Name: Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez la livraison de siRNA thérapeutique au cerveau en utilisant des liposomes cationiques et anioniques avec peptides neuro-ciblants. Cette méthode permet le transport intraveineux à travers la barrière hémato-encéphalique pour traiter les maladies neurodégénératives.

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Nous tenons à remercier les sources de financement suivantes : le programme de formation en recherche translationnelle sur les maladies infectieuses de la CSU (ID :TRTP) et le programme de subventions de recherche des NIH (R01 NS075214-01A1). Nous tenons à remercier le laboratoire Telling pour l’utilisation de son anticorps monoclonal PRC5. Nous tenons également à remercier le laboratoire Dow pour les liposomes DOTAP et pour le partage de leur expertise dans la génération de liposomes.

Toutes les souris ont été élevées et maintenues au laboratoire des ressources animales, agréés par l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des animaux de laboratoire Care International, conformément aux protocoles approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux à l&#39;Université d&#39;État du Colorado. 1. Préparation de LSPCs <ol><li> En utilisant un mélange 1: 1 DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane): Taux de cholestérol pour LSPCs. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2 nmoles de DOTAP et 2 nmoles de cholestérol dans 10 ml d&#39;un mélange 1: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme. </li><li> S&#39;évaporer 9 ml de chloroforme et une solution de methanol en utilisant du N2 gazeux sous une hotte aspirante. Evaporer les dernières 1 ml de solvant dans une hotte nuit sans gaz. Observer un mince film de lipide sur le fond du flacon. </li><li> Chauffer 10 ml d&#39;une solution de saccharose à 10% à 55 ° C. </li><li> Verser la solution de saccharose à 10% chauffé sur le film lipidique mince lentement, soit 1 ml / min, tandis que GEtourbillonnant ntly le ballon. Maintenir le saccharose à 10% et d&#39;un flacon avec les lipides à 55 ° C, de sorte que les molécules de lipides restent dans la phase gel-liquide. Résultats de réhydratation dans des vésicules (MLV) formation multilamellaire. </li><li> Laisser les lipides se réhydrater à 55 ° C pendant au moins une heure avant le dimensionnement des liposomes. </li><li> Assembler une extrudeuse selon les instructions du fabricant avec 1,0 um filtres ou utiliser des filtres de seringue 1,0 um pour le dimensionnement. </li><li> Ajouter 1 ml de la suspension de liposomes chauffé à une des seringues à l&#39;extrudeuse, et passer la suspension entre les deux seringues de 11 fois. Assurez-vous que la suspension est dans la seringue opposée à la seringue de départ après 11 passes. </li><li> Taille des liposomes à nouveau de 0,45 um puis 0,2 um filtres pour générer de grandes vésicules unilamellaires (LUV). Gardez la suspension de liposomes chauffé pour faciliter le dimensionnement. </li><li> Incuber 20 ul de 4 nmol suspension de liposomes (200 um) avec 200 ul d&#39;une 20 um (4totale nmol) de solution mère de siRNA pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Incuber 80 ul d&#39;un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r disponible avec la solution / liposome siRNA pendant 10 min à température ambiante. LSPCs doivent être utilisés le plus tôt possible, mais peuvent être utilisés jusqu&#39;à plusieurs heures après la préparation. LSPCs Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation. </li></ol> 2. Préparation de PALETS <ol><li> Utiliser un 55 ratio molaire 5 de l&#39;une ou l&#39;autre DSPE (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine): 40 cholestérol: DSPE-PEG ou de DOTAP: cholestérol: DSPE-PEG pour PALETS. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2,2 nmol de chacune DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de cholestérol, et 0,2 nmoles de DSPE-PEG dans 10 ml d&#39;un mélange 2: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme. </li><li> Préparer suspension de liposomes exactement comme décrit à l&#39;étape 1.1 et 1.2 ci-dessus. Réhydrater les liposomes DSPE dans 10 ml de 1 x PBS chauffé à 75 ° C, en ajoutant 1 ml / min. Laisser les lipides se réhydrater à 75 ° C pendant aumoins 1 h avant de dimensionner. </li><li> Taille de la suspension de liposomes exactement comme décrit à l&#39;étape 1,6-1,8. </li><li> Pipet 20 pi de chacune des 4 nmole (200 uM) suspensions de liposomes en aliquots à usage unique après DOTAP et DSPE liposomes ont été de taille, et lyophiliser pendant 30 minutes en utilisant un lyophilisateur de paillasse (Figure 2). </li><li> Incuber 200 pi d&#39;un 20 uM (4 au total nmole) stock solution siRNA avec 1,4 ul d&#39;une solution de 26,6 uM de sulfate de protamine pendant 10 min à température ambiante pendant siRNA qui doit être encapsulé dans des liposomes DSPE Palets. </li><li> Réhydrater les liposomes DOTAP Palets avec 200 pi d&#39;une solution à 4 actions nmole de siRNA ou réhydrater liposomes DSPE Palets avec 201,4 pi de la solution / protamine siRNA. Incuber la solution / ARNsi de liposomes pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;un 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), une solution 60 mM à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;une 150 mM de N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) solution à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE. </li><li> Incuber EDC et sulfo-NHS avec le / suspension de liposomes siRNA pendant 2 heures à la température ambiante. </li><li> Incuber 80 ul d&#39;un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r actions avec le siRNA / liposome solution pendant 10 min à température ambiante de réticulation. NOTE: L&#39;ECD / sulfo-NHS permet au RVG-9r pour lier de manière covalente aux lipides PEG. Utilisez PALETS au sein de plusieurs heures après la préparation. PALETS Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation. </li><li> Pour déterminer siRNA encapsulation efficacité de PALETS: <ol><li> Mesurer la concentration de l&#39;ARNsi avant et après l&#39;addition de protamine et des liposomes en utilisant un spectrophotomètre réglé à 260 nm. </li><li> Filtrer le ARNsi non encapsulée dans le liposome / encapsulée suspension ARNsi en utilisant des filtres centrifuges 50 kDa. Centrifuger à 1000 xg pendant 20 min. </li><li> Mesurer la concentration deARNsi non encapsulée dans le filtrat et la concentration de l&#39;ARNsi encapsulé dans le rétentat à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à 260 nm. </li></ol></li></ol> 3. Injecter Souris avec LSPCs ou PALETS <ol><li> Exposer les souris pendant 5 à 10 min à une lampe chauffante pour dilater le système vasculaire. </li><li> Anesthetize souris avec un 2-3% isofluorane / oxygène flux 5-10 min avant l&#39;injection, et pendant l&#39;injection. Confirmer anesthetization lorsque l&#39;animal est plus ambulant et la respiration ont ralenti en faisant une pincée d&#39;orteil. Placez la souris sur le dos ou sur le côté pour accéder à la veine de la queue. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement sous anesthésie. </li><li> Essuyez / pulvériser la queue avec 70% EtOH et injecter 300 pi de LSPCs ou PALETS sur la veine de la queue de la souris à l&#39;aide d&#39;une seringue à insuline G 26. Commencer à injecter distalement dans la veine de la queue et de se déplacer proximalement si la veine s&#39;effondre ou ruptures. </li><li> Placez la souris dans une cage propre jusqu&#39;à ce qu&#39;elle maintient décubitus sternale. Ne placez pas moutiliser avec d&#39;autres compagnons de cage jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait complètement récupéré. Les souris doivent récupérer en 5 à 15 min. Ils peuvent être placés sur un coussin chauffant ou sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps si la récupération prend plus de temps. Les souris doivent être étroitement surveillés pour se protéger contre la surchauffe. </li><li> Surveiller les animaux plusieurs heures après l&#39;injection pour assurer l&#39;anesthésie se dissipe, et il n&#39;y a pas de mauvais effets du traitement. Permettre aux LSPCs ou PALETS de circuler pendant au moins 24 heures. </li></ol> 4. Analyse de l&#39;expression des protéines par l&#39;intermédiaire de cytométrie en flux <ol><li> Euthanasier souris avec un débit de 20% de CO 2 pendant 15 min. </li><li> Disséquer un demi-hémisphère du cerveau en coupant la peau et le crâne de la souris à l&#39;aide de ciseaux. Peler la moitié d&#39;un hémisphère de cerveau loin du crâne à l&#39;aide de pinces ou la fin d&#39;une paire de ciseaux. </li><li> Presser la moitié d&#39;un hémisphère de cerveau de chaque souris à travers un tamis de maille 40 um en utilisant 2,5 ml de tampon FACS (1x; Du PBS, 1% de sérum bovin fœtal, 10 mM d&#39;EDTA) dans une boîte de Petri avec le piston d&#39;une seringue. </li><li> Rincer la crépine cellulaire et boîte de Pétri avec un 2,5 ml supplémentaires de tampon FACS. Mettre la suspension monocellulaire dans un tube conique de 15 ml sur de la glace. </li><li> Distribuer 100 ul de 5 ml seule suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 5 min à 350 x g. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS. Spin à 350 g pendant 5 min. Répéter l&#39;opération avec un autre 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace. </li><li> Incuber les cellules dans 100 ul de dilution 1: 100 d&#39;une solution à 0,5 mg / ml de rat bloc Fc anti-souris dans un tampon de FACS pendant 30 à 60 minutes sur de la glace. Pellet et laver les cellules comme dans l&#39;étape 4.5. Gardez la suspension de cellules sur la glace. </li><li> Incuber les cellules dans 100 ul d&#39;une 20 pg / ml d&#39; anticorps fluorescent contre les souris PrP C dans le sérum de la souris 7% dans un tampon FACS sur la glace pendant 30 à 60 min. Pellet et laver les cellules comme dans l&#39;étape 4.5. Gardez la suspension cellulairesur la glace. </li><li> Pellet et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RBC (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM NaHCO 3, EDTA 0,1 mM) pendant 1 min. Pellet à l&#39;étape 4.5 et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace. </li><li> Analyser la PrPc expression en utilisant un cytomètre en flux comme décrit précédemment 10. Porte cellules de la population cellulaire totale vit. Porte PrP C + cellules de la population de cellules vivantes pour déterminer MFI (intensité de fluorescence de la médiane). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce rapport décrit un protocole pour créer deux systèmes d&#39;administration ciblés qui transporte efficacement siRNA au SNC. Les procédés antérieurs de prestation ARNsi au système nerveux central inclus l&#39;injection des vecteurs de siRNA / shRNA directement dans le cerveau, l&#39;injection intraveineuse de siRNA ciblé, ou injection intraveineuse de complexes de liposomes ARNsi non ciblées. Injection de vecteurs de siRNA / shRNA dans le système nerveux central ne provoque une diminution du taux d&#39;expression de la...

Les prions sont des maladies neurodégénératives graves qui affectent le système nerveux central. Les maladies à prion résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale, la PrPc, par un isomère infectieuse appelée PrP Res. Ces maladies touchent une grande variété d&#39;espèces , y compris l&#39; encéphalopathie spongiforme bovine chez les vaches, la tremblante du mouton, la maladie du dépérissement chronique chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l&#39; homme 1-3. Prion provoquent la neurodégénérescence qui commence par la perte synaptique, et progresse vers vacuolisation, gliose, perte neuronale, et les dépôts de plaque. Finalement, ce qui entraîne la mort de l&#39;animal / personne 4. Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les composés destinés à ralentir ou arrêter la progression de la maladie du prion. Cependant, les chercheurs ont pas trouvé soit une thérapie réussie ou un véhicule de livraison systémique efficace. L&#39; expression endogène de PrP C est nécessaire pour le développement des maladies à prion 5 </sup&gt;. Par conséquent, en diminuant ou en éliminant l&#39; expression PrP C peut entraîner un retard ou l&#39; amélioration de la maladie. Plusieurs groupes ont créé des souris transgéniques avec des niveaux réduits de PrP C ou lentivecteurs injectés exprimant shRNA directement dans le tissu cérébral murin pour étudier le rôle des niveaux d&#39;expression de la PrP C dans les maladies à prions. Ces chercheurs ont constaté la réduction de la quantité de neurones PrP C ont donné lieu à l&#39; arrêt de la neuropathologie progressive des maladies à prions et prolongé la durée de vie des animaux 6-9. Nous avons signalé que les résultats de traitement PrP C siRNA de la clairance de la PrP Res dans les cellules de neuroblastome de souris 10. Ces études suggèrent que l&#39;utilisation des thérapies pour réduire les niveaux d&#39;expression de la PrP C, comme des petits ARN interférents (siRNA), qui clive l&#39; ARNm, peut suffisamment retarder la progression des maladies à prions. Cependant, la plupart des thérapies étudiées pour les maladies à prions ont été livrées d&#39;une manière qui ne serait pas pratiquedans un contexte clinique. Par conséquent, une thérapie par ARNsi a besoin d&#39;un système d&#39;administration systémique, qui est délivré par voie intraveineuse et ciblée vers le système nerveux central. Chercheurs ont étudié l&#39;utilisation de liposomes en tant que véhicules de délivrance pour des produits de thérapie génique. Des lipides cationiques et anioniques sont utilisés à la fois dans la formation des liposomes. Des lipides cationiques sont plus largement utilisés que les lipides anioniques, car la différence de charge entre le lipide cationique et l&#39;ADN / ARN permet un conditionnement efficace. Un autre avantage de lipides cationiques est celle qu&#39;ils traversent la membrane cellulaire plus facilement que d&#39; autres lipides 11-14. Cependant, les lipides cationiques sont plus immunogènes que les lipides anioniques 13,14. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à passer de l&#39;aide cationique anioniques lipides dans des liposomes. Les produits de thérapie génique peuvent être efficacement emballés dans des liposomes anioniques , en utilisant le sulfate de protamine peptide chargé positivement, qui condense les molécules d&#39; ADN / ARN 15-19. Depuis lipi anioniqueds sont moins immunogènes que les lipides cationiques , ils peuvent avoir une augmentation des temps de circulation, et peuvent être plus tolérés dans des modèles animaux 13,14. Les liposomes sont ciblés vers des tissus spécifiques en utilisant des peptides de ciblage qui sont attachés à des liposomes. Neuropeptide RVG-9R, qui se lie à des récepteurs nicotiniques de l&#39; acétylcholine, a été utilisé pour cibler l&#39; ARNsi et des liposomes au système nerveux central 17-20. Ce rapport décrit un protocole pour produire trois véhicules de livraison de siRNA et d&#39;emballer et de livrer le siRNA aux cellules neuronales (Figure 1). les complexes liposome-siRNA peptide (LSPCs) sont composées de liposomes avec l&#39;ARNsi et RVG-9R peptide ciblant électrostatiquement fixés sur la surface extérieure du liposome. Peptide thérapeutique encapsulé dans des liposomes adressé siRNA (PALETS) sont composés d&#39;ARNsi et la protamine encapsulé dans le liposome, avec RVG-9R lié de manière covalente à des groupes de lipides PEG. En utilisant les méthodes ci-dessous pour générer LSPCs et PALETS, PrP C siRNA diminue PrP C expression jusqu&#39;à 90% dans les cellules neuronales, qui détient la promesse énorme pour guérir ou retarder l&#39;apparition de la pathologie de la maladie du prion sensiblement.

<table><tbody><tr><td>DOTAP lipide</td><td>Avanti Lipides</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Avanti Lipides</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipides</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipides</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gaz</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrudeuse</td><td>Avanti Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1,0, 0,4 et 0,2 &#956 ; filtres m</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de protamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Aliquote à usage unique</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Aliquote à usage unique</td></tr><tr><td>40 &#956 ; m Filtre cellulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-souris CD16/CD32 Fc block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-PrP (PRC5)</td><td>Exclusif - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

livraison de sirna thérapeutique du snc utilisation cationique et anionique liposomes

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Les maladies à prions résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale (PrPC) en un isomère anormal résistant à la protéase appeléPrP Res. L’émergence de maladies à prions dans les populations d’animaux sauvages et leur menace croissante pour la santé humaine ont conduit à des efforts accrus pour trouver un traitement contre ces maladies. Des études récentes ont trouvé de nombreux composés anti-prions qui peuvent soit inhiber l’isomère infectieux PrPRes, soit réguler à la baisse la protéine prion cellulaire normale. Cependant, la plupart de ces composés ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique pour inhiber efficacement la formation dePrP Res dans les tissus cérébraux, ne ciblent pas spécifiquement la PrPC neuronale et sont souvent trop toxiques pour être utilisés chez des sujets animaux ou humains. 
Nous avons cherché à savoir si le siRNA délivré par voie intravasculaire et ciblé sur la PrPC neuronale est un composé anti-prion plus sûr et plus efficace. Ce rapport décrit un protocole pour produire deux véhicules d’administration liposomale de siRNA, et pour conditionner et délivrer des siRNA PrP aux cellules neuronales. Les deux véhicules d’administration liposomale sont 1) la formulation de liposomes à siARN complexifiés à l’aide de liposomes cationiques (LSPC) et 2) la formulation de liposomes à siARN encapsulés à l’aide de liposomes cationiques ou anioniques (PALETS). Pour les LSPC, l’ARNi chargé négativement est lié électrostatiquement au liposome cationique. Un peptide chargé positivement (RVG-9r [glycoprotéine du virus de la rage]) est ajouté au complexe, qui cible spécifiquement les complexes liposomes-siARN-peptides (LSPC) à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) jusqu’aux neurones exprimant l’acétylcholine dans le système nerveux central (SNC). Pour les PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), les lipides cationiques et anioniques ont été réhydratés par le siRNA PrP. Cette procédure aboutit à l’encapsulation de l’ARNi dans les liposomes cationiques ou anioniques. Encore une fois, le neuropeptide RVG-9r était lié aux liposomes pour cibler les complexes siRNA/liposomes vers le SNC. En utilisant ces formulations, nous avons réussi à délivrer des siRNA PrP aux neurones exprimant AchR, et à diminuer l’expression de PrPC des neurones dans le SNC.

Pour augmenter l&#39;efficacité de l&#39;ARNsi à l&#39;intérieur de l&#39;encapsulation PALETS anioniques, l&#39;ARNic a été mélangé avec de la protamine. Pour déterminer la meilleure concentration de protamine pour l&#39;ARNsi, l&#39;ARNic a été mélangé avec différentes concentrations de protamine, de 1: 1 à 2: 1 (figure 3A). Il y avait un rendement d&#39;encapsulation ARNsi de 60 à 65% dans des liposomes anioniques sans l&#39;utilisation de la protamine. Les échantillo...

L’objectif de ce protocole est d’utiliser des liposomes cationiques/anioniques avec un peptide neuro-ciblant comme système d’administration du SNC pour permettre aux siRNA de traverser la BHE. L’optimisation d’un système d’administration pour les traitements, comme les siRNA, permettrait davantage d’options de traitement pour les prions et d’autres maladies neurodégénératives.

Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

L'objectif général de cette procédure est de concevoir un système de délivrance capable d'acheminer des médicaments de petite taille, comme les ARNsi, vers le cerveau. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la neurodégénérescence, telles que : l'ARNsi constitue-t-il une option thérapeutique viable pour les maladies liées au mauvais repliement des protéines ? et pouvons-nous concevoir un système fiable de délivrance de médicaments au cerveau ?Le principal avantage de la création d'un système de délivrance de médicaments sous forme de liposomes est que nous pouvons administrer notre ARNsi par voie intraveineuse ou par le biais de la circulation sanguine, plutôt que directement dans le tissu neuronal, ce qui entraîne des lésions neuronales. Les implications de cette technique s'étendent aux domaines thérapeutique et diagnostique des maladies neurodégénératives, car elle permet un transport ciblé à travers la barrière hémato-encéphalique, spécifiquement vers les neurones exprimant l'acétylcholine. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car les injections dans la veine de la queue de souris sont difficiles à maîtriser en raison de la petite taille de cette veine. Commencez par préparer un rapport un pour un entre DOTAP et cholestérol. Pour une préparation de liposomes à destination animale, mélangez deux nanomoles de DOTAP et deux nanomoles de cholestérol dans dix millilitres d'une solution de chloroforme et de méthanol en rapport un pour un. Ensuite, évaporez neuf millilitres de la solution de chloroforme et de méthanol à l'aide de gaz azote.Faire évaporer le dernier millilitre de solvant dans un hotte sous vide pendant la nuit sans gaz. Le lendemain, un film lipidique mince doit être visible au fond du flacon. Chauffer ce flacon contenant le film lipidique ainsi que dix millilitres d'une solution de saccharose à dix pour cent à cinquante-cinq degrés Celsius.Ensuite, pipetez lentement la solution de saccharose chauffée sur le film lipidique mince tout en agitant doucement le flacon. Puis, montez un extrudeur équipé de filtres d'un micron conformément aux instructions du fabricant. Ajoutez ensuite un millilitre de la suspension de liposomes chauffée dans l'une des seringues de l'extrudeur.Ensuite, faites passer la suspension entre les deux seringues 11 fois. En maintenant la suspension de liposomes chauffée pour faciliter le calibrage, calibrez les liposomes à l’aide d’un filtre de 45 microns, puis d’un filtre de 2 microns. Pour générer des vésicules unilamellaires de grande taille, ajoutez ensuite 20 microlitres de la suspension de liposomes de quatre nanomoles à 200 microlitres d’une solution mère d’ARNsi à 20 micromolaire et incubez pendant dix minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite 80 microlitres d’une solution mère de peptide ciblant RVG-9R à 500 micromolaire à la solution de liposomes contenant l’ARNsi et incubez pendant dix minutes à température ambiante.Préparez une suspension de liposomes étrangers en mélangeant 2,2 nanomoles de DSPE ou de DOTAP dans dix millilitres d'une solution de chloroforme à méthanol en rapport de 2:1 contenant 1,6 nanomole de cholestérol et 2 nanomoles de DSPE-peg. Ensuite, appliquez un courant d'azote et, lorsque la majeure partie du solvant s'est évaporée, laissez le flacon dans la hotte aspirante toute la nuit. Puis, ajoutez lentement dix millilitres de PBS 1X chauffé à 75 degrés Celsius au film lipidique mince.Laisser les lipides s'hydrater à 75 degrés Celsius pendant au moins une heure avant le calibrage. Après avoir calibré la suspension de liposomes à l’aide d’un extrudeur comme précédemment, prélever 20 microlitres de chacune des quatre suspensions de liposomes de quatre nanomoles dans des aliquotes à usage unique et lyophiliser pendant 30 minutes à l’aide d’un lyophilisateur de laboratoire. Ensuite, ajouter 1,4 microlitre d’une solution de sulfate de protamine à 26,6 micromolaire à 200 microlitres de solution mère de siRNA à 20 micromolaire et incuber pendant dix minutes à température ambiante pour condenser le siRNA.Après l'incubation, réhydratez les pastilles DSPE avec 201,4 microlitres de solution d'ARNsi protamine. Réhydratez les pastilles DOTAP avec 200 microlitres d'une solution mère d'ARNsi d'origine animale étrangère. Incubez chaque solution d'ARNsi liposomale pendant dix minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez dix microlitres d'une solution de EDC à 60 millimolaire dans chaque tube de liposomes réhydratés. Puis ajoutez dix microlitres d'une solution de sulfo-NHS à 150 millimolaire à la solution de liposomes contenant du ARNsi pour les pastilles DOTAP et DSPE. Incubez pendant deux heures à température ambiante.Enfin, ajoutez 80 microlitres de la solution mère de 500 micromolaire du peptide RVG-9R à la solution de réticulation des liposomes d'ARNsi et incubez pendant dix minutes à température ambiante. Après avoir anesthésié une souris à l'aide de deux à trois pour cent d'isoflurane dans de l'oxygène, recouvrez les yeux de la souris avec une pommade ophtalmique et confirmez l'anesthésie en pinçant l'orteil. Ne poursuivez que si aucune réaction n'est observée.Pendant le maintien de l'anesthésie, placer la souris sur le dos ou sur le côté afin d'accéder à la veine de la queue. Essuyer la queue avec de l'éthanol à 70 pour cent, puis utiliser une seringue à insuline de calibre 26 pour injecter 300 microlitres de LSPCs ou de palets dans la veine de la queue. Commencer l'injection de façon distale et progresser en direction proximale si la veine s'effondre ou se rompt.Placer la souris dans une cage propre jusqu'à ce qu'elle maintienne une position sterno-abdominale. Surveiller l'animal pendant plusieurs heures après l'injection afin de s'assurer que l'anesthésie disparaît et qu'il n'y a aucun effet indésirable du traitement. Après avoir laissé les LSPCs ou les palets circuler pendant au moins 24 heures, euthanasier la souris, puis disséquer une demi-hémisphère du cerveau.Ensuite, placez la demi-hémisphère et 2,5 millilitres de tampon fax sur un tamis cellulaire de 40 microns et utilisez le piston d'une seringue pour faire passer le tissu à travers le filtre dans une boîte de Pétri. Rincez le tamis cellulaire et la boîte de Pétri avec 2,5 millilitres supplémentaires de tampon fax. Transférez ensuite la suspension monocellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et placez-le sur de la glace.Ensuite, pipetez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge et centrifugez pendant cinq minutes à 350 × g. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot cellulaire dans un millilitre de tampon fax et centrifugez à nouveau. Puis, ajoutez un autre millilitre de tampon fax et placez la suspension cellulaire sur de la glace. Incubez maintenant les cellules dans 100 microlitres de blocage Fc anti-souris de rat dans du tampon fax pendant 30 à 60 minutes sur de la glace.Après avoir centrifugé et lavé comme précédemment, ajouter 100 microlitres de solution primaire fluorescente d'anticorps et placer sur de la glace pendant 30 à 60 minutes. Après un dernier lavage, resuspendre les cellules dans un millilitre de tampon de lyse RVC pendant une minute. Ensuite, centrifuger les cellules.Après avoir éliminé le tampon, resuspendre dans un millilitre de tampon fax et placer sur de la glace. Les cellules sont maintenant prêtes pour l'analyse par fax. Les souris traitées avec du siRNA délivré via des LSPCs ont montré une diminution significative des niveaux de protéine prionique cellulaire par rapport à un témoin PBS qui montre des niveaux de protéine prionique cellulaire de type sauvage.Les souris traitées avec les LSPC présentaient des niveaux de protéine prionique cellulaire proches de ceux d'une souris dont le gène de la protéine prionique a été inactivé. Au cours de trois expériences, les souris traitées avec les LSPC ont montré une diminution significative des niveaux de protéine prionique cellulaire par rapport aux témoins traités au PBS. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les liposomes peuvent être conservés au réfrigérateur pendant plusieurs mois, mais que les LSPC complets doivent être utilisés dans les 24 heures suivant leur assemblage.Après son développement, la production de CSPs ou de palets ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer davantage d'options thérapeutiques dans le domaine des maladies neurodégénératives.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

L’encapsulation du médicament améliore la spécificité des cellules tumorales et réduit la neurotoxicité.

Administration améliorée par convection de liposomes chargés enrobés de polyéthylène glycol dans une tumeur cérébrale de rat

Source : Ullah, I., et.al. Dispositif de positionnement pour le placement de souris lors de l’administration intranasale d’ARNi au système nerveux central. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre une technique d’administration intranasale précise pour délivrer des complexes peptide-siRNA ciblant les neurones au cerveau de la souris à l’aide d’un dispositif de positionnement spécialisé. Les souris anesthésiées sont fixées en position tête baissée et avancée pour optimiser l’inhalation de siRNA...

Administration intranasale de siRNA dans le cerveau de la souris à l’aide d’un dispositif de positionnement

Source : Bender, H. R., et.al. Administration de siRNA thérapeutiques dans le SNC à l’aide de liposomes cationiques et anioniques. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’administration ciblée de siRNA de protéine prion (PrP) aux neurones à l’aide de complexes siARN-peptide liposomaux (LSPC). Les liposomes cationiques se lient électrostatiquement aux siRNA ciblant la PrP, qui sont ensuite stabilisés par le peptide RVG-9r pour le transport médié par le récepteur à travers la barrière...

Administration ciblée de siRNA aux neurones pour le silençage des protéines prions à l’aide de complexes liposomaux

Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l'expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n'a pas d'effets indésirables et évite les accidents mortels.

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Nous décrivons une méthode pour cibler les médicaments pour le système nerveux central soit par l'implantation d'un cathéter ou d'effectuer une injection en bolus dans le ventricule latéral droit chez la souris. Nous nous concentrons particulièrement sur la prestation des oligonucléotides antisens. Cette technique est facilement adaptable à d'autres médicaments et à des rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Livraison reste le principal défi pour la mise en œuvre thérapeutique de petits ARN interférents (siRNA). Ce protocole implique l'utilisation d'une plate-forme de délivrance de siRNA biocompatible et multifonctionnel, constitué par l'arginine et polyéthylènimine greffé microparticules de silicium poreux.

Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.

Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager

Ici, nous présentons un protocole utilisant un dispositif de positionnement de souris qui permet le placement approprié des souris pour l'administration intranasale d'une formulation de peptide-siRNA de cerveau-ciblage permettant le silençage efficace de gène dans le système nerveux central.

Un dispositif de positionnement pour le placement des souris pendant la livraison de siRNA intranasal au système nerveux central

On présente des méthodes pour préparer et caractériser les propriétés physico-chimiques et la bioactivité des nanoparticules de siRNA à charge neutrale et à pH réactif. On discute des critères pour les nanomédites siRNA réussis tels que la taille, la morphologie, la charge superficielle, le chargement de siRNA et le silençage génique.

Préparation de nanoparticules polymériques à charge neutralement et sensibles au pH pour la livraison de siRNA cytosoliques

Ici, nous décrivons une méthode pour livrer des drogues au système nerveux central de rat en implantant un cathéter dans l'espace intrathécal lombaire de la colonne vertébrale. Nous nous concentrons sur la livraison des oligonucléotides d'antisens, bien que cette méthode soit appropriée pour la livraison d'autres modalités thérapeutiques aussi bien.

Livraison intrathécale d'Oligonucléotides antisens dans le système nerveux central de rat

Découvrez la livraison de siRNA thérapeutique au cerveau en utilisant des liposomes cationiques et anioniques avec peptides neuro-ciblants. Cette méthode permet le transport intraveineux à travers la barrière hémato-encéphalique pour traiter les maladies neurodégénératives.

Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

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