une lame dans un plat de coloration contenant du PBS glacé. Insérez ensuite une lame de rasoir tranchante sur le bord du carré de plastique et soulevez bien ce plastique. Une fois que ce processus a été répété pour toutes les lames, procédez à la coloration comme indiqué dans le protocole texte.

Cette image d’éclairage en fond noir montre le contenu nucléaire d’un seul GV d’axolotl en prophase de la première division méiotique, collecté et préparé selon le protocole décrit. 14 grands LBC appariés sont apparents, ainsi que des nucléoles amplifiés. Une coloration supplémentaire de cette préparation, avec un anticorps contre l’ARN polymérase II phosporylée, représentée ici en vert, révèle l’emplacement des corps de locus des histones et donne également un aperçu de l’activité transcriptionnelle robuste de ces chromosomes ovocytaires.

Le grossissement plus élevé d’un seul LBC d’axolotl, dans ce cas un qui a été coloré en vert pour l’ARN polymérase et en bleu pour l’ADN, démontre la caractéristique morphologique la plus unique de ces chromosomes. Des centaines de boucles latérales appariées, chacune représentant au moins une unité de transcription qui synthétise activement l’ARN. La comparaison avec une grenouille de couleur similaire, imagée avec le même grossissement, met en évidence l’énorme différence de taille entre les chromosomes de la grenouille et de la salamandre, une différence qui est en corrélation avec le contenu total en ADN des génomes de l’espèce utilisée.

Cependant, même dans le chromosome de la grenouille, les unités de transcription individuelles peuvent être vues comme des boucles de chromatine projetées latéralement à partir de l’axe du chromosome, comme le montre cette image à plus fort grossissement. Les ovocytes de poissons, d’oiseaux, de reptiles et de certains invertébrés contiennent également des chromosomes géants en forme de lampe. Remarquablement, les chromosomes en brosse de lampe sont générés lorsque des têtes de spermatozoïdes d’autres organismes, y compris des humains, sont injectées dans la vésicule germinale de l’amphibien.

Une fois la technique maîtrisée, un lot d’épandages d’AGV peut être préparé en une heure, puis centrifugé et fixé en une à deux heures supplémentaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler un GV et de propager les chromosomes en brosse de lampe pour une étude plus approfondie à l’aide de sondes moléculaires.