Name: Une stratégie rapide pour lisolement des nouveaux Faustoviruses déchantillons environnementaux Utilisation vermiformis Vermamoeba (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez une stratégie d'isolement rapide des Faustovirus à partir d'échantillons environnementaux en utilisant Vermamoeba vermiformis. Cette méthode améliore la détection de lyse virale par floss-cytométrie pour la virologie.

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Collection 1. Sample <ol><li> Recueillir 70 échantillons provenant de différents milieux et régions. Dans ce cas, utilisez les suivants: 5 échantillons d&#39;eau sale du village de Saint Pierre de Meyzoargues (France), 15 échantillons du lac dans le Parc Borély à Marseille (France); 15 échantillons d&#39;eau de mer avec les sédiments des calanques à Samena à Marseille (France), 25 échantillons d&#39;eau de la rivière des Alpes (France), et enfin, 10 échantillons provenant des eaux usées à La Ciotat (France). </li><li> échantillons Vortex pour l&#39;homogénéisation avant inoculant, pendant une minute à la température ambiante sans aucun traitement. </li></ol> 2. Procédé d&#39;isolation <ol><li> Hôte Préparation pour les procédures aveugles Culture et Inoculation Sample <ol><li> Utilisez V. vermiformis (souche CDC19) en tant que support de cellules pour la co-culture. </li><li> Maintenir les amibes à 28 ° C, dans une cellule de 75 cm2 flacon de culture avec 30 ml de protease peptone-extrait de levure milieu glucose (PYG). S&#39;il vous plaît vérifier la composition PYG dans le tableau 1. Remarque: Après 48 heures, les amibes sont quantifiés par un comptage en utilisant des diapositives normales de comptage (par exemple, Kovaslides). </li><li> Récolte des cellules à une concentration de 5 x 10 5 à 10 6 cellules / ml, et on pastille amibes par centrifugation à 720 g pendant 10 min. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration, et remettre en suspension le culot amibes dans 30 ml de solution saline stérile amibienne de la page (PAS) Tableau 1. Répétez cette procédure de rinçage. </li><li> Resuspendre les amibes dans 30 ml de milieu de privation avec un mélange d&#39; antibiotiques et d&#39; antifongiques à une concentration d&#39;environ 10 6 amibes / ml. Le milieu de la faim est un moyen de survie pour l&#39;amibe, ce qui lui permet de rester en vie sans enkystement ou multiplication. Vérifier la composition dans le tableau 1. Remarque: Le mélange d&#39;agent antimicrobien contenant 10 pg / ml de vancomycine, 10 pg / ml imipénème, 20 pg / ml ciprofloxacine, 20 μg / ml de doxycycline et 20 pg / ml voriconazole. Cette combinaison a permis de réduire la contamination bactérienne et fongique qui peut diminuer ou modifier la multiplication virale. </li><li> inoculer directement 25 pi de chaque échantillon sur la 200 pi amibe monocouche dans un fond plat plaque de 96 puits favorisant l&#39;adhérence des amibes et incuber à 30 ° C dans un environnement humide (un environnement humide consiste à placer une compresse humide à l&#39;intérieur du sac contenant la la plaque afin d&#39;éviter l&#39;évaporation). Ceci est la primo-culture. Laissez deux puits d&#39;amibes sans échantillon inoculation; celle-ci agit en tant que témoin négatif. Incuber cette primo-culture pendant trois jours. </li><li> Trois jours après la première inoculation, sous-culture de la plaque primo- culture sur amibes frais comme décrit ci-dessus, sans aucune observation microscopique. Incuber la nouvelle plaque pendant trois jours dans les mêmes conditions que la primo-culture. </li><li> Effectuer la culture finale après ces trois jours d&#39;incubation de la même manière que pour ee primo- et sous-culture. Incuber la culture finale pendant deux jours. Ensuite, passez à la détection. </li></ol></li><li> Détection de Lysis par cytométrie de flux automatisé Remarque: la culture aveugle couplé avec le flux diffère cytométrie du système standard précédent de l&#39;isolement. Il est plus sensible, précise et automatisée. Pour des fins de détection, nous avons appliqué une nouvelle technique développée pour détecter la lyse à la vitesse maximale et sans l&#39;observation microscopique. Cette technique est avantageuse pour les échantillons de dépistage et a une meilleure sensibilité que les techniques anciennes. 7-9 <ol><li> Utiliser la plaque à 96 puits de la co-culture finale de détecter la lyse. </li><li> Allumez le cytomètre et exécuter un cycle de nettoyage et de rinçage afin d&#39;obtenir un bruit de fond plus faible selon le protocole du fabricant. </li><li> Lancez le High Throughput Sampler (HTS) combinée avec cytométrie de flux pour charger automatiquement des échantillons de la plaque de 96 puits et de procéder à une acquisition entièrement automatisée à moins de 40 min according au protocole du fabricant. </li><li> Mettre en place les HTS comme suit: volume d&#39;échantillon de 150 pi, le volume de mélange 50 ul, vitesse 180, nombre de mélanges 5 de mélange, le volume de lavage entre chaque échantillon de 400 pi, débit de 2,5 pl / s, nombre d&#39;événements enregistrés 10.000. </li><li> Évaluer les puits de contrôle négatif de la co-culture de micro-plaque finale en premier afin de porte la population amibes et de déterminer le pourcentage de ces cellules hôtes en fonction de leurs caractéristiques physiques. Soyez sûr d&#39;avoir une population amibe homogène et une seconde population d&#39;une baisse des événements correspondant à des débris et du bruit. Remarque: Cette procédure de déclenchement distingue les débris et les amas subcellulaire de cellules individuelles par taille, estimés par diffusion vers l&#39;avant. Il est donc important de déterminer avec précision le pourcentage de chaque population utilisant la meilleure procédure de transmission sélective possible. Ces pourcentages peuvent varier, en particulier si de nombreux types de protozoaires sont utilisés, il est donc important de toujours avoir un negativcontrôle électronique, qui peut être utilisé en tant que la population de référence pour le reste des échantillons. </li><li> Démarrez le déclenchement en cliquant échantillon acquérir. </li><li> Notez le nombre d&#39;événements non moins de 10.000 événements. </li><li> Localisez la population amibe d&#39;intérêt en utilisant la flèche. Voici comment définir les portes. </li><li> Après déclenchement, laissez la tache HTS ou de localiser la plaque en cliquant sur &#39;Home&#39;, puis exécutez la plaque entière automatiquement. Effectuer l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données en fonction de la taille et de la structure des paramètres (respectivement, FSC (de diffusion vers l&#39;avant) et SSC (diffusion latérale)). Remarque: La détection de la perte de la population amibe fermée signale la présence d&#39;un agent pathogène responsable de la amibe lyse. la lyse des protozoaires associée à une infection virale est détectée avec un seuil arbitrairement conçu de 50% de lyse de la population ayant une amibe fermée par l&#39;analyseur et par rapport à la population non infectée utilisé comme témoin négatif fiable. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Caractérisation des nouveaux isolats après détection Lysis <ol><li> Coloration préliminaire pour révéler la présence des virus géants <ol><li> Après la détection de la lyse par cytométrie de flux, Pipette les co-cultures lysées pour suspendre les amibes restants. Ensuite cytocentrifugeuse directement 50 pi de la suspension à 800 g pendant 10 min. </li><li> Après centrifugation, fixer les lames avec une solution de méthanol pur. Colorer les lames en utilisant une coloration rapide commerciale de éosine / bleu Azur et coloration DAPI et observer sous un microscope optique à un grossissement 1,000X afin de vérifier la présence d&#39;usines de virus. <ol><li> Pour une coloration rapide, plonger les lames dans la première solution de l&#39;éosine (4 sec répété trois fois), puis passer directement à plonger les lames dans la seconde solution de fixation contenant du bleu Azur pour 6 sec, et enfin rincer les diapositives de 45 secondes avec une solution de tampon phosphate pH 7,2. Laissez les lames sécher à la température ambiante, puis passez à observatisur. </li><li> Pour la coloration DAPI, le dépôt de 15 pi de la solution de stock commercial DAPI sur la lame sèche fixe. Protéger de la lumière, puis procéder à l&#39;observation. </li></ol></li></ol></li><li> Microscopie électronique <ol><li> Après la première identification sur les glissières, d&#39;évaluer la présence du virus géant à travers l&#39;observation en microscopie électronique des cultures de surnageant. </li><li> Dépôt de 5 pi de l&#39;échantillon positif sur la grille de lueur déchargée. Attendez environ 20 min à température ambiante. </li><li> Sécher soigneusement la grille et le dépôt sur une petite baisse de 1% de molybdate d&#39;ammonium pendant 10 secondes. Laissez la grille sécher pendant 5 min. </li><li> Passez à la microscopie électronique à 200 keV. </li><li> Placer la grille sur le support; introduire le support dans le microscope. Vérifiez la liste de vide en cliquant sur l&#39;icône correspondante. Fermer les vannes et commencent l&#39;observation à une taille du point 5, et un grossissement de x 25 000. </li><li> Mesurer le virus géant en utilisant ImageJ ou directementment sur le microscope à l&#39;aide de l&#39;outil de mesure du microscope située à l&#39;écran d&#39;acquisition. Remarque: Classifier l&#39;échantillon dans le groupe Faustovirus avec une taille de capside d&#39;environ 200 nm. </li></ol></li><li> Biologie moléculaire Remarque: Après cette identification, les tests de biologie moléculaire ont été cruciales pour la confirmation afin de distinguer Faustovirus de Marseillevirus, qui a la même taille de la capside et l&#39;apparence en microscopie électronique, bien qu&#39;ils ne possèdent pas la même spécificité d&#39;hôte. Le Marseillevirus ne peut pas se développer sur Vermamoeba le Faustovirus est spécifique à Vermamoeba et toutes les tentatives de se développer sur d&#39; autres amibes tels que Acanthamoeba ont échoué à ce jour. La conception et l&#39; application des systèmes d&#39; amorce / sonde spécifiques énumérées dans les œuvres de Reteno et al. a permis une classification préliminaire plus précise des virus nouvellement isolés par amplification et le séquençage des gènes viraux. <ol><li> ExADN des voies à partir des échantillons de culture positifs en utilisant un système automatisé d&#39;extraction selon le protocole du fabricant. </li><li> Effectuez-PCR en temps réel en utilisant un thermocycleur comme décrit dans Reteno et al. 19 </li><li> Séquence en utilisant les mêmes amorces qui ont été utilisées pour l&#39;amplification. Utilisez les amorces ciblant l&#39;ARN polymérase sous-unité ADN-1 gène: Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 &#39;(avant) et-TTG de CAC CTC CGC Fstv_S2R AGT TAA A-3&#39; (inverse) avec la sonde Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA. </li></ol></li></ol> 4. Virus Production, Purification et séquençage du génome <ol><li> Repiquer la culture unique amibe virus pour point final clonage par dilution. </li><li> Pour la production: 20 préparer des flacons contenant 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba et 5 ml du virus isolé déjà transféré dans des puits à petits flacons. </li><li> Incuber à 30 ° C jusqu&#39;à achèvementlyse de l&#39;amibe. Observez tous les jours par microscopie optique inversée jusqu&#39;à ce que tous les amibes sont lysées. </li><li> Après la lyse complète, la piscine tous les flacons en un seul destinataire. Filtrer avec un filtre de 0,45 um pour éliminer les débris. </li><li> Commencez la purification par ultracentrifugation à 89.800 xg pendant 75 min. Assurez-vous de calibrer le poids des tubes avant de commencer la centrifugation. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant de chaque tube par aspiration et remettre en suspension le culot dans le PAS avec le même volume utilisé pour le calibrage, avant la répétition de la centrifugation. </li><li> Comme ci-dessus, éliminer le surnageant et remettre en suspension les culots dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> On purifie le virus qui est produit en utilisant 25% de saccharose (27,5 g de saccharose dans 100 ml de PBS, filtré sur un filtre de 0,22 um). <ol><li> Utiliser 8 ml de saccharose et de 2 ml de la suspension virale. Centrifuger à 89800 xg pendant 1 h 15 min. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS. Conserver à -80 ° C. </li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La possibilité que Faustovirus pourrait être le premier membre d&#39;une nouvelle famille Megavirales près de ASFV a d&#39; abord été suggérée par Reteno et al., 19 mais certaines différences peuvent encore se distinguer. Il semble difficile de savoir si Faustovirus devrait se joindre à la famille Asfarviridae ou si elle devrait plutôt former une nouvelle famille virale putative. Cette question nécessitera une enquête plus approfondie, notamment une caractérisation plus complète de sa morphologie, la...

La découverte des virus géants, en particulier ceux appartenant à l&#39;ordre Megavirales, a complètement changé le monde des virus en termes de taille des particules et de la complexité du génome. Les virus ont déjà été pensés pour être de petites entités, et l&#39;Mimivirus semblaient briser toutes les règles. 1 données métagénomique suggère l&#39;omniprésence des virus géants , non seulement dans l&#39;environnement, 2-5 , mais aussi chez l&#39; homme. 6 Par conséquent, il est encore nécessaire à la recherche de ces virus à grande échelle. La diversité de ces virus géants a été évaluée par échantillonnage non seulement une variété de milieux aquatiques et leurs sédiments associés dans le monde entier, 7-11 , mais aussi par criblage d&#39; une variété d&#39;échantillons humains 12,13 et les échantillons environnementaux. 7,9 Les mimivirus de polyphaga Acanthamoeba était isolé par co-culture en utilisant protistes phagocytaires, principalement Acanthamoeba spp. 14-16 toute une collection de virus géants étaient alors aussiisolé à partir de cet hôte de protistes spécifié, ce qui a rendu la communauté scientifique restreindre sa recherche et l&#39; isolement procédure de Acanthamoeba spp. Il est clair que cette dépendance sur une seule espèce d&#39;accueil a donné lieu à une grande partie des virus étant négligée. Le fait que le virus géant, CroV, a été isolé avec le très motiles marine protozoaires cafeteria roenbergensis, 17,18 démontre la nécessité d&#39;utiliser une plus large gamme de protozoaires afin de découvrir de nouvelles lignées ou familles de virus géants. Reteno et al. A réussi à choisir d&#39; autres protozoaires comme des cellules hôtes qui n&#39;a jamais été utilisé auparavant, et isolé la nouvelle lignée Asfar liée des virus géants (le Faustovirus nouvellement nommé). 19 Dans une tentative d&#39;isoler de nouveaux génotypes Faustovirus afin d&#39;élargir les membres de cette lignée virale, nous avons modifié nos procédures d&#39;isolement et les ont utilisés pour dépister les échantillons environnementaux capables de récolter de nouvelles Faustoviruses. Nous avons ensuitedécrit l&#39;ensemble du protocole pour caractériser les nouveaux isolats. Nous avons évalué vermiformis Vermamoeba, le protistes vivant en liberté le plus répandu dans les environnements humains, 20-22 , qui est déjà utilisé dans l&#39;isolement du premier prototype Faustovirus E12. 19 Cette protist actuellement encore l&#39; hôte spécifique pour Faustovirus. Nous savions que aucun des virus géants connus était pathogène pour cette amibe, car aucune tentative de se développer d&#39;autres virus géants dans notre laboratoire a montré une lyse amibe ou la croissance virale. Pour cette raison, nous croyons que V. vermiformis est le meilleur et le plus unique support cellulaire connue pour isoler de nouveaux Faustoviruses.

<table><tbody><tr><td>Cytomètre LSR FORTESSA&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>France&nbsp ;</td><td>Référence 649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Allemagne&nbsp ;</td><td>Référence 5027/11</td></tr><tr><td>Microscope optique inversé</td><td>leica&nbsp ;</td><td>France</td><td>72643</td></tr><tr><td>Extraction d’ADN</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL Robot</td><td>France&nbsp ;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>France</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>Milieu PYG, PAS, Milieu de famine</td><td>Production en laboratoire interne&nbsp ;</td><td>Marseille URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amoeba souche CDC-19</td><td>ATCC</td><td>France</td><td>50237</td></tr><tr><td>Plaques</td><td>Cellstar</td><td>France</td><td>655180</td></tr><tr><td>Matériaux PCR, amorces.&nbsp ;</td><td>eurogentec</td><td>France</td><td>Abécédaires cités dans le manuscrit</td></tr><tr><td>diapositive en verre 10 avec grilles</td><td>Kova&nbsp ;</td><td>USA</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>Teinture Eosin/bleu Azur-Hemacolor</td><td>Merck milipore&nbsp ;</td><td>France</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Filtres à vide</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Thermo Fisher scientific&nbsp ;</td><td>France&nbsp ;</td><td>Référence 10010-023</td></tr><tr><td>Teinture DAPI</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>France&nbsp ;</td><td>D1306</td></tr><tr><td>cytospin 4 cytocentrifugeuse</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>France</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Tunnel de cytologie unique</td><td>Biomedical polymers inc.</td><td>France</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Grilles carbone&nbsp ;</td><td>Euromedex</td><td>France&nbsp ;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Molibdate d’ammonium</td><td>VWR international&nbsp ;</td><td>France&nbsp ;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Flacons&nbsp ;</td><td>SARSTEDT</td><td>Allemagne</td><td>833911</td></tr><tr><td>0,22 &mu ; Filtres M&nbsp ;</td><td>Milex millipor ;</td><td>France</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Filtres à débit rapide</td><td>Nalgene</td><td>France</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux utilisation<em&gt; vermiformis vermamoeba</em

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

L&#39;isolement des virus géants est d&#39;un grand intérêt dans cette nouvelle ère de la virologie, d&#39;autant plus que ces virus géants sont liés à des protistes. virus géants peuvent être potentiellement pathogènes pour de nombreuses espèces de protistes. Ils appartiennent à l&#39;ordre des Megavirales récemment décrit. La nouvelle lignée Faustovirus qui a été isolé à partir d&#39;échantillons d&#39;eaux usées est lointainement apparenté au virus de la peste porcine africaine de l&#39;agent pathogène de mammifère. Ce virus est également spécifique à son hôte amibienne, vermiformis Vermamoeba, un protiste commun dans les systèmes d&#39;eau de soins de santé. Il est crucial de continuer à isoler de nouveaux génotypes Faustovirus afin d&#39;élargir sa collection de génotype et étudier son pan-génome. Nous avons développé de nouvelles stratégies pour l&#39;isolement de souches supplémentaires en améliorant l&#39;utilisation de combinaisons d&#39;antibiotiques et antifongiques, afin d&#39;éviter les contaminations bactériennes et fongiques de la co-culture de l&#39;amibe et de favoriser la multiplication du virus. Nous avons également mis en place un nouveau starvation moyen pour maintenir V. vermiformis dans des conditions optimales pour les virus co-culture. Enfin, nous avons utilisé la cytométrie en flux, plutôt que l&#39;observation au microscope, ce qui prend du temps, afin de détecter l&#39;effet cytopathogène. Nous avons obtenu deux isolats provenant d&#39;échantillons d&#39;eaux usées, ce qui prouve l&#39;efficacité de cette méthode et élargissant ainsi la collection de Faustoviruses, afin de mieux comprendre leur environnement, la spécificité d&#39;hôte et le contenu génétique.

Le système étudié dans ce manuscrit validé sa preuve de concept en isolant deux nouveaux Faustoviruses. Sur les 70 échantillons testés, deux épisodes de lyse ont été détectés, contrairement à nos contrôles négatifs fiables. Le contrôle négatif pour la lyse contenait une population amibe de 86%. En revanche, les échantillons positifs (ST1 pour Saint Pierre de Meyzoargues), et (LC9 pour l&#39;échantillon La Ciotat 9) ont montré une baisse spectaculaire des amibes fermée; plus de 60% des am...

Nous décrivons ici les dernières avancées en matière d’isolement viral pour la caractérisation de nouveaux génotypes de Faustovirus, une nouvelle lignée de virus géants apparentée à l’asfarvirus. Ce protocole peut être appliqué à l’isolement à haut débit de virus, en particulier de virus géants infectant les amibes.

Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Le but général de cette nouvelle stratégie d'isolement est d'élargir le nombre de nouveaux isolats viraux afin d'étudier le pangénome de cette nouvelle famille virale, et de mieux comprendre leurs écosystèmes ainsi que leur pathogénicité potentielle pour l'humain. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, en aidant les virologues du monde entier intéressés par la prospection des virus géants, et des Faustovirus en particulier. Le principal avantage de cette technique réside dans les nouvelles améliorations apportées à plusieurs étapes, telles que le mélange d'antibiotiques et d'antifongiques, le nouveau milieu de privation adapté à l'amibe, et l'utilisation de la cytométrie en flux pour une détection plus rapide et plus sensible de la lyse. Après avoir prélevé des échantillons d'eau polluée conformément au protocole décrit, préparez la cellule hôte, V. vermiformis, en ajoutant les amibes à un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés contenant 30 millilitres de milieu de protéase, peptone, extrait de levure et glucose, ou milieu PYG, puis incubez à 28 degrés Celsius pendant 48 heures. Utilisez des lamelles de comptage pour dénombrer les amibes et, lorsque leur concentration atteint cinq fois 10 à la puissance 5 à 10 à la puissance 6 cellules par millilitre, récoltez les cellules par centrifugation à 720 ×g pendant 10 minutes.Aspirez le surnageant et utilisez 30 millilitres de solution saline amoebienne stérile de Page, ou PAS, pour resuspendre le culot d'amoebes. Après un deuxième rinçage du culot, utilisez 30 millilitres de milieu de privation, contenant un antibiotique et un antifongique, pour resuspendre les cellules à environ 106 amoebes par millilitre. Le milieu de privation permet aux amoebes de rester vivantes sans kystisation ni multiplication.Ensuite, ensemencer 200 microlitres d'amibes dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond plat et incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis, après avoir vortexé les échantillons d'eau pendant une minute à température ambiante, inoculer 25 microlitres de chaque échantillon sur les cellules amibiennes, en laissant deux puits sans échantillon comme témoins négatifs. Pour éviter l'évaporation, placer la plaque contenant la primo-culture dans un sachet avec une compresse humide, puis mettre la chambre humidifiée contenant la plaque dans un incubateur à 30 degrés Celsius.Trois jours après la première inoculation, réalisez une sous-culture de la plaque de primo-culture sur une nouvelle plaque de 96 puits contenant des amibes, comme vient d'être démontré, sans observation microscopique. Incubez à 30 degrés Celsius pendant trois jours. Ensuite, à l’aide de la sous-culture, inoculez une troisième plaque comme décrit précédemment, et incubez pendant deux jours.Pour détecter la lyse dans la plaque finale de co-culture, allumez le cytomètre et effectuez un cycle de nettoyage et de rinçage conformément au protocole du fabricant afin de réduire le bruit de fond. Pour réaliser une acquisition entièrement automatisée de 40 minutes, lancez l'échantillonneur à haut débit (HTS) afin de charger automatiquement les échantillons à partir de la plaque 96 puits selon le protocole du fabricant. Programmez les paramètres HTS comme indiqués ici : un volume d'échantillon de 150 µL, un volume de mélange de 50 µL, une vitesse de mélange de 180, un nombre de mélanges égal à 5, un volume de lavage entre les échantillons de 400 µL, un débit de 2,5 µL par seconde, et un nombre d'événements enregistrés fixé à 10 000. Cliquez sur « home » pour permettre à l'HTS de repérer ou localiser la plaque. Ensuite, analysez d'abord les puits du témoin négatif contenant les cellules d'amibes hôtes afin de délimiter la population d'amibes et de déterminer le pourcentage cellulaire selon leurs caractéristiques physiques. Assurez-vous de disposer d'une population d'amibes homogène et d'une seconde population d'événements plus faibles correspondant aux débris et au bruit. Puis, commencez le gating en cliquant sur « acquire sample ».Ensuite, à l’aide de la flèche qui définit les fenêtres, localisez la population d’amibes d’intérêt. Après avoir sélectionné au moins 10 000 événements, cliquez sur « exécuter » pour permettre au système HTS de parcourir automatiquement toute la plaque. Effectuez l’acquisition et l’analyse des données selon le paramètre de taille (diffusion avant) et le paramètre de structure (diffusion latérale). Reportez-vous au texte pour plus de détails. Après la détection de la lyse par cytométrie en flux, pipetez les co-cultures lysées afin de mettre en suspension les amibes restantes. Après avoir déposé 50 microlitres de chaque échantillon sur des lamelles, cytocentrifugez directement la suspension à 800 ×g pendant 10 minutes.Ensuite, utilisez du méthanol pur pour fixer les lames, puis laissez les lames sécher à température ambiante. Après la fixation, plongez les lames trois fois dans la solution ESN pendant quatre secondes chacune, avant de les placer dans l'azur bleu pendant six secondes. Enfin, plongez les lames dans le PBS pendant 45 secondes.Laisser sécher les lames à température ambiante avant de passer à l'observation. Pour colorer de nouvelles lames fixées avec du DAPI, pipeter 15 microlitres de DAPI sur les lames sèches. Observer les lames au microscope optique avec un grossissement de 1000x afin de vérifier la présence de usines à virus.Pour réaliser une microscopie électronique, déposez cinq microlitres de l'échantillon positif sur une grille préalablement soumise à un traitement au plasma, puis incubez à température ambiante pendant environ 20 minutes. Séchez délicatement la grille, ajoutez une petite quantité de molybdate d'ammonium à 1 % et incubez pendant 10 secondes. Après avoir soigneusement retiré la goutte, laissez sécher la grille pendant cinq minutes. Ensuite, réglez le microscope électronique sur 200 kiloélectrons-volts. Placez ensuite la grille sur le porte-objet et insérez le porte-objet dans le microscope. Cliquez sur l'icône de synthèse du vide et vérifiez l'état du vide. Fermez ensuite les vannes, réglez une taille de spot de cinq et un grossissement de 25 000 avant de commencer l'observation. Après avoir localisé un virus géant sur l'écran d'acquisition, utilisez l'outil de mesure pour mesurer le virus. Réaliser la biologie moléculaire et le séquençage du génome viral conformément au protocole décrit dans le texte.Cette figure présente les résultats de la détection de deux Faustovirus par rapport aux contrôles négatifs fiables. Le témoin négatif pour la lyse contenait une population d'amibes à 86 %. En revanche, plus de 60 % des amibes ont été lysées, avec le pourcentage le plus élevé de débris dans les échantillons positifs.Comme on le voit ici, la coloration par ESN et bleu d'azur marque les noyaux des cellules d'amibes non infectées et infectées, ainsi que la présence d'usines virales à l'intérieur des cellules infectées. La coloration par DAPI confirme également la présence d'usines virales dans les amibes. Sur ces images, la microscopie électronique révèle la présence de Faustovirus présentant l'aspect typique d'un mégavirus composé d'une capside icosaédrique dépourvue de fibrilles et d'une taille de 200 nanomètres.Une fois maîtrisée et après la co-culture, cette technique de détection de la lyse et de caractérisation du virus peut être réalisée en une heure, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à contrôler la viabilité des amibes et de vérifier toute contamination éventuelle. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la biologie moléculaire ciblant les virus géants, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la famille virale ou le génotype.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie pour explorer cette famille virale, leur hôte spécifique et leur pathogénicité potentielle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler facilement les virus géants en élargissant le nombre et les types d'échantillons et en choisissant la meilleure cellule hôte ainsi que les meilleures conditions de culture. N'oubliez pas que travailler avec des virus potentiellement pathogènes pour l'homme peut être extrêmement dangereux, particulièrement avec des échantillons d'eaux usées.Ainsi, des précautions telles que travailler dans des laboratoires de niveau de sécurité 2 (SB2) avec des conditions sécurisées doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

L'étude décrit une méthode rentable pour l'identification de la source de contamination fécale / urinaire ou de la contamination par les nitrates dans l'eau en utilisant qPCR pour la quantification spécifique du virus de l'ADN humain / porcin / bovin, les adénovirus et les polyomavirus, a proposé que les outils MST.

Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

La méthode EPA 1615 utilise un filtre électropositif pour concentrer les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables. Ce manuscrit décrit la procédure de collecte d’échantillons pour les analyses de la méthode 1615.

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

Nous présentons ici une procédure pour mesurer le nombre total de virus cultivables à l’aide de la lignée cellulaire rénale du singe vert de buffle. La procédure fournit un outil normalisé pour mesurer la présence de virus infectieux dans l’environnement et les eaux potables.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans l&#39;eau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay

Nous présentons ici une procédure de quantification des entérovirus et des norovirus dans les eaux environnementales et potables à l’aide de la transcription inverse-PCR quantitative. Le taux moyen de récupération du virus dans les eaux souterraines avec cette procédure normalisée de la méthode 1615 de l’EPA était de 20 % pour le poliovirus et de 30 % pour le norovirus murin.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR

Nous présentons ici VirWaTest, qui est une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.

VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.

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Ce protocole décrit une méthode pour extraire efficacement les nématodes vivants des substrats naturels sur le terrain.

Isolement rapide des nématodes sauvages par Baermann Funnel

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La concentration de virus à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées dans l’environnement est une tâche difficile, effectuée principalement pour l’identification et la quantification des virus. Bien que plusieurs méthodes de concentration virale aient été développées et testées, nous démontrons ici l’efficacité de l’ultrafiltration et de la floculation du lait écrémé pour les virus à ARN avec différents types d’échantillons.

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Nous décrivons ici des méthodes d’échantillonnage dans les zones euphotiques des écosystèmes marins et d’eau douce pour isoler les cyanophages (et leurs hôtes) et des processus de post-échantillonnage qui enrichissent les génotypes uniques et caractérisent la dynamique d’interaction virus-hôte.

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Une stratégie rapide pour lisolement des nouveaux Faustoviruses déchantillons environnementaux Utilisation vermiformis Vermamoeba (Vidéo) | JoVE Journal

Une stratégie rapide pour l'isolement des nouveaux Faustoviruses d'échantillons environnementaux Utilisation

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