Name: base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Apprenez à quantifier le métabolisme des purines dans les cellules leucémiques lymphocytaires chroniques par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. Cette méthode mesure l'adénosine extracellulaire.

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des échantillons de sang de CLL sont obtenus conformément aux lignes directrices institutionnelles et de la Déclaration d&#39;Helsinki. 1. Isolement des leucémique Lymphocytes d&#39;échantillons de sang de patients atteints de LLC <ol><li> Prélever un échantillon de sang dans l&#39; héparine de sodium (vert-top) tube 17. </li><li> Faire dilution 1: 3 de sang total avec RT 1x tampon phosphate salin (PBS). </li><li> On purifie des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir d&#39;échantillons de sang par centrifugation en gradient de densité. <ol><li> Sous - couche 5 ml de milieu de centrifugation de densité (par exemple, Ficoll) dans un tube de centrifugeuse de 15 ml soigneusement et transférer 10 ml de sang dilué. centrifuger immédiatement à 1500 g pendant 20 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Aspirer partie du surnageant avec une pipette Pasteur en verre relié à une pompe à vide et de recueillir l&#39;anneau PBMC à l&#39;interphase entre les médias de centrifugation de densité et du plasma dilué avec une pipette de 5 ml. Transférer dans un tube de centrifugation de 50 ml et on lave avec du PBS (50 ml volume final). Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant avec une pipette Pasteur en verre, resuspendre le culot dans 50 ml de PBS et on compte les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> CMSP Stain avec anti-CD19 et -CD5 anticorps pour cytométrie en flux suivant un protocole standard pour immunocoloration et vérifier la composition des sous - populations PBMC 18. Remarque: les lymphocytes CLL sont CD19 + / CD5 +. </li><li> Vérifiez le% de CD19 + / CD5 + cellules en utilisant un cytomètre de flux 18. Purifier les lymphocytes B de patients avec un ≥95% de CD19 + / CD5 + cellules leucémiques en suivant les instructions détaillées à l&#39; étape 2 pour l&#39;isolement négatif des cellules B 19. </li></ol> 2. Purification des cellules leucémiques B par Isolation négative <ol><li> Remettre en suspension 10 7 PBMC / ml dans du PBS 0,1% de sérum albumine bovine (BSA) , 2 mM d&#39; EDTA, pH 7,4 (tampon d&#39;isolement). </li><li> Ajouter 101; g d&#39;anticorps monoclonal de souris anti-CD3, -CD14 et -CD16 anticorps primaires pour 10 7 cellules et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules avec le tampon d&#39;isolement et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans le tampon d&#39;isolement 7 à 10 PBMC / ml. </li><li> Avant incubation avec les cellules, la remise en suspension de mouton anti-IgG de souris de billes magnétiques dans le flacon. Transférer 100 ul de billes par 10 7 cellules à un tube. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon d&#39;isolement et de placer le tube dans un support d&#39;aimant pendant 1 min. Jeter le surnageant avec une pipette de 5 ml. </li><li> Retirer le tube de l&#39;aimant et remettre en suspension les billes lavées dans 100 ul de tampon d&#39;isolement. </li><li> Incuber 10 7 cellules avec 100 ul de billes magnétiques pendant 30 min à 4 ° C avec une inclinaison douce et de rotation. </li><li> Placer le tube dans le support magnétique pendant 2 minutes et transférer le surnageant avec les cellules non liées CD19 + / + CD5un tube frais avec une pipette de 5 ml. </li><li> A la fin du protocole d&#39;isolement, la tache 100 ul de cellules avec anti-CD19 et des anticorps pour -CD5 cytométrie en flux et incuber pendant 30 min à 4 ° C. Laver les cellules avec 3 ml de PBS 1% de BSA, jeter l&#39;excès de surnageant et vérifier à nouveau la pureté des cellules B par cytométrie en flux 19. Remarque: Effectuez une étape supplémentaire d&#39;isolement négatif si la pureté des cellules B est inférieure à 95%. </li></ol> 3. Préparation du Standard et Inhibiteurs Solutions mères <ol><li> Pour préparer AMP, peser 0,00345 g d&#39;AMP et de le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour avoir une solution standard 2 mM d&#39;AMP. </li><li> Pour préparer ADO, peser 0,00265 g d&#39;ADO et le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour avoir une solution standard 2 mM d&#39;ADO. </li><li> Pour préparer INO, peser 0.00268 g de l&#39;INO et le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour avoir une solution standard 2 mM de INO. </li><li> Préparer une solution 400 uM de l&#39;AMP, ADO etINO en mélangeant 1 ml de la solution mère 2 mM dans 4 ml de exempt de sérum moyen (5 ml de volume final). <ol><li> Faire une dilution 1: 4 de chaque solution étalon de 400 pm pour obtenir une concentration de 100 uM par pipetage de 500 ul de la solution 400 uM dans 1500 ul de milieu sans sérum (2 ml de volume final). </li><li> Préparer des dilutions en série de chaque composé dans un milieu sans sérum pour obtenir les concentrations suivantes: 100 uM - 50 pM - 25 pM - 10 pM - 5 uM - 2,5 uM - 1 pM - 0,5 pM - 0,25 uM. Remarque: Par exemple, la pipette 1 ml de la solution à 100 pM dans 1 ml de milieu sans sérum (dilution 1: 2) pour obtenir une concentration de 50 uM et procéder à des dilutions restantes. </li></ol></li><li> Préparer une solution mère 10 mM de APCP dissous dans du PBS; aliquote et stock à - 30 ° C. </li><li> Préparer des solutions mères à 10 mM de chlorhydrate EHNA, dCF dipyridamole et dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO); aliquote et stock à -30° C. </li></ol> 4. Programme de la méthode HPLC <ol><li> Préparer un tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium, 7 mM en dissolvant 0,770 g d&#39;acétate d&#39;ammonium dans 2 litres d&#39;eau déminéralisée à double (tampon A). Ajuster le pH à 3,0 avec de l&#39;acide chlorhydrique. </li><li> Préparer une bouteille en verre contenant au moins 2 L de ultrapure acétonitrile pour HPLC (tampon B) et connecter la colonne de garde et la colonne de HPLC. Remarque: Les colonnes et les tampons sont à la température ambiante pendant l&#39;utilisation. </li><li> Connectez-vous au logiciel de HPLC et sélectionnez le bouton &quot;parcourir le projet&quot;. Allez dans le menu &quot;Fichier&quot; et sélectionner &quot;nouvelle méthode&quot;, puis &quot;méthode de l&#39;instrument&quot;. </li><li> Programmer la méthode de la colonne d&#39;équilibration selon le tableau 1. Définir un taux de 1,00 ml / min et programmer le détecteur UV à lire à 260 nm. Enregistrer la méthode de l&#39;instrument et sélectionner à nouveau &quot;nouvelle méthode&quot; dans le menu &quot;Fichier&quot; puis &quot;méthode set&quot;. Choisissez la méthode de l&#39;instrument précédemment enregistréet enregistrer la méthode actuelle définie avec le même nom. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temps </td><td> Débit (ml / min) </td><td> %UNE </td><td> % B </td></tr><tr><td></td><td> 1.00 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 1.24 </td><td> 1.00 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6.22 </td><td> 1.00 </td><td> 2 </td><td> 98 </td></tr><tr><td> 18.65 </td><td> 1.00 </td><td> 2 </td><td> 98 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: méthode de la colonne d&#39;équilibration Représentation schématique des changements de solvants pour l&#39;équilibration de la colonne.. Tampon A: mM d&#39;acétate d&#39;ammonium 7, pH 3,0. Tampon B: acétonitrile. <ol start="5"><li> Répétez l&#39;étape 4.3 pour programmer la méthode de l&#39;échantillon d&#39;exécution indiqué dans le tableau 2. Régler un taux de 1,00 m de débitL / min et le programme détecteur UV à lire à 260 nm. Enregistrer la méthode de l&#39;instrument et répétez la même procédure que celle décrite à l&#39;étape 4.4 pour enregistrer la méthode set .. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temps </td><td> Débit (ml / min) </td><td> %UNE </td><td> % B </td></tr><tr><td></td><td> 1.00 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3.74 </td><td> 1.00 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13,71 </td><td> 1.00 </td><td> 15 </td><td> 85 </td></tr><tr><td> 17.00 </td><td> 1.00 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 20.00 </td><td> 1.00 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Exécutez la méthode d&#39;échantillonnage. Représentation schématique des changements de solvant pour la mesure de HPLC de composés de purine. Chamoiser A: mM d&#39;acétate d&#39;ammonium 7, pH 3,0. Tampon B: acétonitrile. <ol start="6"><li> Sélectionnez le bouton &quot;échantillons exécuter&quot;, choisissez &quot;nouvelle méthode d&#39;ensemble de l&#39;échantillon&quot; dans le menu &quot;Fichier&quot;. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;vide&quot; et entrez le numéro du flacon (dans l&#39;échantillonneur automatique), le nom de l&#39;échantillon, le volume d&#39;injection (50 pi). Sélectionnez l&#39;ensemble de la méthode enregistrée avant pour la colonne &quot;méthode set&quot; et entrez le temps d&#39;exécution total (min). Remarque: Entrez la méthode de la colonne d&#39;équilibration (tableau 1) dans la colonne &quot;méthode set&quot; avant chaque exemple d&#39; exécution et entrez le temps d&#39;exécution total (min). </li></ol> 5. Génération d&#39;une courbe d&#39;étalonnage standard pour chaque composé <ol><li> Injecter 50 ul de (milieu spécifique sans sérum, qui ne contient pas l&#39; adénosine désaminase) blanc et de chaque échantillon standard suivant les méthodes décrites dans le tableau 1 et le tableau 2. <ol><li> Utilisez la colonne équilibrationméthode (tableau 1) avant chaque exemple d&#39; exécution et définir les conditions de gradient décrites dans le tableau 2 pour obtenir la séparation de pic adéquat. Reportez - vous au tableau 3 pour les temps de rétention déclarés d&#39;AMP, ADO et INO dans ces conditions de CLHP. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Temps de rétention </td><td> λ max </td></tr><tr><td> AMP </td><td> 8.00 min </td><td> 260 </td></tr><tr><td> INO </td><td> 11.00 min </td><td> 260 </td></tr><tr><td> ADO </td><td> 11.90 min </td><td> 260 </td></tr></tbody></table> Tableau 3: temps de rétention des composés de purine temps de rétention typiques observées pour AMP, ADO et INO.. Le détecteur UV est programmé pour lire à 260 nm. <ol start="2"><li&gt; Déterminer la surface du pic de l&#39;AMP, ADO et INO à différentes concentrations en choisissant le bouton «processus» dans le logiciel de HPLC et à côté de l&#39;option «intégrer». Vous pouvez également sélectionner manuellement les points de chaque pic début et de fin. </li><li> Tracer les zones de pic de la concentration nominale de chaque standard pour obtenir la courbe d&#39;étalonnage en neuf points (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 M). </li><li> Calculer l&#39;équation d&#39;une ligne droite pour AMP, ADO et INO: y = mx + b, où x est la concentration uM et y correspond à la zone de pointe. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig2.jpg" /> Figure 2. Génération d&#39;une courbe étalon interne. Courbe standard d&#39;étalonnage représentant pour ADO et l&#39;équation relative obtenue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez sur son</a>e pour voir une version plus grande de cette figure. 6. Prétraitement avec le Inhibiteurs et incubation avec le substrat (AMP) <ol><li> Pour tester AMP consommation, ADO et la génération de INO sans inhibition de CD73, ADA et transporteurs de nucléosides, resuspendre 2 x 10 6 CD19 + / cellules CD5 + CLL (isolé et purifié dans les étapes 1 et 2) dans 250 pi de milieu sans sérum et cellules de la plaque dans une plaque à 48 puits (ou dans un tube de 1,5 ml). </li><li> Pour bloquer l&#39;activité enzymatique de CD73, diluer 1: 1000 de la solution mère de PCAP (10 mM) dans le milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 10 uM. Remettre en suspension à 2 x 10 6 cellules CLL dans 250 ul de milieu de culture contenant de PCAP et prétraiter 60 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. </li><li> Pour bloquer la conversion de ADO dans INO, diluer 1: 1000 de la solution mère de EHNA chlorhydrate et / ou dCF (à la fois 10 mM) dans un milieu sans sérum pour avoir une concentration finale de 10 uM.Remettre en suspension à 2 x 10 6 cellules CLL dans 250 ul de milieu de culture contenant EHNA et / ou DCF. Incuber pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Pour bloquer l&#39;absorption d&#39;ADO à travers les transporteurs de nucléosides, diluer 1: 1000 de la solution mère de dipyridamole (10 mM) dans un milieu sans sérum pour avoir une concentration finale de 10 uM. Remettre en suspension à 2 x 10 6 cellules CLL dans 250 ul de milieu de culture contenant du dipyridamole et laisser incuber pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Préparer des solutions uniques de PCAP, EHNA, dCF et dipyridamole dilué 1: 1000 dans 400 uM AMP. </li><li> Ajouter 250 ul de 400 uM d&#39;AMP ou d&#39;AMP ainsi que des inhibiteurs d&#39;obtenir une concentration finale de 200 uM d&#39;AMP. Inclure une condition en l&#39;absence du substrat à utiliser comme échantillon à blanc. </li><li> Laisser incuber 30 à 60 minutes à 37 ° C. Remarque: La concentration optimale de l&#39;AMP et le temps d&#39;incubation a été déterminée expérimentalement. </li><li> à til fin du temps d&#39;incubation, on recueille 500 pi de surnageants dans des tubes de microcentrifugation à froid (glace) et centrifuger à 17 000 xg immédiatement à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation et stocker immédiatement à -80 ° C ou de procéder à la préparation des échantillons pour l&#39;HPLC fonctionne. </li></ol> 7. Préparation des échantillons pour HPLC <ol><li> Filtrer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation avec les filtres de 0,2 um seringue. Utiliser des seringues 1 ml pour le filtrage. </li><li> Si le système HPLC est muni d&#39;un passeur d&#39;échantillons, de préparer les flacons de verre pour HPLC et en utilisant 0,1 ml de micro-implants pour petits volumes d&#39;échantillons. </li><li> Le transfert d&#39;au moins 100 pi d&#39;échantillon dans la fiole en verre avec une micropipette ou d&#39;une pipette Pasteur en verre. Veillez à transférer sans bulles et fermer le flacon avec le bouchon à vis. </li><li> Les échantillons sont alors prêts pour l&#39;analyse par RP-HPLC. </li></ol> 8. HPLC Measugences de purines <ol><li> Sélectionnez le bouton &quot;échantillons d&#39;exécution&quot;; choisissez &quot;nouvelle méthode d&#39;ensemble de l&#39;échantillon&quot; dans le menu &quot;Fichier&quot;. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &quot;vide&quot; et indiquer: le numéro du flacon (dans l&#39;échantillonneur automatique), le nom de l&#39;échantillon, le volume d&#39;injection (50 pi). </li><li> Sélectionner la méthode de la colonne d&#39;équilibrage et de la méthode de l&#39; échantillon d&#39;exécution décrite dans le tableau 1 et le tableau 2, respectivement, pour tous les essais à blanc et l&#39; échantillon qui suivent. Remarque: Définissez la méthode de la colonne d&#39;équilibrage (tableau 1) avant chaque échantillon run. </li><li> Injecter 50 ul de (milieu sans sérum) blanc et de chaque échantillon. </li><li> Déterminer la concentration des purines dans chaque échantillon, quantifier l&#39;AMP, ADO et INO en obtenant des aires des pics aux temps de rétention décrits dans le tableau 3. <ol><li> Sélectionnez le bouton «processus» et à côté de l&#39;option «intégrer». Vous pouvez également choisir manuellement le début d&#39;unepoints de chaque pic unique e d&#39;extrémité pour obtenir la mesure de surface. Cela se fait en traçant une ligne entre les points de début et de fin de pointe. </li><li> Déterminer la concentration en uM appliquant l&#39;équation obtenue pour la courbe d&#39; étalonnage: y = mx + b, où x représente la concentration en uM et y est la surface du pic mesurée à partir de l&#39;échantillon inconnu. Note: Un exemple de l&#39;étalonnage courbe standard ADO est rapporté dans la figure 2, où: x = (y zone - 981,02) / 40026 </li></ol></li><li> Considérant que 2 x 10 6 cellules ont été remises en suspension dans 0.500 ml de milieu, calculer les pmoles d&#39;AMP, ADO et INO consommés et / ou produits par 10 6 cellules CLL appliquant la proportion suivante: umoles: 1000 ml = x umoles: 0,250 ml Remarque: Les pmoles de 1,000 ml (nombre pmoles dans 1 L) sont équivalents à la concentration en uM et x sont des micromoles de nucleotide ou nucléoside produites par 10 6 cellules. <ol><li> Enfin, convertir les umoles en nmoles consommés et / ou produits par 10 6 cellules CLL: x nmol = 1,000 pmoles </li></ol></li></ol>

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<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD38+and+ZAP-70+are+functionally+linked+and+mark+CLL+cells+with+high+migratory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential.</a> Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).</li>
<li>Sachsenmeier, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+ectonucleotidase+assay+suitable+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici permet d&#39;évaluer l&#39;activité du CD39 / CD73 machines adénosinergique dans des milieux de culture cellulaire à partir de cellules leucémiques humaines purifiées. Grâce à cette méthode HPLC, nous pouvons suivre et mesurer quantitativement la production enzymatique de ADO (CD73-dépendant) et sa dégradation subséquente à l&#39;INO (CD26 / ADA dépendant). L&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de l&#39;enzyme permet de contrôler le protocole et d&#39;avoir des contrôles internes. Les avantages et ...

Adenosine (ADO) est une purine nucléoside avec une molécule d&#39;adénine attachée à un fragment de molécule de sucre ribose par une liaison glycosidique. Lorsqu&#39;ils sont présents dans le milieu extracellulaire, elle protège les cellules contre les dommages excessifs par l&#39;action du système immunitaire. Ce rôle a été mis en évidence en utilisant différents modèles de maladies, telles que la colite 1, 2 diabète, l&#39; asthme 3, la septicémie 4 et 5 lésion ischémique. L&#39; une des principales fonctions d&#39;ADO est l&#39;inhibition des réponses immunitaires dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui contribue à la tumeur évasion immunitaire 6. Pour cette raison, les mécanismes impliqués dans la formation ADO et la signalisation sont d&#39; un intérêt thérapeutique considérable 7. ADO niveaux dans le microenvironnement des tissus sont relativement faibles dans des conditions physiologiques normales, et certainement inférieure au seuil de sensibilité des cellules immunitaires. Cependant, au cours de l&#39;hypoxie, l&#39;ischémie, l&#39;inflammation, l&#39;infection, métaboliquele stress et la transformation tumorale , ils augmentent rapidement 8. Les niveaux d&#39;ADO extracellulaires élevées en réponse à des signaux de tissu perturbant ont une double fonction: signaler une lésion tissulaire de façon autocrine et paracrine et pour générer des réponses tissulaires qui peuvent être généralement considérés comme cytoprotecteur. Extracellulaires ADO peut être formé par une variété de mécanismes, qui comprennent la libération des compartiments intracellulaires médiés par les transporteurs de nucléosides 9 ou accumulation en raison de la dégradation altérée exploité par l&#39; adénosine désaminase. La voie principale menant à une augmentation des niveaux extracellulaires ADO implique l&#39;action d&#39;une cascade de ectonucléotidases, qui sont associées à la membrane ectoenzymes générant ADO par phosphohydrolysis de nucléotides libérés de cellules mortes ou mourantes. Cette voie passe par l&#39;action séquentielle de CD39 (triphosphate ectonucleoside diphosphohydrolase-1) qui convertit l&#39;adénosine extracellulaire 5&#39;-triphosphate (ATP) ou l&#39; adénosine 5&#39;-diphosphate (ADP) en adénosine 5&#39;-monophosphate (AMP) et de CD73 (5&#39;-nucléotidase) qui transforme l&#39; AMP à 10 ADO. Extracellulaires ADO provoque ses réactions physiologiques en se liant à quatre transmembranaire ADO récepteurs, à savoir A1, A2A, A2B et A3. Chaque récepteur a des affinités différentes pour ADO et la distribution des tissus spécifiques. Tous les récepteurs ont sept domaines transmembranaires et sont couplés aux protéines G à des protéines de liaison au GTP intracellulaire (protéines G), qui peut induire (protéine Gs) ou à inhiber (Gi protéine) activité de l&#39;adénylate cyclase et, par la suite, la production d&#39;AMPc intracellulaire. Par conséquent, les changements de l&#39; impact cytoplasmique des taux d&#39;AMPc sur l&#39; activité protéine kinase intracellulaire pendant 11 réponses physiologiques. Dans des conditions physiologiques ADO extracellulaire est inférieure à 1 uM, qui peut activer indifféremment A1, A2A et récepteurs A3. Cependant, l&#39;activation du sous-type A2B nécessite considérablement plus élevésLes concentrations du nucleoside, tels que ceux produits dans des conditions physiopathologiques. En variante, OAD extracellulaire peut être dégradée à l&#39;inosine (INO) par l&#39;adénosine désaminase (ADA) et de CD26, une protéine ADA complexant localisant l&#39;ADA sur la surface cellulaire. Une autre possibilité est que ADO est internalisé par la cellule par les transporteurs de nucléosides (ORL) et phosphorylée à AMP par ADO protéine kinase 12,13. L&#39;objectif de ce protocole est de décrire une méthode d&#39;analyse de la chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour quantifier en un seul passage AMP du substrat et des produits ADO et INO, telle que générée par les lymphocytes humains. Notre expérience a été initialement obtenue en utilisant des cellules de patients chroniques leucémie lymphoïde (CLL), qui sont caractérisés par l&#39;expansion d&#39;une population mature de lymphocytes CD19 + / CD5 + B exprimant constitutivement CD39 14,15. Nous avons montré environ 30%des CLL patients expriment le ectoenzyme CD73 et que ce phénotype est corrélée à un mauvais pronostic 16. Cette sous-population de cellules leucémiques co-exprimant CD39 et CD73 peut activement produire ADO extracellulaire d&#39;ADP et / ou AMP. La pré - incubation de cellules CD73 + leucémiques avec des α, la synthèse d&#39;ADO extracellulaire β-méthylène-ADP (PCAP), un inhibiteur connu de l&#39; activité enzymatique CD73, bloque complètement confirmant que l&#39;enzyme CD73 représente un goulot d&#39;étranglement de cette cascade 16. les cellules CLL expriment également ADA et l&#39;ADA protéine complexant CD26, qui sont responsables de la conversion de ADO dans INO. En utilisant des inhibiteurs de l&#39;ADA spécifiques, tels que érythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) Je wiadenine (EHNA) et du chlorhydrate désoxycoformycine (FNC), il est possible de bloquer la dégradation ADO extracellulaire dans INO. En outre, le prétraitement avec un inhibiteur de l&#39;ADA, en combinaison avec le dipyridamole, qui bloque les transporteurs de nucléosides, augmente l&#39;accumulation dans la cellule ADOsurnageants. Nous avons ensuite étendu ce protocole à des cellules dérivées d&#39;autres lignées, y compris les lymphocytes T et les cellules myéloïdes, confirmant la production d&#39;ADO CD73-dépendante. Ces résultats suggèrent que ce protocole HPLC est très polyvalent et qu&#39;il peut être appliqué à différentes lignées cellulaires et à différentes conditions de culture (figure 1). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique de la machinerie enzymatique responsable de la production ADO extracellulaire. Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) et / ou l&#39; adénosine 5&#39;-diphosphate (ADP) peut être dégradé par CD39 à l&#39; adénosine 5&#39;-monophosphate (AMP), qui à son tour, est converti par CD73 dans l&#39;adénosine nucléoside (ADO). Une fois que ADO est produite dans l&#39;espace extracellulaire, elle peut rentrer dans la cellule par les transporteurs de nucléosides (ENT), être converti en l&#39;inosine (INO) oulier à différents types de récepteurs P1 ADO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Sang</td><td></td><td></td><td></td>humain</tr><tr><td>Eau Milli-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td>eau double désionisée</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>purifié anti-CD3, -CD14, -CD16</td><td>fabriqué maison souris</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>PE-labellisé anti-CD19</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>120-014-229</td><td></td></tr><tr><td>marqué FITC anti-CD5</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-574</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mouton anti-souris IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11031</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404-200TABS</td><td>comprimés</td></tr> sérum <tr><td>de bovin albumine (BSA)</td><td>ID bio</td><td>1000-70</td><td></td></tr><tr>tampon <td></td><td></td><td>d’isolement</td> de qualité standard <td>PBS 0,1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>AIM V sérum free medium</td><td>GIBCO</td><td>12055-091</td><td>liquide (qualité recherche)</td></tr><tr><td>adénosine 5'-diphosphate (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>adénosine 5'-monosphate (AMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>adénosine (ADO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>inosine (INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>& alpha ;,&beta ;-méthylène-ADP (APCP)</td><td>Inhibiteur de Sigma-Aldrich</td><td>M8386</td><td>CD73</td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’EHNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E114</td><td>Inhibiteur de l’adénosine désaminase</td></tr><tr><td>Déoxycoformycine (dCF)</td><td>Tocris</td><td>2033</td><td>Inhibiteur de l’adénosine désaminase</td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dipyridamole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9766</td><td>inhibiteur du transporteur de nucléosides</td></tr><tr><td>acétonitrile (CHROMASOLV Plus)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td> Acétate d’ammonium <td>de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9688</td><td>7 mM, pH 3,0</td></tr><tr><td>acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L</td><td>min. 37 %</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Catalog Numéro</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml ; Compteur de cellules</td><td>rker VWR</td><td>631-0920</td><td>hémocytomètre</td></tr><tr><td>DynaMag-15 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12301D</td><td>Séparateur magnétique de billes Dynal</td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes safe-lock</td><td>Eppendorf</td><td>030-120-0086</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en PET</td><td>Corning</td><td>430053/430304</td><td>15 &ndash ; 50 ml</td></tr><tr><td>Minisart RC4 filtres à seringue</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>17821</td><td>membrane 0.2 & micro ; m</td></tr><tr><td>flacons à filetage court</td><td>VWR</td><td>548-0029</td><td>1,5 ml/</td></tr><tr><td>micro-inserts</td> en verre <td>VWR</td><td>548-0006</td><td>0,1 ml/bouchons à vis en verre</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>548-0085</td><td>9 mm/PP bleu</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 Colonne</td><td>d’eau</td><td>186001344</td><td>5 &micro ; m, 4,6 mm x 150 mm</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 Colonne de garde</td><td>Eaux</td><td>186001323</td><td>5 & micro ; m, 4,6 mm x 20 mm</td></tr><tr>Module <td></td> de séparation <td></td><td>Waters Alliance 2965</td><td>Module de séparation HPLC</td></tr><tr><td>Waters 2998 Détecteur de photodiodes (PDA) Waters</td><td></td><td>Détecteur UV</td>Waters <td></td></tr><tr><td>Empower2</td><td>software Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

base hplc-assay pour surveiller extracellulaires nucleotide / nucléosidiques métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

Cette méthode décrit une chromatographie sensible, spécifique, fiable et reproductible en phase inverse liquide à haute performance (HPLC-RP) l&#39;essai développé et validé pour la quantification des nucleotides extracellulaires puriques et les nucléosides produites par purifiée leucémie lymphoïde chronique (CLL), les cellules dans différentes conditions de culture . La séparation chromatographique de l&#39;adénosine 5&#39;-monophosphate (AMP), l&#39;adénosine (ADO) et inosine (INO) est effectuée à la température ambiante sur une colonne en phase inverse à base de silice qui est utilisé pour la rétention du composé polaire. Le procédé comprend une phase mobile binaire, qui est constitué d&#39;acétate d&#39;ammonium à 7 mM et de l&#39;acétonitrile à un débit de 1,00 ml / min de débit. Les éluats sont surveillés à l&#39;aide d&#39;un détecteur UV Photodiode Array fixé à 260 nm. Une courbe d&#39;étalonnage est générée pour calculer l&#39;équation analytique pour la quantification de chaque composé de purine. le contrôle du système, l&#39;acquisition de données et l&#39;analyse sont ensuite effectuées. L&#39;application de ce protocole, AMP, INO et ADO éluent à 7, 11 et 11,9 min, respectivement, et le temps total de course pour chaque échantillon est de 20 min. Ce protocole peut être appliqué à différents types de cellules et de lignées cellulaires (à la fois en suspension et adhérents), en utilisant des milieux de culture comme matrice. Les avantages sont la préparation des échantillons faciles et rapides et que l&#39;exigence d&#39;une faible quantité de surnageant pour l&#39;analyse. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un milieu exempt de sérum permet de sauter l&#39;étape de précipitation des protéines avec de l&#39;acétonitrile qui influe sur la concentration finale des composés de purine. L&#39;une des limites de la méthode est l&#39;exigence de la colonne d&#39;équilibration exécuter avant chaque exécution d&#39;un seul échantillon, ce qui rend le temps total d&#39;exécution de l&#39;expérience plus longue et la prévention des applications de criblage à haut débit.

Pour évaluer le pourcentage (%) de cellules leucémiques dans les CMSP fraîchement purifiés à partir d&#39;un patient atteint de CLL représentative, les cellules sont marquées avec des anticorps anti-CD5 et anti-CD19. Le panneau de gauche de la figure 3 représente un tracé de points cytofluorimétrique avec une porte sélective sur des cellules vivantes. La figure 3 montre un exemple de PBMC d&#39;un patient CLL avant (panneau du milieu) et après ( à droite...

Le protocole décrit ici représente une méthode simple et reproductible qui utilise la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme des purines sur des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) cultivées dans différentes conditions.

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse pour quantifier le métabolisme des purines dans des cellules de leucémie lymphoïde chronique, ou LLC, mesurées dans différentes conditions de culture. Cette méthode a été utilisée pour déterminer quand et comment les cellules peuvent produire de l'adénosine dans l'environnement extracellulaire. Ceci constitue une question essentielle, car l'adénosine est à la fois une molécule cytoprotectrice et immunosuppressive.En outre, cette méthode nécessite un milieu de culture abondant et sa préparation simple est extrêmement facile. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons commencé à étudier le métabolisme des purines dans le microenvironnement tumoral. Et nous avons réalisé qu'il était essentiel de disposer d'une méthode simple et reproductible pour mesurer ce métabolisme à l'aide de cellules primaires.Effectuez une dilution de un à trois du sang total avec du tampon salin phosphate un x ou PBS à température ambiante ; cette étape est nécessaire pour obtenir des lymphocytes CLL purifiés. Ensuite, utilisez-les pour mesurer le métabolisme

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base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines (Vidéo) | JoVE Journal

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

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