Une stratégie rapide pour l'isolement des nouveaux Faustoviruses d'échantillons environnementaux Utilisation

Le but général de cette nouvelle stratégie d'isolement est d'élargir le nombre de nouveaux isolats viraux afin d'étudier le pangénome de cette nouvelle famille virale, et de mieux comprendre leurs écosystèmes ainsi que leur pathogénicité potentielle pour l'humain. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, en aidant les virologues du monde entier intéressés par la prospection des virus géants, et des Faustovirus en particulier. Le principal avantage de cette technique réside dans les nouvelles améliorations apportées à plusieurs étapes, telles que le mélange d'antibiotiques et d'antifongiques, le nouveau milieu de privation adapté à l'amibe, et l'utilisation de la cytométrie en flux pour une détection plus rapide et plus sensible de la lyse. Après avoir prélevé des échantillons d'eau polluée conformément au protocole décrit, préparez la cellule hôte, V. vermiformis, en ajoutant les amibes à un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés contenant 30 millilitres de milieu de protéase, peptone, extrait de levure et glucose, ou milieu PYG, puis incubez à 28 degrés Celsius pendant 48 heures. Utilisez des lamelles de comptage pour dénombrer les amibes et, lorsque leur concentration atteint cinq fois 10 à la puissance 5 à 10 à la puissance 6 cellules par millilitre, récoltez les cellules par centrifugation à 720 ×g pendant 10 minutes.

Aspirez le surnageant et utilisez 30 millilitres de solution saline amoebienne stérile de Page, ou PAS, pour resuspendre le culot d'amoebes. Après un deuxième rinçage du culot, utilisez 30 millilitres de milieu de privation, contenant un antibiotique et un antifongique, pour resuspendre les cellules à environ 106 amoebes par millilitre. Le milieu de privation permet aux amoebes de rester vivantes sans kystisation ni multiplication.

Ensuite, ensemencer 200 microlitres d'amibes dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond plat et incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis, après avoir vortexé les échantillons d'eau pendant une minute à température ambiante, inoculer 25 microlitres de chaque échantillon sur les cellules amibiennes, en laissant deux puits sans échantillon comme témoins négatifs. Pour éviter l'évaporation, placer la plaque contenant la primo-culture dans un sachet avec une compresse humide, puis mettre la chambre humidifiée contenant la plaque dans un incubateur à 30 degrés Celsius.

Trois jours après la première inoculation, réalisez une sous-culture de la plaque de primo-culture sur une nouvelle plaque de 96 puits contenant des amibes, comme vient d'être démontré, sans observation microscopique. Incubez à 30 degrés Celsius pendant trois jours. Ensuite, à l’aide de la sous-culture, inoculez une troisième plaque comme décrit précédemment, et incubez pendant deux jours.

Pour détecter la lyse dans la plaque finale de co-culture, allumez le cytomètre et effectuez un cycle de nettoyage et de rinçage conformément au protocole du fabricant afin de réduire le bruit de fond. Pour réaliser une acquisition entièrement automatisée de 40 minutes, lancez l'échantillonneur à haut débit (HTS) afin de charger automatiquement les échantillons à partir de la plaque 96 puits selon le protocole du fabricant. Programmez les paramètres HTS comme indiqués ici : un volume d'échantillon de 150 µL, un volume de mélange de 50 µL, une vitesse de mélange de 180, un nombre de mélanges égal à 5, un volume de lavage entre les échantillons de 400 µL, un débit de 2,5 µL par seconde, et un nombre d'événements enregistrés fixé à 10 000. Cliquez sur « home » pour permettre à l'HTS de repérer ou localiser la plaque. Ensuite, analysez d'abord les puits du témoin négatif contenant les cellules d'amibes hôtes afin de délimiter la population d'amibes et de déterminer le pourcentage cellulaire selon leurs caractéristiques physiques. Assurez-vous de disposer d'une population d'amibes homogène et d'une seconde population d'événements plus faibles correspondant aux débris et au bruit. Puis, commencez le gating en cliquant sur « acquire sample ».

Ensuite, à l’aide de la flèche qui définit les fenêtres, localisez la population d’amibes d’intérêt. Après avoir sélectionné au moins 10 000 événements, cliquez sur « exécuter » pour permettre au système HTS de parcourir automatiquement toute la plaque. Effectuez l’acquisition et l’analyse des données selon le paramètre de taille (diffusion avant) et le paramètre de structure (diffusion latérale). Reportez-vous au texte pour plus de détails.

Après la détection de la lyse par cytométrie en flux, pipetez les co-cultures lysées afin de mettre en suspension les amibes restantes. Après avoir déposé 50 microlitres de chaque échantillon sur des lamelles, cytocentrifugez directement la suspension à 800 ×g pendant 10 minutes.

Ensuite, utilisez du méthanol pur pour fixer les lames, puis laissez les lames sécher à température ambiante. Après la fixation, plongez les lames trois fois dans la solution ESN pendant quatre secondes chacune, avant de les placer dans l'azur bleu pendant six secondes. Enfin, plongez les lames dans le PBS pendant 45 secondes.

Laisser sécher les lames à température ambiante avant de passer à l'observation. Pour colorer de nouvelles lames fixées avec du DAPI, pipeter 15 microlitres de DAPI sur les lames sèches. Observer les lames au microscope optique avec un grossissement de 1000x afin de vérifier la présence de usines à virus.

Pour réaliser une microscopie électronique, déposez cinq microlitres de l'échantillon positif sur une grille préalablement soumise à un traitement au plasma, puis incubez à température ambiante pendant environ 20 minutes. Séchez délicatement la grille, ajoutez une petite quantité de molybdate d'ammonium à 1 % et incubez pendant 10 secondes. Après avoir soigneusement retiré la goutte, laissez sécher la grille pendant cinq minutes. Ensuite, réglez le microscope électronique sur 200 kiloélectrons-volts. Placez ensuite la grille sur le porte-objet et insérez le porte-objet dans le microscope. Cliquez sur l'icône de synthèse du vide et vérifiez l'état du vide. Fermez ensuite les vannes, réglez une taille de spot de cinq et un grossissement de 25 000 avant de commencer l'observation. Après avoir localisé un virus géant sur l'écran d'acquisition, utilisez l'outil de mesure pour mesurer le virus.

Réaliser la biologie moléculaire et le séquençage du génome viral conformément au protocole décrit dans le texte.

Cette figure présente les résultats de la détection de deux Faustovirus par rapport aux contrôles négatifs fiables. Le témoin négatif pour la lyse contenait une population d'amibes à 86 %. En revanche, plus de 60 % des amibes ont été lysées, avec le pourcentage le plus élevé de débris dans les échantillons positifs.

Comme on le voit ici, la coloration par ESN et bleu d'azur marque les noyaux des cellules d'amibes non infectées et infectées, ainsi que la présence d'usines virales à l'intérieur des cellules infectées. La coloration par DAPI confirme également la présence d'usines virales dans les amibes. Sur ces images, la microscopie électronique révèle la présence de Faustovirus présentant l'aspect typique d'un mégavirus composé d'une capside icosaédrique dépourvue de fibrilles et d'une taille de 200 nanomètres.

Une fois maîtrisée et après la co-culture, cette technique de détection de la lyse et de caractérisation du virus peut être réalisée en une heure, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à contrôler la viabilité des amibes et de vérifier toute contamination éventuelle. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la biologie moléculaire ciblant les virus géants, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la famille virale ou le génotype.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie pour explorer cette famille virale, leur hôte spécifique et leur pathogénicité potentielle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler facilement les virus géants en élargissant le nombre et les types d'échantillons et en choisissant la meilleure cellule hôte ainsi que les meilleures conditions de culture. N'oubliez pas que travailler avec des virus potentiellement pathogènes pour l'homme peut être extrêmement dangereux, particulièrement avec des échantillons d'eaux usées.

Ainsi, des précautions telles que travailler dans des laboratoires de niveau de sécurité 2 (SB2) avec des conditions sécurisées doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.