Détection de Anastasis In Vivo par CaspaseTracker biocapteur

L’objectif global de cette procédure est de détecter et de suivre l’inversion du processus de mort cellulaire après l’activation de la caspase chez des animaux vivants en utilisant Drosophila melanogaster comme modèle. En réponse à un stimulus de mort, les cellules subissent une mort cellulaire programmée telle que l’apoptose, qui a traditionnellement été considérée comme une cascade irréversible conduisant à la mort cellulaire. Il est intéressant de noter qu’après l’élimination du stimulus de mort, certaines cellules mourantes peuvent inverser le processus de mort cellulaire, même à un stade avancé.

Grâce à un phénomène de récupération cellulaire nouvellement découvert appelé anastase. La microscopie à cellules vivantes montre que les cellules apoptotiques mourantes présentent des caractéristiques morphologiques uniques, telles que le gonflement de la membrane plasmidique, la condensation nucléaire et le rétrécissement cellulaire. En général, on s’attend à ce que ces cellules meurent.

Cependant, après avoir lavé et incubé les cellules mourantes avec un milieu frais, elles subissent une anastase, se rétablissent et peuvent se diviser plus tard. Il est difficile de détecter et de suivre l’anastase chez les animaux vivants car les cellules récupérées peuvent être morphologiquement indiscernables des cellules saines environnantes. Pour résoudre ce problème, le système de biocapteurs CaspaseTracker de mammifères a été développé pour identifier et suivre les cellules qui inversent le processus de mort cellulaire après l’exécution ou l’activation de la caspase, la marque de l’apoptose.

Ce système de biocapteur se compose de deux composants : le transactivateur activable à la caspase, rtTA, et le rapporteur d’activité rtTA basé sur Cre LoxP. Dans les cellules saines, sans activité de caspase, rtTA est attaché à un ancrage de membrane plasmique par le biais d’un linker DEVD clivable par caspase. Comme le rtTA attaché ne peut pas se déplacer du cytosol au noyau, le rapporteur rtTA reste inactif.

Cependant, lors de l’activation en réponse à l’induction de la mort cellulaire, les caspases clivent le linker DEVD, libérant le rtTA pour se déplacer vers le noyau afin d’activer le rapporteur rtTA. Une fois dans le noyau, le rtTA se lie à l’élément de réponse tet, ou TRE, et déclenche l’expression transitoire de la recombinase Cre, conduisant à un événement de recombinaison irréversible qui supprime la cassette du codon stop entre le promoteur CAG et les séquences codantes de la protéine fluorescente rouge DsRed. Il en résulte une expression permanente de DsRed, qui sert de marqueur fluorescent permanent pour les cellules qui peuvent rester en vie après avoir subi une activité de caspase ainsi que leur progéniture.

La microscopie confocale sur cellules vivantes montre qu’après l’induction transitoire de la mort cellulaire, les cellules du biocapteur CaspaseTracker expriment DsRed pendant et après leur récupération, et les distinguent donc des cellules non récupérées, indiquées par des flèches blanches, ainsi que des cellules du biocapteur de contrôle qui n’ont pas été exposées au stimulus de mort cellulaire. La mort cellulaire programmée, telle que l’apoptose, est généralement considérée comme irréversible car elle est exécutée par une destruction cellulaire rampante et massive. Cependant, nous constatons que cette cellule mourante peut en fait se rétablir même à un stade avancé qui a été considéré comme le point de non-retour, comme après la libération du cytochrome c, l’activation de la caspase-3, les dommages à l’ADN, le gonflement de la membrane plasmique, le rétrécissement cellulaire et la formation de corps apoptotiques.

Nous les avons nommés anastasis, ce qui signifie prendre vie en grec. En utilisant la microscopie sur cellules vivantes, nous pouvons observer l’anastase dans des cellules cultivées. Cependant, il est techniquement difficile d’observer l’anastase chez les animaux vivants, car la cellule de mort récupérée peut ressembler à des cellules saines normales qui n’ont pas du tout tenté de mort cellulaire.

Par conséquent, nous avons développé un système de biocapteurs CaspaseTracker pour détecter et suivre l’anastase chez les animaux vivants. La version drosophile du système CaspaseTracker est un biocapteur double qui se compose de deux composants : le facteur de transcription d’utilisation activable par la caspase, GAL4, et le rapporteur d’activité GAL4, connu sous le nom de G-TRACE. Dans les cellules sans activité de caspase, le facteur de transcription de la levure, GAL4, est attaché à un domaine d’ancrage de la membrane plasmique par l’intermédiaire d’un linker DQVD clivable par la caspase.

Lors de l’activation de la caspase, les caspases activées clivent le linker DQVD pour libérer GAL4, qui se déplace ensuite vers le noyau pour activer le rapporteur G-TRACE. Le GAL4 nucléaire se lie aux séquences d’activation spécifiques en amont, abrégées UAS, pour déclencher l’expression transitoire de RFP, qui sert de rapporteur de l’activité récente ou actuelle des caspases jusqu’à ce que la caspase et l’activité de GAL4 cessent et que la protéine RFP soit dégradée. GAL4 déclenche également l’expression de la recombinase FLP, ce qui conduit à un événement de recombinaison qui supprime la cassette d’arrêt entre l’ubiquitine, abrégée Ubi, promoteur et les séquences de revêtement de la GFP à cible nucléaire.

Il en résulte une expression permanente de la GFP nucléaire, qui sert de marqueur permanent pour les cellules qui ont connu une activité de caspase mais restent vivantes ainsi que pour leur progéniture. Par conséquent, ce système peut identifier les cellules avec une activité de caspase en cours ou récente par le signal RFP transitoire et l’activité passée des caspase avec le signal GFP permanent. Un biocapteur de contrôle présente la mutation DQVA au site de clivage de la caspase, qui est insensible à l’activité de la caspase.

Des mouches femelles vierges GAL4 sensibles à la caspase ont été croisées avec de jeunes mouches mâles G-TRACE, ou vice versa, pour générer les mouches CaspaseTracker. Pour tester la réversibilité du processus de mort cellulaire après l’activation de la caspase, les mouches sont d’abord exposées à un stress environnemental transitoire induisant la mort cellulaire, tel qu’un choc thermique ou une privation de protéines. Ensuite, les mouches stressées sont transférées dans des conditions normales d’élevage pour se rétablir.

Des tissus ont été obtenus à partir des chambres d’ovules dans les ovaires des mouches témoins, stressées ou récupérées. Les échantillons ont été soumis à la microscopie confocale pour détecter les signaux fluorescents du biocapteur CaspaseTracker. Pour commencer, des mouches DQVD GAL4 anesthésiées, récemment fermées, sensibles aux caspases, utilisent du dioxyde de carbone et, avec un pinceau, transfèrent 7 à 10 femelles vierges dans un flacon d’aliments frais avec une petite cuillerée de pâte de levure.

Accouplez les femelles avec 7 à 10 jeunes mâles rapporteurs G-TRACE GAL4. Les mouches vierges nouvellement enfermées montrent le méconium vert foncé, indiqué par des flèches, qui sont les restes de la nourriture larvaire. Les mouches nouvellement fermées ont tendance à être plus grosses que les mouches matures.

Les mâles ont un abdomen plus foncé, indiqué par des cercles, et ont tendance à être plus petits que les femelles. Configurez le croisement à 18 degrés Celsius pour réduire les signaux non spécifiques du biocapteur CaspaseTracker dans la descendance, car l’activité GAL4 augmente avec la température. Tous les trois à sept jours, placez les adultes dans un nouveau flacon avec de la pâte de levure jusqu’à ce que leur productivité diminue.

Lorsque la descendance est fermée, connectez les mouches avec les deux transgènes de GAL4 sensible à la caspase et de G-TRACE, qui fonctionneront comme les mouches de descendance CaspaseTracker. Les deux insertions sont équilibrées par Curly-O. Ainsi, les mouches ailées non bouclées auront les deux transgènes.

Pour un contrôle négatif, prélever une descendance à double transgène à partir d’un croisement entre des femelles DQVA GAL4 insensibles à la caspase et des mâles rapporteurs G-TRACE GAL4 ou vice versa. À partir des croisements expérimentaux, transférez des cohortes de 10 à 20 mouches femelles nouvellement fermées vers de nouveaux flacons avec de la pâte de levure. L’ajout de quelques mâles aidera les femelles pour la production d’œufs.

Transférez les mouches bien nourries à 18 degrés Celsius pendant une journée afin que leurs ovaires produisent des chambres à œufs par OO-genèse. Ensuite, pour induire leurs chambres d’œufs à subir l’apoptose, utilisez un choc thermique. Transférez les mouches dans un nouveau flacon sans nourriture et congelez-les à 7 degrés Celsius pendant une heure.

Une autre méthode pour induire l’apoptose de la chambre de l’œuf consiste à utiliser la privation de protéines en logeant les mouches sur de la nourriture à 8 % de saccharose et 1 % de gélose à 18 degrés Celsius pendant trois jours. Changez les flacons alimentaires sans protéines tous les jours lorsque vous utilisez cette méthode. Après avoir stressé les mouches par l’une ou l’autre méthode, remettez-les dans leur état de logement normal et nourrissez-les avec de la pâte de levure pendant trois jours pour leur permettre de récupérer.

Plus tard, disséquez ces mouches pour isoler leurs chambres d’ovules et leurs ovaires. Après les avoir anesthésiés, utilisez deux paires de pinces pour retirer leur tête. Tirez ensuite les mouches à la base de l’abdomen pour retirer leurs ovaires.

Préparez-vous à prélever les ovaires en enduisant les pointes de pipette en plastique de 1 % de BSA dissous dans de l’eau ou du PBS afin que les chambres des œufs ne collent pas aux pointes de pipette. Après avoir disséqué les chambres d’œufs, rassemblez-les dans des pointes préparées avec environ un demi-millilitre de PBS. Transférez-les ensuite dans un tube à centrifuger d’un millilitre et laissez les œufs se déposer.

Poursuivez la procédure dans des conditions de faible luminosité ou d’obscurité totale pour éviter le blanchiment photographique des étiquettes fluorescentes. Aspirez le PBS et chargez 500 microlitres de paraformaldéhyde à quatre pour cent dans du PBS dans le tube à centrifuger. Laissez les œufs fixer pendant 20 à 30 minutes à température ambiante avec une rotation douce.

Évitez la fixation prolongée, car elle épuiserait le signal des protéines fluorescentes dans les chambres de l’œuf. Une fois fixé, retirez le PFA et lavez trois fois les chambres à œufs avec 500 microlitres de PBS-T. Ensuite, incubez les chambres à œufs avec du PBS-T pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec une rotation douce pour perméabiliser les chambres à œufs.

Le lendemain matin, ajoutez 500 microlitres de PBS-T avec 5 microgrammes de colorant nucléaire bleu, comme le Hoechst, dans les chambres à œufs. Laissez-les incuber en tournant doucement à température ambiante pendant une à deux heures, mais pas plus, sinon les signaux deviendront non spécifiques. Ensuite, lavez la chambre à œufs avec du PBS-T trois fois pendant 10 minutes par lavage.

Ensuite, à l’aide d’une pipette fine, aspirez tout le PBS-T et appliquez 200 microlitres d’agent d’enrobage anti-blanchiment. Les tissus flottent sur le dessus avant d’avoir complètement absorbé l’agent de montage. Incuber la chambre des œufs dans l’agent à 4 degrés Celsius pendant trois heures à toute la nuit.

Après avoir complètement absorbé l’agent de montage, les tissus coulent au fond des tubes et sont prêts à être montés. Pour commencer, appliquez de la vaseline sur la lame de verre ou la lamelle pour éviter de détruire les chambres à œufs par surcompression. Pour monter les chambres d’œufs tachées, transférez-les avec 200 microlitres d’agent de montage sur une lame de verre et couvrez-les d’une lamelle en verre de 20 millimètres carrés.

Scellez la lamelle avec du vernis à ongles et procédez à l’utilisation de la microscopie confocale. Dans les chambres d’œufs de l’ovaire chez les mouches saines CaspaseTracker, il n’y avait pas d’activité du biocapteur CaspaseTracker, indiquée par un manque de fluorescence verte et rouge. Cependant, après avoir soumis les mouches à un stress environnemental induisant la mort cellulaire, tel qu’une privation de protéines pendant trois jours, les chambres d’œufs ont subi le processus de mort cellulaire avec activation de la caspase, ce qui a induit les signaux des biocapteurs RFP et GFP.

En revanche, la mutation du site de clivage de la caspase chez les mouches témoins DQVA insensibles à la caspase a aboli la sensibilité des biocapteurs, indiquant que les signaux des biocapteurs dépendent de l’activité de la caspase. Ensuite, les mouches biocapteurs affamées et sensibles à la caspase ont reçu de la nourriture protéique pendant trois jours. Les chambres d’œufs des mouches récupérées n’indiquaient pas le rapporteur transitoire de caspase RFP, ce qui indique qu’il n’y a pas d’activité récente ou en cours.

Il est important de noter que les chambres d’ovules récupérées n’exprimaient que la GFP, ce qui indique qu’elles avaient inversé le processus de mort cellulaire après l’activation de la caspase. L’anastase est également observée in vivo après un stress thermique induisant la mort cellulaire transitoire. En réponse au choc thermique, les chambres des œufs mourants expriment les marqueurs de biocapteurs RFP et GFP, indiquant l’activité récente ou en cours de la caspase, représentée par le signal RFP, et l’activité passée des caspases, représentée par le signal GFP.

Cependant, après avoir soulagé le stress en revenant à un état de culture normal pendant trois jours, les chambres d’œufs des mouches récupérées n’ont montré que le rapporteur de caspase GFP, indiquant que les cellules de ces chambres d’œufs ont subi une anastase à un moment donné après l’activation de la caspase. Notamment, le signal GFP CaspaseTracker révèle que plusieurs types de cellules dans les chambres d’ovules sont capables d’inverser le processus de mort cellulaire et de réparer les dommages causés par les caspases, y compris les cellules germinales, telles que les ovocytes et les cellules nourricières, et les cellules folliculaires somatiques. Il est intéressant de noter que la GFP a également marqué les cellules du germarium, qui contiennent des cellules souches, ainsi que ses chambres d’œufs associées dans la même chaîne ovariale.

Par conséquent, ces chambres d’ovules positives à la GFP peuvent avoir été dérivées de cellules souches ayant subi une anastase. Voici des images montrant les tissus qui affichent l’activité du biocapteur CaspaseTracker sans exposition au stress environnemental. Il s’agit des pièces buccales, de l’intestin antérieur, du jabot, de l’intestin moyen, de l’intestin postérieur, des tubules de Malpighian, de l’anus, de l’oviducte et des ovaires d’une mouche femelle disséquée, nouvellement fermée, Jour 0.

La microscopie confocale révèle l’activité récente des caspases, comme indiqué par RFP, et l’activité passée des caspases, indiquée par la GFP. Des images agrandies montrent l’activité récente ou en cours et passée des caspases au niveau du lobe optique, du cardia, des tubules de Malpighien, de l’intestin postérieur et des parois musculaires des chambres d’œufs qui co-localisent avec la coloration à l’actine F. Certains tissus, tels que l’oviducte, ne manifestent qu’une activité passée de la caspase.

Ces activités de biocapteurs suggèrent une activité anesthésique potentielle au cours du développement embryonnaire ou de l’homéostasie normale. Cela pourrait également indiquer une activité actuelle ou passée de la caspase non apoptotique. Veuillez consulter le manuscrit pour plus de détails.

Le biocapteur in vivo CaspaseTracker signale spécifiquement l’activité de la caspase, car l’insensible CaspaseTracker avec la séquence de clivage non caspasique DQVA n’a pas d’activité du biocapteur. Le seul signal ici est le signal non spécifique de l’autofluorescence des pigments, des cuticules et des corps adipeux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension générale de la façon dont nous pouvons utiliser le système de biocapteurs CaspaseTracker pour détecter et suivre l’anastase chez les animaux vivants.

Ces biocapteurs peuvent faciliter l’étude de la monnaie et de la fonction connue de l’anastasis. Leur identification de la portée a un large éventail d’applications physiologiques, pathologiques et thérapeutiques. Bien que ces biocapteurs puissent détecter l’inversion de l’apoptose après l’activation de la caspase, ils peuvent également détecter la récupération des cellules après qu’elles aient tenté d’autres formes de mort cellulaire qui impliquent directement ou indirectement les activités de la caspase.

Lors de la conception d’une expérience, il est très important d’inclure des contrôles réciproques pour distinguer le signal du biocapteur fluorescent qui suit les cellules anesthésiques des cellules mourantes avec des activités de caspase en cours. Les cellules saines avec les activités de caspase apoptotiques connues actuelles ou passées et le signal d’autofluorescence non spécifique du pigment, de la graisse et des critiques. Vous trouverez l’analyse détaillée dans la version PDF de ce manuscrit.