Synthèse de la longueur d'onde de décalage d'ADN à l'aide de sondes d'hybridation cyanine photostable

L'objectif général de cette expérience est de visualiser le transfert d'énergie entre une chaîne d'ADN modifiée par un colorant et une autre. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que l'interférence ARN, en surveillant en temps réel le traitement et l'intégrité des ARNsi dans des cellules vivantes.

Le principal avantage de cette technique réside dans la facilité de surveillance de la propagation de la fluorescence et du changement de couleur, ce qui fournit un résultat clair. Ainsi, les résultats faussement positifs sont éliminés. Pour commencer cette procédure, ajoutez les réactifs appropriés, comme indiqué dans le protocole, à un ballon de 20 millilitres à fond rond, muni d’un barreau d’agitation magnétique et d’un réfrigérant à reflux.

Ensuite, ajoutez 0,06 mL de pipéridine. Chauffez le mélange réactionnel à 80 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois la réaction refroidie à température ambiante, recueillez le précipité obtenu par filtration.

Et laver avec de l'éther diéthylique trois fois. Ensuite, ajouter cent millilitres d'éther diéthylique au surnageant. Et recueillir le précipité obtenu par filtration.

Après avoir lavé trois fois avec de l'éther diéthylique, combiner le précipité avec le solide isolé provenant de la première filtration. À l'aide de l'ordinateur relié à un synthétiseur d'ADN, saisir la séquence d'ADN souhaitée et la méthode de couplage. Suivre les instructions du protocole du fabricant.

Ensuite, fixez la colonne contenant le verre à écoulement contrôlé, qui est modifié par un micro-mole de la première face, sur le synthétiseur. Démarrez maintenant la synthèse sur le synthétiseur d'ADN. Après le traitement des brins d'ADN, ajoutez les réactifs appropriés, comme indiqué dans le protocole écrit, au groupe alcyne diéthylé présent dans l'échantillon d'ADN modifié.

Incuber l'échantillon à 60 degrés Celsius pendant une heure et demie. Ensuite, transférer l'échantillon dans un tube de 10 millilitres. Après refroidissement à température ambiante, ajouter 150 microlitres d'une solution à 0,05 molaire de sel disodique de l'EDTA et 450 microlitres d'une solution d'acétate de sodium à 0,3 molaire à l'échantillon d'ADN.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres d'éthanol à l'échantillon. Incubez à moins 32 degrés Celsius pendant 16 heures. Puis, centrifugez l'échantillon pendant 15 minutes à mille fois g. Une fois terminé, retirez le surnageant.

Lavez le culot d'ADN obtenu avec deux millilitres d'éthanol glacé à 80 %. Ensuite, séchez le culot sous pression réduite à l'aide d'un lyophilisateur. Purifiez le culot d'ADN brut par HP LC. Surveillez l'analyse en vérifiant à 260 nanomètres et à 459 nanomètres pour le colorant un.

Ou 542 nanomètres pour le colorant deux. Collecter les fractions qui montrent une absorption dans les deux canaux de longueur d'onde. Pour les mesures de spectroscopie d'absorption de brins simples, enregistrer une mesure témoin contenant uniquement du chlorure de sodium à 200 millimolaire et un tampon phosphate de sodium à 50 millimolaire.

Ensuite, transférez la solution d'ADN1 préparée précédemment dans une cuvette en verre de quartz d'un centimètre. Enregistrez l'absorption. Déterminez ensuite la valeur maximale de l'absorption du colorant.

Pour les mesures de spectroscopie fluorescente en simple brin, enregistrer une mesure témoin contenant uniquement du chlorure de sodium à 200 millimolaire et du phosphate de sodium à 50 millimolaire, en utilisant la longueur d'onde d'excitation du colorant un. Ensuite, placer la cuvette contenant la solution ADN1 dans le spectromètre. Enregistrer le spectre de fluorescence.

Pour effectuer la mesure par spectroscopie fluorescente de la double chaîne, placez la cuvette contenant la solution d'ADN1 et d'ADN2 en double chaîne dans le spectromètre. Ensuite, enregistrez le spectre de fluorescence en utilisant la longueur d'onde d'excitation du colorant un. Pour mieux comprendre ce que montrent les spectres enregistrés, irradiez les cuvettes avec une lampe UV portative.

Observer le changement de couleur de fluorescence entre l'ADN simple brin et double brin. Les spectres d'absorption enregistrés présentent des maxima à 465 nanomètres pour l'ADN1 simple brin et à 546 nanomètres pour l'ADN2 simple brin. Le double brin recuit formé par l'ADN1 et l'ADN2 montre des maxima à 469 et 567 nanomètres.

Les deux maxima d'absorption présentent un déplacement bathochrome. Et les plus petits changements spectroscopiques résultent d'interactions excitoniques entre les colorants au sein de l'architecture de l'ADN en double hélice. Les spectres de fluorescence correspondants présentent un maximum à 537 nanomètres pour l'ADN simple brin1.

À 607 nanomètres pour l'ADN simple brin2. Et à 615 nanomètres pour l'ADN double brin formé par hybridation des ADN1 et ADN2. L'ADN double brin constitué d'ADN1 et d'ADN2 présente uniquement le maximum d'émission du colorant deux, bien que le colorant un soit excité de manière sélective, ce qui démontre un transfert d'énergie efficace du colorant un vers le colorant deux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment modifier post-synthétiquement de l'ADN à l'aide de quelques réactions catalytiques entre un brin d'ADN marqué par un alcyne et un composé A.