Name: Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez le marquage par spin dirigé et la spectroscopie RPE pour étudier la dynamique des canaux ioniques pentamériques. Cette méthode permet d'analyser les grandes protéines membranaires dans leur environnement lipidique physiologique.

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Nous sommes très reconnaissants envers les membres actuels et anciens du laboratoire Chakrapani pour la lecture et les commentaires critiques sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health subvention (1R01GM108921) et l&#39;American Heart Association (NCRP scientifique de développement Grant 12SDG12070069) et de SC.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

spectroscopie EPR est avérée être une approche structurelle sans précédent dans la quantification des changements conformationnels de protéines membranaires dans un environnement quasi-native. Cette approche nous permet un coup d&#39;oeil dans les détails moléculaires de la dynamique des protéines qui sont obscurcis dans des structures à haute résolution de la cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique. Cependant, il est important de tenir compte des limites techniques de cette approche qui peut affe...

Au cours de la dernière décennie, la compréhension structurale des canaux ligand-dépendants pentamères ion (pLGIC) a augmenté à pas de géant, en raison de multitudes de structures à haute résolution de plusieurs membres de la famille. Les principaux facteurs qui ont conduit à des avancées actuelles dans le domaine comprennent, la découverte des canaux de pLGIC procaryotes, 1-3 grands progrès dans eucaryote expression de la protéine de la membrane, 4-6 et d&#39; énormes percées dans les approches de détermination de la structure. 7 Ces structures fournissent un consensus clair sur la conservation d&#39;ensemble de l&#39;architecture tridimensionnelle de pLGIC. Toutefois, deux grands domaines qui semblent traîner derrière sont la caractérisation fonctionnelle de ces préparations de canal et la description mécaniste de la fonction du canal. Gating changements conformationnels sont complexes et ont lieu sur une distance de 60 Å le long de la longueur du canal, et que ces transitions sont largement modulés parles lipides membranaires. En particulier, les lipides négatifs, le cholestérol et les phospholipides ont été montrés pour moduler la fonction de pLGIC 11/08. Bien que le rôle précis de ces constituants lipidiques en fonction du canal reste inconnue, une compréhension moléculaire complète de déclenchement, il faudrait étudier ces canaux dans leur environnement natif. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) et résonance paramagnétique électronique (RPE) sont les techniques de choix pour l&#39;étude de la dynamique des protéines dans les systèmes reconstitués. La spectroscopie EPR ne soit pas limitée par la taille moléculaire (comme RMN) ou de la propriété optique de l&#39;échantillon (comme la spectroscopie de fluorescence) et permet ainsi des mesures de constructions de longueur complète dans des conditions reconstituées de lipides d&#39;origine. La technique est extrêmement sensible et a des exigences de l&#39;échantillon relativement faible (dans la gamme pico-mole). Ces deux aspects font la technique bien adaptée à l&#39;étude de grandes protéines membranaires qui sont difficiles à exprimer dans plus de milligrammequantités. L&#39;utilisation de la spectroscopie EPR en combinaison avec dirigée marquage de spin a été développé par Wayne Hubbell et ses collègues, et a été adapté pour étudier une gamme de types de protéines. 12-24 données EPR ont été utilisées pour étudier les structures secondaires, les changements dans la protéine conformation, la profondeur d&#39;insertion de membrane et la protéine-protéine / interactions protéine-ligand. Le procédé implique la substitution de la cystéine à des positions d&#39;intérêt par mutagénèse dirigée sur un site. Pour garantir un étiquetage spécifique au site, il est nécessaire de remplacer les cysteines natives avec un autre acide aminé (par exemple., Serine) pour créer un modèle de cystéine moins. De loin, l&#39;étiquette la plus populaire de spin est un MTSL thiol-spécifique: (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-Δ3-pyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonate qui se fixe à la protéine par un pont de liaison disulfure. En raison de sa haute spécificité, la taille relativement petite (légèrement plus grand que le tryptophane), et flexibilité de la région de liaison, ce marqueur de spin a été démontré qu&#39;ils ont une excellente réactivité, même avec une cystéine enterrée. En outre, pour maximiser la réactivité, la réaction de marquage de la protéine est réalisée sous la forme d&#39;un détergent solubilisé. Après séparation de l&#39;excès libre spin-label par chromatographie d&#39;exclusion stérique, la protéine est reconstituée dans des liposomes ou des systèmes bicouches mimant la composition lipidique définie. En général, la cystéine mutagenèse est bien toléré dans la plupart des parties de la protéine, et la taille relativement petite du spin-sonde provoque une perturbation minimale pour les structures secondaires et tertiaires. Faire en sorte que la modification a conservé des fonctions de type sauvage, les canaux marqués et reconstitués peuvent être étudiés par des mesures de patch-clamp. La protéine marquée-fonctionnelle est ensuite soumis à des mesures spectroscopiques, qui fournissent essentiellement trois principaux types d&#39;information: 12,14,15,20,22,23,25-27 dynamique spin-sonde par lineshanalyse singe; l&#39;accessibilité de la sonde à des agents de relaxation paramagnétique; et la distance distribution. 27 distances EPR sont mesurées par deux approches différentes. La première est basée sur la vague (CW) technique continu, où l&#39; élargissement spectral résultant d&#39;interactions dipolaires entre spin-étiquettes (dans le 8 - Une gamme de 20 à distance). Est utilisé pour déterminer la distance 28,29 Le second est un pulsé EPR méthode où les mesures de distance peuvent être étendues jusqu&#39;à 70 Å. 30-34 en Double Electron Electron Resonance (CERF), les oscillations de l&#39;amplitude d&#39;écho de spin sont analysés afin de déterminer les distances et les distributions de distance. Ici, l&#39;écho de spin est modulé à la fréquence de l&#39;interaction dipolaire. Ensemble, ces paramètres sont utilisés pour déterminer la protéine topologie, les éléments structuraux secondaires, et les changements de protéines conformationnelle.

<table><tbody><tr><td>Mutagénèse dirigée et mutations</td><td></td><td></td><td></td>Cys</tr><tr><td>10x tampon de réaction PfuUltra HF</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>N0447L</td><td>10 mM chacun dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polymérase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2,5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>R0176S</td><td>20 000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC media</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB média</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 cellules compétentes</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expression et purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-thio-&beta ;-galactoside)</td><td>Or Biotechnologie</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Résine amylose</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de chromatographie vide en polypropylène</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Étiquetage par centrifugation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-3-pyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acétoxy-2,2,5,5-tétraméthyl-&Delta ; 3-pyrroline-3-méthyl)méthanethisiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectine</td><td>lipidique Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobilles (billes de polystyrine)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Produits chimiques Fisher</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine-maléimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine-maléimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti lipides polaires Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti lipides polaires Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli extrait lipidique polaire</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Mesure</td><td></td><td></td><td></td>EPR</tr><tr><td>Capillaires en plastique TPX</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

site réalisé Étiquetage spin et epr spectroscopiques études de pentamères ligand-gated ion channels

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Le gate des canaux ioniques est une orchestration des mouvements des protéines induite par un stimulus qui conduit à des transitions entre les états fermés, ouverts et désensibilisés. La flexibilité intrinsèque de la protéine, qui est modulée de manière critique par la composition lipidique membranaire, est fondamentale pour ces transitions. Pour mieux comprendre la base structurelle de la fonction des canaux, il est nécessaire d’étudier la dynamique des protéines dans un environnement membranaire physiologique. La spectroscopie par résonance paramagnétique électronique (EPR) est un outil important pour caractériser les transitions conformationnelles entre les états fonctionnels. Par rapport à la RMN et à la cristallographie aux rayons X, les informations obtenues à partir de l’EPR sont intrinsèquement de plus faible résolution. Cependant, contrairement à d’autres techniques, dans l’EPR, il n’y a pas de limite supérieure au poids moléculaire de la protéine, les besoins en échantillon sont nettement inférieurs et, plus important encore, la protéine n’est pas contrainte par les forces du réseau cristallin. Par conséquent, l’EPR est particulièrement adapté à l’étude de grands complexes protéiques et de protéines dans des systèmes reconstitués. Dans cet article, nous aborderons les protocoles généraux pour le marquage de spin dirigé et la reconstitution membranaire en utilisant un canal ionique ligand-dépendant pentamère procaryote procaryote (pLGIC) de Gloeobacter violaceus (GLIC) à titre d’exemple. Une combinaison d’approches EPR à ondes continues (CW) et pulsées (double résonance électronique électronique-DEER) sera décrite qui permettra une caractérisation quantitative complète de la dynamique des canaux.

Caractérisation biochimique des Mutants GLIC Spin marqué En suivant le protocole décrit ci-dessus serait typiquement donner GLIC-MBP protéine de fusion dans la gamme de 10 - 12 mg / litre de culture. Bien que cette valeur peut varier entre les différents mutants, en particulier pour les positions enterrées dans la protéine, le rendement peut être considérablement compromise. Dans ces cas, les volumes de cultur...

Cet article décrit les méthodes de marquage de spin dirigé par site et de reconstitution des canaux pentamères ligand-dépendants pour les études de résonance paramagnétique électronique. Ce protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine membranaire. La méthode de reconstitution décrite ici peut également être utilisée pour des mesures par patch-clamp de courants macroscopiques et monocanaux dans un système lipidique défini.

Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la purification, le marquage par spin dirigé sur site et la reconstitution d'un canal ionique ligand-dépendant pentamérique pour des études par résonance paramagnétique électronique. L'étude de la dynamique des protéines membranaires dans un environnement physiologiquement pertinent est cruciale pour comprendre pleinement le fonctionnement de cette protéine de transport membranaire. Et en raison de ces besoins, je pense que le marquage par spin dirigé sur site et la technique de RPE sont particulièrement adaptés.Le principal avantage de cette technique est qu'il n'est pas limité par la taille de la protéine. Par conséquent, le marquage paramagnétique dirigé et la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) constitueraient une méthode de choix si vous souhaitez étudier la dynamique de protéines de grande taille ou des protéines réconstituées dans des membranes. Introduisez des mutations uniques de la cystéine dans le gène GLIC par mutagenèse dirigée.Préparer une culture de nuit du mutant de la GLIC porteur d'une cystéine, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, ajouter 100 millilitres de tampon stérile de ph

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Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l'extrémité C-terminale pleine longueur de l'ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L'extension et l'application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.

Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants

Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Ce protocole présente une méthode de mesure de la liaison des nucléotides adénine aux récepteurs en temps réel dans un environnement cellulaire. La liaison est mesurée par le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) entre les dérivés nucléotidiques du trinitrophényle et la protéine marquée avec un acide aminé fluorescent non canonique.

Mesure de la liaison des nucléotides aux protéines membranaires fonctionnelles intactes en temps réel

Un protocole pour l’application de la spectroscopie RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter les interactions inter- et intramoléculaires faibles et transitoires dans les protéines intrinsèquement désordonnées est présenté.

Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

Ce protocole présente les outils disponibles pour la modélisation de ligands de petites molécules dans les cartes cryoEM des macromolécules.

Modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique

L’électrophysiologie est la référence pour l’étude de l’activité des canaux ioniques. Cependant, il existe de nombreuses approches alternatives, y compris les méthodes optiques. Ici, nous décrivons une méthode pour surveiller l’activité de la répétition riche en leucine contenant des canaux anioniques formés à 8 canaux (LRRC8) à l’aide d’une méthode basée sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) inter-sous-unités.

Surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (LRRC8/VRAC) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Förster à émission sensibilisée (SE-FRET)

Découvrez le marquage par spin dirigé et la spectroscopie RPE pour étudier la dynamique des canaux ioniques pentamériques. Cette méthode permet d'analyser les grandes protéines membranaires dans leur environnement lipidique physiologique.

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