Name: Mesure de temps de survie dans Brachionus Rotifères: Synchronisation des conditions maternelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Apprenez à mesurer le temps de survie chez les rotifères Brachionus en synchronisant les conditions maternelles sur plusieurs générations. Cette méthode reproductible améliore la puissance statistique pour les études sur le vieillissement.

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Nous sommes reconnaissants à George Jarvis, Martha Bock, et Bette Hecox-Lea, Laboratoire de biologie marine, pour leur aide dans le tournage.

1. Préparation des milieux Remarque: Utilisez la moitié diluée Brujewicz eau de mer artificielle de la salinité de 16,5 ppt (PSU). Autres seawaters artificiels sont aussi fréquemment utilisés pour la culture Brachionus rotifères 25,26. <ol><li> Ajouter du NaCl 454 mM, 26 mM de MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM de KCl et 10 mM de CaCl2 à 4,5 litres d&#39; eau distillée (volume final sera de 5 L). Vous pouvez également utiliser l&#39;eau de dilution désionisée au lieu de l&#39;eau distillée. Ajouter CaCl 2 après dissolution de tous les autres sels. </li><li> Préparer le M NaHCO3 solution stock 0,48 (concentration 200x). Ajouter 25 ml de celui-ci à la solution ci-dessus. La concentration finale de NaHCO 3 est de 2,4 mM. </li><li> Préparer le M NaBr solution mère 0,4 (concentration 500x). Ajouter 10 ml de celui-ci à la solution ci-dessus. La concentration finale de NaBr est de 0,8 mM. Compléter à 5 litres avec de l&#39;eau distillée. </li><li> On filtre la solution avec un filtre à membrane de 0,45 um.Diluer deux fois avec de l&#39;eau stérile avant utilisation (v / v). Note: Il est possible de faire une concentration de 2x de Brujewicz eau de mer artificielle comme une solution de stock. </li></ol> 2. Conditions générales Culture <ol><li> Culture laboratoire surélevé ou rotifères sauvages capturés dans un bécher de 100 ml stérile entre 20 et 30 ° C. Des températures plus élevées se traduisent par une durée de vie plus courte et la reproduction accélérée. Utiliser 25 ° C pour la commodité des expériences. La densité ou le volume d&#39;eau de mer artificielle rotifères est pas un gros problème ici. </li><li> Culture espèces de microalgues alimentaires dans l&#39; eau de mer artificielle 11. Voir Snell et al. (2014) pour plus de détails 11. En règle générale, utilisez Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellules / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellules / ml 25,29), et Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellules / ml 30,31). Depuis le régime alimentaire des algues (espèces, culture conditions, des compositions biochimiques) influe de manière significative le temps de survie des rotifères Brachionus, utiliser le même lot de microalgue dans tous les groupes expérimentaux. </li><li> Gardez une population stock de rotifères dans une culture discontinue en alimentant et en changeant les médias à l&#39; occasion (par exemple, nourrir tous les 2 jours et ensemencer chaque semaine). Beaucoup de nouveau-nés et les adultes portant 2-3 œufs peuvent être observés lorsque les rotifères sont dans des conditions optimales. Remarque: Une autre façon d&#39;obtenir des rotifères expérimentales est de faire éclore des oeufs de repos. Rotifères éclos à partir d&#39; oeufs de repos sont considérés comme étant bien synchronisés et leur durée de vie ne soit pas sensiblement différente de celle de rotifères à partir d&#39; œufs éclos amictiques 11. Cependant, rotifères à partir d&#39;œufs de repos commencent reproduction plus tôt que ceux des œufs amictiques. Ainsi, la prudence est nécessaire pour les mesures de leurs traits de reproduction. </li></ol> 3. Synchronisation des rotifères par pré-culture <ol><li> Sélectionnez un seul rotifères de la stla population et la culture ock comme décrit dans 2.1-2.3 pour établir une sous-population qui sera utilisé pour des expériences. Typiquement culture pendant deux semaines. </li><li> Collecter rotifères oeuvées de la sous-population (collecter un nombre double de personnes qui seront utilisés pour l&#39;expérience). Culture comme une seule cohorte (densité: ~ 50 individus / ml) dans une plaque de culture à 6 puits tel que décrit dans 2,1-2,3 dans un nouveau média dans l&#39; alimentation ad libitum. Contrôle de la densité de population est importante parce que le milieu conditionné affecte la physiologie de la reproduction des rotifères Brachionus 32,33. </li><li> Transfert des nouveau-nés éclos à partir des premiers oeufs des adultes aux milieux de culture nouvellement préparé. Répétez cette procédure sur 2-3 générations. </li><li> Utiliser le nouveau - né éclos dans un laps de temps donné (par exemple, &lt;3 h) pour mesurer le temps de survie. Pour éviter un biais possible dans le choix du seul individu, bien que très improbable, vérifier la reproductibilité en utilisant plusieurs indépensous-populations pendantes. Remarque: Comme les rotifères se reproduisent généralement asexuée sous cette condition, assurez-vous pas de mâles sont présents tout au long de l&#39;expérience. Les mâles sont plus petits que les nouveau-nés et se déplacent généralement plus vite que les femelles. Femelles Mictic ont des durées de vie différentes des femelles amictiques sous certaines conditions 29. </li></ol> 4. Les mesures de temps de survie <ol><li> La place dans les nouveau-nés des plaques en plastique (en général 24 ou 48 puits des plaques, avec chaque puits contenant 1 ml d&#39;eau de mer artificielle). </li><li> A intervalles de 24 heures, transférer les rotifères aux milieux de culture nouvellement préparés ou à des intervalles de 12 h si, à une température plus élevée (30 ° C ou au-dessus). Notez le nombre de descendants et si chaque individu est mort ou vivant. Notez le rotifères comme mort lorsque le mouvement des cils de la couronne est complètement arrêté. Nota: Les rotifères se fixent souvent sur les parois latérales des puits. pipetage doux de l&#39;eau aide à les trouver. Si rotifères sont introuvables ou are accidentellement endommagé par le pipetage, les enregistrer comme «censuré», non pas comme «mort». </li><li> Retirer les nouveau-nés lorsque rotifères expérimentales reproduisent activement. Les nouveau-nés grandissent rapidement et il est parfois difficile de les distinguer des rotifères expérimentales. </li></ol> Analyse 5. Données <ol><li> Créer la survie courbe de Kaplan-Meier (figures 1 et 2) en traçant le taux de survie cumulatif sur l&#39;axe et le temps Y sur l&#39;axe des X. Ceci est la représentation la plus courante de données de survie. Utilisez le test log-rank non-paramétrique (aussi appelé test de Mantel-Cox) pour comparaison statistique du temps de survie 34. Le test du log-rank est également inclus dans d&#39;autres progiciels statistiques standards tels que JMP et R. Note: Ne pas utiliser le test t ou une analyse de variance (ANOVA) suivie par comparaison multiple paramétrique de Student parce que la distribution normale est généralement pas satisfaite par les données de survie 35. En outre, ces méthods ne prennent pas les individus censurés en compte. test de Mann-Whitney U peut être utilisé s&#39;il n&#39;y a pas de données censurées. </li></ol>

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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+expression+of+manganese+superoxide+dismutase%2C+copper+and+zinc+superoxide+dismutase+and+catalase+in+Brachionus+calyciflorus+during+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process.</a> PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).</li>
<li>Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+inhibition+of+TOR+and+JNK+pathways+interacts+to+extend+the+lifespan+of+Brachionus+manjavacas+%28Rotifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera).</a> Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+nematode+Caenorhabditis-elegans+-+major+biological+and+environmental-factors+influencing+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span.</a> Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).</li>
<li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole actuel décrit un procédé pour mesurer le temps de survie chez les rotifères Brachionus. L&#39;étape critique est la synchronisation des conditions de rotifères sur plusieurs générations. Lorsque rotifères expérimentaux sont bien synchronisés, une courbe I de survie de type typique est observé avec très peu de mortalité précoce comme rapporté dans plusieurs études antérieures 18,24,37,38. Les écarts-types de leur temps de survie deviennent donc plus petit par rapport à rotifères synchroni...

Les rotifères sont microscopiques zooplancton cosmopolite (&lt;1 mm) qui constituent le phylum rotifères 1. Ils ont un plan de corps simple composé d&#39;environ 1000 cellules somatiques, ainsi qu&#39;un appareil de ciliaire de roue comme caractéristique appelée la couronne, qui est utilisé pour la locomotion et l&#39;alimentation. La plupart des rotifères appartiennent à des classes Monogononta ou Bdelloidea, qui contiennent environ 1.600 et 500 espèces, respectivement 2. Rotifères Monogonont ont généralement deux phases de la reproduction sexuée et asexuée (parthénogenèse cyclique), tandis que les rotifères bdelloides reproduisent par parthénogenèse obligatoire 3. Il est ainsi possible d&#39;obtenir des individus de rotifères génétiquement identiques, ce qui assure une grande reproductibilité des expériences. En outre, ils ont plusieurs autres avantages comme organismes modèles, comme une courte durée de vie, la facilité de la culture, la disponibilité des données de séquences génomiques et transcriptomiques 4-7, et une position phylogénétique unique , distante d&#39;unerthropods et nématodes 8. Les rotifères sont donc prometteurs modèles d&#39;invertébrés dans écologiques, toxicologiques et études sur le vieillissement 9-12. Le temps de survie en cas d&#39; exposition au stress ou à des produits chimiques de l&#39; environnement est un paramètre fréquemment mesurée dans ces domaines de recherche 13-19. Toutefois, la prudence est nécessaire lors de la mesure de la durée de survie des rotifères parce qu&#39;il est sensible aux conditions environnementales de leurs mères. A savoir, dans le monogonont Manjavacas rotifères Brachionus, progéniture femelle de mères âgées ont une durée de vie plus courte que celles des jeunes mères; Cependant, la restriction calorique maternelle (CR) compense partiellement les effets délétères de 20 l&#39; âge maternel avancé. Dans B. plicatilis, CR maternelle fournit la progéniture de la longévité, le temps de survie longtemps sous la famine, et de haute résistance au stress oxydatif associé à l&#39; expression accrue des enzymes antioxydantes 21,22. L&#39;effet de l&#39;âge maternela également été observée dans les rotifères bdelloides 23. Par conséquent, les conditions de rotifères expérimentales doivent être soigneusement synchronisées sur plusieurs générations avant que les mesures de temps de survie. Ici , nous fournissons un protocole pour la mesure du temps de survie en rotifères Brachionus suivant la synchronisation des conditions de culture sur plusieurs générations. Le jeûne intermittent (SI), une variation de CR où rotifères sont nourris régulièrement, a été appliquée pour révéler l&#39;effet de la synchronisation en raison des effets bien connus du SI sur la longévité 22,24.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Wako</td><td>190-13921</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Wako</td><td>136-03995</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Wako</td><td>131-00427</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Wako</td><td>168-22111</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Wako</td><td>035-00455</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de sodium</td><td>Wako</td><td>190-01515</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à membrane (0,45 & micro ; Plaque</td> de culture <td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr>, <tr><td>6 puits, non traitée</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D01</td> Plaque de culture <td>à fond plat</td></tr><tr><td>, 48 puits, non traitée</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D07</td><td>Tetraselmis à fond plat</td></tr><tr><td>, Living</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>152610</td><td></td></tr><tr><td>PRISM 6</td><td>GraphPad Software</td><td>Version 6.0d</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de temps de survie dans<em&gt; brachionus</em&gt; rotifères: synchronisation des conditions maternelles

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Rotifers sont des zooplanctons cosmopolites microscopiques utilisés comme modèles dans les études écotoxicologiques et sur le vieillissement en raison de leurs nombreux avantages tels que leur courte durée de vie, leur facilité de culture et leur parthénogenèse qui permet la culture clonale. Cependant, la prudence est de mise lors de la mesure de leur temps de survie, car il est affecté par l’âge maternel et les conditions d’alimentation maternelles. Nous fournissons ici un protocole pour une mesure puissante et reproductible du temps de survie chez les rotifères Brachionus suite à une synchronisation minutieuse des conditions de culture sur plusieurs générations. Empiriquement, une mauvaise synchronisation entraîne une mortalité précoce et une diminution progressive du taux de survie, ce qui entraîne une faible puissance statistique. En effet, dans de telles conditions, la restriction calorique (RC) n’a pas réussi à prolonger de manière significative la durée de vie de B. plicatilis, bien que la longévité induite par la RC ait été démontrée avec des échantillons de rotifères bien synchronisés dans des études passées et présentes. Ce protocole est probablement utile pour d’autres modèles d’invertébrés, y compris la mouche des fruits Drosophila melanogaster et le nématode Caenorhabditis elegans, car des effets sur l’âge maternel ont également été rapportés chez ces espèces.

La figure 1 montre les courbes de survie représentatives des populations mal synchronisées (sur deux répétitions). Dans cette expérience, les rotifères étaient soit tous les jours nourris [groupe ad libitum (AL)] ou tous les autres jours (IF groupe). La médiane de survie était de 13 et de 18 jours dans l&#39;AL et si des groupes, respectivement. Bien qu&#39;il soit bien connu que IF prolonge la durée de vie du rotifères, cette expérience n&#39;a pas réussi...

Les rotifères sont des zooplanctons microscopiques utilisés comme modèles dans les études écotoxicologiques et de vieillissement. Nous fournissons ici un protocole pour une mesure puissante et reproductible du temps de survie chez les rotifères Brachionus. La synchronisation des conditions de culture sur plusieurs générations est particulièrement importante car l’état maternel affecte le cycle vital de la progéniture.

Mesure de temps de survie dans<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotifères: Synchronisation des conditions maternelles

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer avec précision la durée de survie des rotifères Brachionus, en atténuant les effets délétères possibles des générations maternelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le vieillissement.En fournissant un moyen fiable de mesurer le temps de survie des rotifères. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est reproductible et possède une forte puissance statistique. Pour commencer, ajoutez à 4,5 litres d'eau de dilution distillée ou déionisée 454 millimolaire de chlorure de sodium, 26 millimolaire de chlorure de magnésium, 27 millimolaire de sulfate de magnésium, 10 millimolaire de chlorure de potassium et 10 millimolaire de chlorure de calcium.Préparez une solution mère de bicarbonate de sodium à 0,48 molaire. Ajoutez 25 millilitres de cette solution à la solution saline que vous venez de préparer. Préparez une solution mère de bromure de sodium à 0,4 molaire.Et ajouter dix millilitres de ce liquide à la solution saline. Ensuite, ajouter de l'eau distillée pour compléter la solution saline jusqu'à cinq litres. Puis, à l'aide d'une membrane filtrante de 0,45 micromètre, filtrer la solution.Pour cultiver des rotifères élevés en laboratoire ou capturés à l'état sauvage, placez-les dans un bécher stérile de 100 millilitres d'eau de mer artificielle, et faites-les croître à 25 degrés Celsius. Selon les méthodes de Snell, cultivez les espèces de microalgues alimentaires dans de l'eau de mer artificielle.Veiller à utiliser la même série de microalgues pour tous les groupes expérimentaux. Maintenir une population témoin de rotifères en culture par lots en les nourrissant tous les deux jours et en changeant le milieu chaque semaine.De nombreux néonates et adultes portant deux à trois œufs peuvent être observés lorsque les rotifères sont en conditions optimales. Pour synchroniser les rotifères par pré-culture, sélectionnez un seul rotifère dans la population témoin et mettez-le en culture dans de l’eau de mer artificielle dans un bécher de 100 millilitres comme décrit précédemment pendant environ deux semaines.Après l'incubation, collecter les rotifères porteurs d'œufs à partir du sous-groupe. Les cultiver comme un groupe cohorte unique en plaçant environ 50 rotifères par millilitre d'eau de mer dans les puits d'une plaque à six puits, et les nourrir ad libitum. Lorsque les œufs auront éclos, transférer les néonates dans un milieu de culture fraîchement préparé.Répétez la culture et le transfert des néonates sur deux à trois générations. Pour mesurer la durée de survie, placez les néonates éclos au cours d'une période de trois heures dans les puits de plaques de 24 ou 48 puits contenant un millilitre d'eau de mer artificielle. À des intervalles de 12 ou 24 heures, transférez les rotifères dans un milieu de culture fraîchement préparé.Enregistrez le nombre de descendants et indiquez si chaque individu est mort ou vivant. Considérez le rotifère comme mort lorsque le mouvement des cils de la couronne s'est complètement arrêté. Lorsque les rotifères expérimentaux se reproduisent activement, retirez les néonates, car ils grandissent rapidement et peuvent parfois être difficiles à distinguer des rotifères expérimentaux.Effectuer l'analyse des données conformément au protocole décrit. Cette figure présente les courbes de survie provenant de deux réplicats de populations de rotifères faiblement synchronisées. Alimentées soit ad libitum, indiquées comme A-L, soit un jour sur deux, indiquées comme jeûne intermittent, J-I.La survie médiane était respectivement de 13 et 18 jours dans les deux groupes. Bien qu'il soit bien établi que le jeûne intermittent prolonge la durée de vie du rotifère, les différences n'étaient pas statistiquement significatives. Dans cette expérience, les conditions d'élevage des rotifères étaient optimales et bien synchronisées.Et les animaux avaient tendance à survivre jusqu'à la phase ultérieure de l'expérience. La survie médiane était de 13 jours pour les rotifères AL et de 20 jours pour les groupes IF. Cette différence était statistiquement significative.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de synchroniser les conditions des rotifères. Nous espérons que ce protocole améliorera l'utilisation des rotifères, organisme modèle, dans la recherche sur le vieillissement.

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Apprenez à mesurer le temps de survie chez les rotifères Brachionus en synchronisant les conditions maternelles sur plusieurs générations. Cette méthode reproductible améliore la puissance statistique pour les études sur le vieillissement.

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