Synthèse de la longueur d'onde de décalage d'ADN à l'aide de sondes d'hybridation cyanine photostable

L’objectif global de cette expérience est de visualiser le transfert d’énergie d’un brin d’ADN modifié par un colorant à un autre. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire. Comme l’interférence de l’ARN en surveillant le traitement et l’intégrité des siRNA dans les cellules vivantes en temps réel.

Le principal avantage de cette technique est la facilité de surveillance de la pénétration de la florescence et du changement de couleur, ce qui donne un résultat clair. Ainsi, les résultats faussement positifs sont éliminés. Pour commencer cette procédure, ajoutez les réactifs appropriés, comme indiqué dans le protocole textuel, dans une fiole de 20 millilitres, à fond rond, équipée d’une barre d’agitation magnétique et d’un condenseur à reflux.

Ensuite, ajoutez zéro virgule zéro six millilitres de pipéridine. Et chauffez le mélange réactionnel à 80 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois que la réaction s’est refroidie à température ambiante, récupérez le précipité résultant par filtration.

Et laver avec de l’éther diéthylique trois fois. Ensuite, ajoutez cent millilitres d’éther diéthylique au surnageant. Et recueillir le précipité résultant par filtration.

Après avoir lavé trois fois avec de l’éther diéthylique, combinez le précipité avec un solide isolé de la première filtration. À l’aide de l’ordinateur, connecté à un synthétiseur d’ADN, entrez la séquence d’ADN souhaitée et la méthode de couplage. En suivant les instructions du protocole du fabricant.

Ensuite, montez la colonne contenant le verre de coulée contrôlé, qui est modifié avec une micro-mole de la première face dans le synthétiseur. Maintenant, commencez la synthèse sur le synthétiseur d’ADN. Après l’analyse des brins d’ADN, ajouter les régents appropriés, comme indiqué dans le protocole textuel, à l’échantillon d’ADN modifié d’alcyne diéthylisé.

Incuber l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant un point cinq heures. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de 10 millilitres. Après refroidissement à température ambiante, ajoutez 150 microlitres d’une solution de sel disodique EDTA à cinq molaires et 450 microlitres d’une solution d’acétate de sodium à trois molaires à point zéro à l’échantillon d’ADN.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’éthanol à l’échantillon. Et conservez-le à moins 32 degrés Celsius pendant 16 heures. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 15 minutes à mille fois G.Lorsque vous avez terminé, retirez le surnageant.

Lavez la pastille d’ADN obtenue avec deux millilitres d’éthanol froid à 80 %. Séchez ensuite le granulé à pression réduite à l’aide d’un lyophilisateur. Purifiez la pastille d’ADN brute à l’aide de HP LC.Surveillez le fonctionnement en vérifiant 260 nanomètres et 459 nanomètres pour le colorant.

Ou 542 nanomètres pour le colorant deux. Collectez les fractions qui montrent une absorption dans les deux canaux de longueur d’onde. Pour les mesures par spectroscopie d’absorption simple brin, enregistrez une mesure à blanc contenant seulement 200 millimolaires de chlorure de sodium et 50 millimolaires de phosphate de sodium.

Ensuite, transférez la solution d’ADN 1 préalablement préparée dans une cuvette en verre de quartz d’un centimètre. Enregistrez l’absorption. Déterminez ensuite la valeur maximale d’absorption du colorant.

Pour les mesures par spectroscopie fluorescente simple brin, enregistrez une mesure à blanc contenant seulement 200 millimolaires de chlorure de sodium et 50 millimolaires de phosphate de sodium, en utilisant la longueur d’onde d’excitation du colorant un. Ensuite, placez la cuvette avec la solution d’ADN 1 dans le spectromètre. Enregistrez le spectre de la florescence.

Pour effectuer la mesure par spectroscopie fluorescente double brin, placez la cuvette avec le double brin de solution d’ADN1 et d’ADN2 dans le spectromètre. Enregistrez ensuite le spectre fluorescent à l’aide de la longueur d’onde d’excitation du colorant un. Pour mieux comprendre ce que montrent les spectres enregistrés, irradiez les cuvettes avec des lampes UV portatives.

Observez le changement de couleur de la florescence de l’ADN simple à l’ADN double brin. Les spectres d’absorption enregistrés montrent les maxima à 465 nanomètres pour l’ADN simple brin1 et à 546 nanomètres pour l’ADN simple brin2. Le double brin recuit de l’ADN1 et de l’ADN2 montre des maxima à 469 et 567 nanomètres.

Les deux maxima d’absorption montrent un décalage bathaohromique. Et les plus petits changements spectroscopiques sont le résultat d’interactions excitoniques entre les colorants au sein de l’architecture de l’ADN en double hélice. Les spectres fluorescents correspondants présentent un maximum à 537 nanomètres pour l’ADN simple brin1.

À 607 nanomètres pour l’ADN simple brin2. Et à 615 nanomètres pour le recuit, double brin d’ADN1 et d’ADN2. Le double brin d’ADN1 et d’ADN2 montre uniquement le maximum d’émission du colorant deux, bien que le premier colorant soit excité sélectivement, ce qui prouve que le transfert d’énergie se produit efficacement du colorant un au colorant deux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de publier de l’ADN modifié synthétiquement par une réaction catalytique de couple d’un brin d’ADN marqué à l’alcyne avec un côté A.