Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

L’objectif global de cette procédure est de concevoir un système d’administration capable d’administrer des médicaments à petites molécules comme le siRNA au cerveau. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la neurodégénérescence, telles que : le siRNA est-il une option thérapeutique viable pour les maladies de mauvais repliement des protéines ? et Pouvons-nous concevoir un système fiable d’administration de médicaments au cerveau ?

Le principal avantage de la création d’un système d’administration de médicaments liposomaux est que nous pouvons délivrer notre siRNA par voie intraveineuse ou par la circulation sanguine plutôt que directement à travers le tissu neuronal, ce qui entraîne des lésions neuronales. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapeutique et au diagnostic des maladies neurodégénératives, car cette technique permet une administration spécifique à travers la barrière hémato-encéphalique, en particulier aux neurones exprimant l’acétylcholine. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car les injections dans la veine de la queue de souris sont difficiles à apprendre en raison de la petite taille de la veine de la queue de la souris.

Commencez par préparer un rapport DOTAP/cholestérol de un à un. Pour une préparation de liposomes d’animaux étrangers, mélangez deux nanomoles de DOTAP et deux nanomoles de cholestérol dans dix millilitres d’une solution individuelle de chloroforme et de méthanol. Ensuite, évaporez neuf millilitres de la solution de chloroforme et de méthanol à l’aide d’azote gazeux.

Évaporez le dernier millilitre de solvant dans une hotte pendant la nuit sans gaz. Le lendemain, une fine pellicule lipidique doit être visible au fond de la fiole. Chauffez à la fois ce flacon avec le film lipidique et dix millilitres d’une solution de saccharose à dix pour cent à 55 degrés Celsius.

Ensuite, pipetez lentement la solution de saccharose chauffée sur la fine pellicule lipidique tout en remuant doucement le flacon. Ensuite, assemblez une extrudeuse avec des filtres d’un micron selon les instructions du fabricant. Ensuite, ajoutez un millilitre de suspension de liposomes chauffée à l’une des seringues de l’extrudeuse.

Passez ensuite la suspension entre les deux seringues 11 fois. Tout en gardant la suspension de liposomes chauffée pour faciliter le dimensionnement, dimensionnez les liposomes à travers 45 microns et un filtre de 2 microns Pour générer de grandes vésicules unilamellaires, ajoutez ensuite 20 microlitres de la suspension de liposomes à quatre nanomoles à 200 microlitres d’une solution de siRNA stock de 20 micromolaires et incubez pendant dix minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite 80 microlitres d’un stock de 500 micromolaires de peptide ciblant RVG-9R à la solution de liposome siRNA et incubez pendant dix minutes à température ambiante.

Préparez une suspension de lipsomoe pour animaux étrangers en mélangeant 2,2 nanomoles de DSPE ou de DOTAP dans dix millilitres d’une solution de chloroforme à méthanol à raison de deux pour un avec 1,6 nanomole de cholestérol et 2 nanomoles de cheville de DSPE. Ensuite, appliquez de l’azote gazeux et, lorsque la majeure partie du solvant s’est évaporée, laissez le ballon dans la hotte pendant la nuit. Ensuite, ajoutez lentement dix millilitres de 1X PBS chauffé à 75 degrés Celsius à la fine pellicule lipidique.

Laissez les lipides se réhydrater à 75 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de les calibrer. Après avoir dimensionné la suspension de liposomes à l’aide d’une extrudeuse comme précédemment, pipetez 20 microlitres de chacune des quatre suspensions de liposomes nanomoles en aliquotes à usage unique et lyophilisez pendant 30 minutes à l’aide d’un lyophilisateur de paillasse. Ensuite, ajoutez 1,4 microlitre d’une solution de sulfate de protamine de 26,6 micromolaires à 200 microlitres de solution d’ARNi de stock de 20 micromolaires et incubez pendant dix minutes à température ambiante pour condenser l’ARNi.

Après l’incubation, réhydratez les palets DSPE avec 201,4 microlitres de solution de protamine siRNA. Réhydratez les palets DOTAP avec 200 microlitres d’une solution mère d’animaux étrangers de siRNA. Incuber chaque solution de siRNA de liposomes pendant dix minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez dix microlitres d’une solution EDC de 60 millimolaires dans chaque tube de liposomes réhydratés. Ajoutez ensuite dix microlitres de solution sulfo-NHS de 150 millimolaires à la solution de siRNA liposomique pour les palets DOTAP et DSPE. Incuber pendant deux heures à température ambiante.

Enfin, ajoutez 80 microlitres de 500 micromolaires de peptide RVG-9R à la solution de réticulation des liposomes siRNA et incubez pendant dix minutes à température ambiante. Après avoir anesthésié une souris à l’aide de deux à trois pour cent d’isoflurane dans de l’oxygène, couvrez les yeux de la souris avec une pommade apthalmique et confirmez une anesthésie en effectuant un pincement des orteils. Ne procédez que si une réaction est absente.

Tout en maintenant l’anesthésie, placez la souris sur son dos ou son côté pour accéder à la veine de la queue. Essuyez la queue avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez une seringue à insuline de calibre 26 pour injecter 300 microlitres de LSPC ou de palets dans la veine de la queue. Commencez l’injection distale et déplacez-vous vers la proximale si la veine s’affaisse ou se rompt.

Placez la souris dans une cage propre jusqu’à ce qu’elle maintienne une décubitus sternal. Surveillez l’animal pendant plusieurs heures après l’injection pour vous assurer que l’anesthésie se dissipe et qu’il n’y a pas d’effets néfastes du traitement. Après avoir laissé les LSPC ou les palets circuler pendant au moins 24 heures, puis euthanasié la souris, disséquez la moitié d’un hémisphère du cerveau.

Placez ensuite le demi-hémisphère et 2,5 millilitres de tampon de télécopie sur une crépine à mailles de 40 microns et utilisez le piston d’une seringue pour presser le tissu à travers le filtre dans une boîte de Pétri. Rincez la passoire cellulaire et la boîte de Pétri avec 2,5 millilitres supplémentaires de tampon de télécopie. Transférez ensuite la suspension à cellule unique dans un tube conique de 15 millilitres et placez-la sur de la glace.

Ensuite, pipetez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans le microtube de centrifugation et centrifugez pendant cinq minutes à 350 fois G.Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de fax et centrifugez à nouveau. Ensuite, ajoutez un autre millilitre de tampon de télécopie et placez la suspension cellulaire sur de la glace. Maintenant, incubez les cellules dans 100 microlitres de bloc Fc anti-souris de rat dans un tampon de fax pendant 30 à 60 minutes sur de la glace.

Après la granulation et le lavage comme précédemment, ajoutez 100 microlitres de solution d’anticorps primaire fluorescente et placez sur de la glace pendant 30 à 60 minutes. Après un dernier lavage, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon de lyse RVC pendant une minute. Ensuite, granulez les cellules.

Après avoir jeté la mémoire tampon, remettez-la en suspension dans un millilitre de mémoire tampon de télécopie et placez-la sur de la glace. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’analyse par télécopie. Les souris traitées avec des siRNA délivrés via des LSPC ont montré une diminution significative des niveaux de protéines prions cellulaires par rapport à un contrôle PBS qui montre des niveaux de protéines prions cellulaires de type.

Les souris traitées par LSPC ont montré des niveaux de protéines prions cellulaires proches de ceux d’une souris knock-out par protéine prion. Au cours de trois expériences, les souris traitées avec des LSPC ont montré des diminutions significatives des niveaux de protéines prions cellulaires par rapport aux contrôles de type PBS. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les liposomes peuvent être conservés au réfrigérateur pendant plusieurs mois, mais que les LSPC complets doivent être utilisés dans les 24 heures suivant l’assemblage.

Après son développement, la génération de LSPC ou de palets ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer davantage d’options thérapeutiques dans le domaine des maladies neurodégénératives.