Name: Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez le marquage par spin dirigé et la spectroscopie RPE pour étudier la dynamique des canaux ioniques pentamériques. Cette méthode permet d'analyser les grandes protéines membranaires dans leur environnement lipidique physiologique.

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Nous sommes très reconnaissants envers les membres actuels et anciens du laboratoire Chakrapani pour la lecture et les commentaires critiques sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health subvention (1R01GM108921) et l&#39;American Heart Association (NCRP scientifique de développement Grant 12SDG12070069) et de SC.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

spectroscopie EPR est avérée être une approche structurelle sans précédent dans la quantification des changements conformationnels de protéines membranaires dans un environnement quasi-native. Cette approche nous permet un coup d&#39;oeil dans les détails moléculaires de la dynamique des protéines qui sont obscurcis dans des structures à haute résolution de la cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique. Cependant, il est important de tenir compte des limites techniques de cette approche qui peut affe...

Au cours de la dernière décennie, la compréhension structurale des canaux ligand-dépendants pentamères ion (pLGIC) a augmenté à pas de géant, en raison de multitudes de structures à haute résolution de plusieurs membres de la famille. Les principaux facteurs qui ont conduit à des avancées actuelles dans le domaine comprennent, la découverte des canaux de pLGIC procaryotes, 1-3 grands progrès dans eucaryote expression de la protéine de la membrane, 4-6 et d&#39; énormes percées dans les approches de détermination de la structure. 7 Ces structures fournissent un consensus clair sur la conservation d&#39;ensemble de l&#39;architecture tridimensionnelle de pLGIC. Toutefois, deux grands domaines qui semblent traîner derrière sont la caractérisation fonctionnelle de ces préparations de canal et la description mécaniste de la fonction du canal. Gating changements conformationnels sont complexes et ont lieu sur une distance de 60 Å le long de la longueur du canal, et que ces transitions sont largement modulés parles lipides membranaires. En particulier, les lipides négatifs, le cholestérol et les phospholipides ont été montrés pour moduler la fonction de pLGIC 11/08. Bien que le rôle précis de ces constituants lipidiques en fonction du canal reste inconnue, une compréhension moléculaire complète de déclenchement, il faudrait étudier ces canaux dans leur environnement natif. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) et résonance paramagnétique électronique (RPE) sont les techniques de choix pour l&#39;étude de la dynamique des protéines dans les systèmes reconstitués. La spectroscopie EPR ne soit pas limitée par la taille moléculaire (comme RMN) ou de la propriété optique de l&#39;échantillon (comme la spectroscopie de fluorescence) et permet ainsi des mesures de constructions de longueur complète dans des conditions reconstituées de lipides d&#39;origine. La technique est extrêmement sensible et a des exigences de l&#39;échantillon relativement faible (dans la gamme pico-mole). Ces deux aspects font la technique bien adaptée à l&#39;étude de grandes protéines membranaires qui sont difficiles à exprimer dans plus de milligrammequantités. L&#39;utilisation de la spectroscopie EPR en combinaison avec dirigée marquage de spin a été développé par Wayne Hubbell et ses collègues, et a été adapté pour étudier une gamme de types de protéines. 12-24 données EPR ont été utilisées pour étudier les structures secondaires, les changements dans la protéine conformation, la profondeur d&#39;insertion de membrane et la protéine-protéine / interactions protéine-ligand. Le procédé implique la substitution de la cystéine à des positions d&#39;intérêt par mutagénèse dirigée sur un site. Pour garantir un étiquetage spécifique au site, il est nécessaire de remplacer les cysteines natives avec un autre acide aminé (par exemple., Serine) pour créer un modèle de cystéine moins. De loin, l&#39;étiquette la plus populaire de spin est un MTSL thiol-spécifique: (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-Δ3-pyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonate qui se fixe à la protéine par un pont de liaison disulfure. En raison de sa haute spécificité, la taille relativement petite (légèrement plus grand que le tryptophane), et flexibilité de la région de liaison, ce marqueur de spin a été démontré qu&#39;ils ont une excellente réactivité, même avec une cystéine enterrée. En outre, pour maximiser la réactivité, la réaction de marquage de la protéine est réalisée sous la forme d&#39;un détergent solubilisé. Après séparation de l&#39;excès libre spin-label par chromatographie d&#39;exclusion stérique, la protéine est reconstituée dans des liposomes ou des systèmes bicouches mimant la composition lipidique définie. En général, la cystéine mutagenèse est bien toléré dans la plupart des parties de la protéine, et la taille relativement petite du spin-sonde provoque une perturbation minimale pour les structures secondaires et tertiaires. Faire en sorte que la modification a conservé des fonctions de type sauvage, les canaux marqués et reconstitués peuvent être étudiés par des mesures de patch-clamp. La protéine marquée-fonctionnelle est ensuite soumis à des mesures spectroscopiques, qui fournissent essentiellement trois principaux types d&#39;information: 12,14,15,20,22,23,25-27 dynamique spin-sonde par lineshanalyse singe; l&#39;accessibilité de la sonde à des agents de relaxation paramagnétique; et la distance distribution. 27 distances EPR sont mesurées par deux approches différentes. La première est basée sur la vague (CW) technique continu, où l&#39; élargissement spectral résultant d&#39;interactions dipolaires entre spin-étiquettes (dans le 8 - Une gamme de 20 à distance). Est utilisé pour déterminer la distance 28,29 Le second est un pulsé EPR méthode où les mesures de distance peuvent être étendues jusqu&#39;à 70 Å. 30-34 en Double Electron Electron Resonance (CERF), les oscillations de l&#39;amplitude d&#39;écho de spin sont analysés afin de déterminer les distances et les distributions de distance. Ici, l&#39;écho de spin est modulé à la fréquence de l&#39;interaction dipolaire. Ensemble, ces paramètres sont utilisés pour déterminer la protéine topologie, les éléments structuraux secondaires, et les changements de protéines conformationnelle.

<table><tbody><tr><td>Mutagénèse dirigée et mutations</td><td></td><td></td><td></td>Cys</tr><tr><td>10x tampon de réaction PfuUltra HF</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>N0447L</td><td>10 mM chacun dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polymérase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2,5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>R0176S</td><td>20 000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC media</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB média</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 cellules compétentes</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expression et purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-thio-&beta ;-galactoside)</td><td>Or Biotechnologie</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Résine amylose</td><td>New England BioLabs Inc&lrm ;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de chromatographie vide en polypropylène</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Étiquetage par centrifugation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthyl-3-pyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acétoxy-2,2,5,5-tétraméthyl-&Delta ; 3-pyrroline-3-méthyl)méthanethisiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectine</td><td>lipidique Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobilles (billes de polystyrine)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Produits chimiques Fisher</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine-maléimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine-maléimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti lipides polaires Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti lipides polaires Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli extrait lipidique polaire</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Mesure</td><td></td><td></td><td></td>EPR</tr><tr><td>Capillaires en plastique TPX</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

site réalisé Étiquetage spin et epr spectroscopiques études de pentamères ligand-gated ion channels

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Le gate des canaux ioniques est une orchestration des mouvements des protéines induite par un stimulus qui conduit à des transitions entre les états fermés, ouverts et désensibilisés. La flexibilité intrinsèque de la protéine, qui est modulée de manière critique par la composition lipidique membranaire, est fondamentale pour ces transitions. Pour mieux comprendre la base structurelle de la fonction des canaux, il est nécessaire d’étudier la dynamique des protéines dans un environnement membranaire physiologique. La spectroscopie par résonance paramagnétique électronique (EPR) est un outil important pour caractériser les transitions conformationnelles entre les états fonctionnels. Par rapport à la RMN et à la cristallographie aux rayons X, les informations obtenues à partir de l’EPR sont intrinsèquement de plus faible résolution. Cependant, contrairement à d’autres techniques, dans l’EPR, il n’y a pas de limite supérieure au poids moléculaire de la protéine, les besoins en échantillon sont nettement inférieurs et, plus important encore, la protéine n’est pas contrainte par les forces du réseau cristallin. Par conséquent, l’EPR est particulièrement adapté à l’étude de grands complexes protéiques et de protéines dans des systèmes reconstitués. Dans cet article, nous aborderons les protocoles généraux pour le marquage de spin dirigé et la reconstitution membranaire en utilisant un canal ionique ligand-dépendant pentamère procaryote procaryote (pLGIC) de Gloeobacter violaceus (GLIC) à titre d’exemple. Une combinaison d’approches EPR à ondes continues (CW) et pulsées (double résonance électronique électronique-DEER) sera décrite qui permettra une caractérisation quantitative complète de la dynamique des canaux.

Caractérisation biochimique des Mutants GLIC Spin marqué En suivant le protocole décrit ci-dessus serait typiquement donner GLIC-MBP protéine de fusion dans la gamme de 10 - 12 mg / litre de culture. Bien que cette valeur peut varier entre les différents mutants, en particulier pour les positions enterrées dans la protéine, le rendement peut être considérablement compromise. Dans ces cas, les volumes de cultur...

Cet article décrit les méthodes de marquage de spin dirigé par site et de reconstitution des canaux pentamères ligand-dépendants pour les études de résonance paramagnétique électronique. Ce protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine membranaire. La méthode de reconstitution décrite ici peut également être utilisée pour des mesures par patch-clamp de courants macroscopiques et monocanaux dans un système lipidique défini.

Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la purification, le marquage par spin dirigé sur site et la reconstitution d'un canal ionique ligand-dépendant pentamérique pour des études par résonance paramagnétique électronique. L'étude de la dynamique des protéines membranaires dans un environnement physiologiquement pertinent est cruciale pour comprendre pleinement le fonctionnement de cette protéine de transport membranaire. Et en raison de ces besoins, je pense que le marquage par spin dirigé sur site et la technique de RPE sont particulièrement adaptés.Le principal avantage de cette technique est qu'il n'est pas limité par la taille de la protéine. Par conséquent, le marquage paramagnétique dirigé et la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) constitueraient une méthode de choix si vous souhaitez étudier la dynamique de protéines de grande taille ou des protéines réconstituées dans des membranes. Introduisez des mutations uniques de la cystéine dans le gène GLIC par mutagenèse dirigée.Préparer une culture de nuit du mutant de la GLIC porteur d'une cystéine, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, ajouter 100 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium au milieu de terrifique bouillon stérilisé par autoclavage. Puis, ajouter du glucose stérile, de la kanamycine et 10 millilitres de la culture de nuit.Incuber à 37 degrés Celsius dans un agitateur à 250 tr/min. Ajouter 50 millilitres de glycérol et continuer à agiter la culture jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 1,0 à 1,2. Après induction des cellules avec 200 micromolaire de IPTG, réinitialiser l'agitateur à 250 tr/min et poursuivre l'incubation pendant environ 16 heures à 18 degrés Celsius.Récupérez les cellules dans des bouteilles de centrifugeuse d’un litre en centrifugeant à 8500 fois G, à 4 degrés Celsius, pendant 15 minutes. Versez le surnageant et pesez la bouteille contenant le culot cellulaire comme décrit dans le protocole écrit. Resuspendez le culot bactérien dans 150 millilitres de tampon A glacé par litre de culture.Homogénéisez les cellules en les faisant passer dans un disrupteur cellulaire dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Répétez le processus trois fois afin que la majorité des bactéries soit lysée. Centrifugez les cellules à 14 000 ×g pendant 15 minutes.Ensuite, prélevez le surnageant à la pipette et transférez-le dans un tube de centrifugation propre. Après avoir centrifugé le surnageant à 168 000 ×g pendant une heure, décantez soigneusement le surnageant sans perturber le culot membranaire. Récupérez le culot membranaire provenant d'un litre de culture et resuspendez-le dans le tampon A, supplémenté avec 10 % de glycérol, jusqu'à un volume final de 50 millilitres.Ajouter 0,5 gramme de DDM à la suspension membranaire et agiter doucement pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après la solubilisation des membranes, éliminer les débris cellulaires du lysat par centrifugation à 168 000 ×g pendant une heure. Pendant ce temps, préparer la résine amylose.Transférez trois millilitres de résine à l’aide d’une pipette dans une colonne de chromatographie en polypropylène vide. Lavez la résine en faisant passer 10 volumes de lit d’eau trois fois, puis 10 volumes de lit de tampon A, contenant du DDM à 0,5 millimolaire. Après centrifugation, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et transférez-le dans un tube conique propre de 50 millilitres.Pour la liaison par lots, ajoutez la résine amylose pré-équilibrée dans le tube conique. Liez la protéine extraite à la résine amylose en agitant doucement le mélange pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, faites passer toute la suspension à travers une colonne de chromatographie et récupérez l'écoulement.Diluez la protéine GLIC avec 10 millilitres de tampon A contenant 40 millimolaire de maltose en plus de 0,5 millimolaire de DDM et de 0,5 millimolaire de TCEP. Le TCEP empêche l'oxydation des chaînes latérales de cystéine. Récupérez tout l'éluat.Concentrer la protéine élutée à l’aide d’un concentrateur centrifuge à une concentration comprise entre quatre et six milligrammes par millilitre. Ajouter la protéase HRV 3C et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Pour effectuer le marquage par spin dirigé par site, ajouter d’abord un excès molaire dix fois supérieur d’étiquette de spin MTSL à l’échantillon digéré par la protéase, afin d’obtenir un rapport molaire monomère GLIC/MTSL de 1:10.Après une heure d'incubation, ajouter un excès molaire cinq fois supérieur d'étiquette paramagnétique et incuber pendant une heure supplémentaire. Faire passer l'échantillon à travers une colonne de chromatographie d'exclusion stérique en liquide rapide, ou FPLC, prééquilibrée avec le tampon A et 0,5 millimolaire de DDM afin de séparer la balise MBP clivée et l'excès d'étiquette paramagnétique libre des pentamères de GLIC. Concentrer la solution protéique à l'aide d'un concentrateur centrifuge jusqu'à une concentration finale d'environ huit à dix milligrammes par millilitre, puis placer la solution sur de la glace.L'échantillon est désormais prêt à être reconstitué. Pour préparer les liposomes, rincez un flacon rond propre de 25 millilitres avec cinq millilitres de chloroforme et séchez le flacon sous un courant d'azote gazeux dans la hotte. Ensuite, transférez 10 milligrammes d'asolectine dans le flacon et séchez les lipides sous un courant continu d'azote gazeux.Lorsque le chloroforme s'est évaporé, placez le flacon sous vide pendant une heure afin de garantir un séchage complet. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de reconstitution A au lipide sec et vortexez vigoureusement le flacon pour mettre le culot lipidique en suspension. Pour préparer des vésicules unilamellaires petites, soniquez la suspension lipidique dans un bain ultrasons refroidi jusqu'à ce que la solution de vésicules devienne plus ou moins translucide et qu'aucun agrégat ne soit observé.À ce mélange, ajouter du DDM pour obtenir une concentration finale de quatre millimolaire et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Pour reconstituer la protéine, ajouter la protéine purifiée au mélange lipidique. Après incubation de l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant une heure sous agitation douce, diluer l'échantillon à 15 millilitres avec le tampon A. Éliminer le détergent résiduel dans la suspension à l'aide de billes de polystyrène munies de pores hydrophobes qui piègent le détergent.Ajouter 80 milligrammes de billes propres et incuber la suspension de liposomes toute la nuit sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, transférer le liposome dans un tube d'ultracentrifugation de 25 millilitres à l'aide d'un filtre en colonne pour éliminer les billes, puis diluer davantage l'échantillon jusqu'à 25 millilitres. Après centrifugation des échantillons à 168 000 ×g pendant deux heures, décantation du surnageant et remise en suspension du culot à l'aide de 100 microlitres de tampon B. Pour réaliser une spectroscopie EPR en onde continue, transférer d'abord la suspension de liposomes dans un tube de 200 microlitres et centrifuger les échantillons pour former un culot.Après avoir éliminé le surnageant, l'échantillon est prêt pour les mesures de RPE. Retirez autant de tampon que possible de l'échantillon de liposomes. Pour effectuer l'échange de tampon, transférez 20 microlitres du culot de liposomes dans un tube microcentrifuge à l’aide d’une pipette.Ajouter 180 microlitres de tampon D et incuber à 42 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifuger l'échantillon, éliminer le surnageant à l'aide d'une pipette et répéter le processus trois fois afin de garantir un échange complet de tampon. Des capillaires en plastique perméables aux gaz sont adaptés aux mesures des formes des raies spectrales ainsi qu'à l'accessibilité du solvant.Appuyez sur la capillarité contre le protéoliposome en pellet pour aspirer l'échantillon à l'intérieur, puis scellez l'extrémité avec de la cire osseuse. On observe ici la caractérisation biochimique de mutants de GLIC marqués par un spin, obtenue par chromatographie de filtration sur gel de GLIC marqué par un spin après clivage protéolytique du marqueur MBP. Les pics correspondent au pentamère de GLIC et au MBP libre.Le gel SDS-PAGE montre la protéine de fusion monomérique GLIC-MBP non clivée avant la filtration sur gel, ainsi que les fractions MBP et GLIC recueillies après filtration sur gel. Un dosage basé sur la FRET a été réalisé pour surveiller l'état d'agrégation du GLIC réconstitué dans divers lipides membranaires. Des mesures de FRET ont été effectuées sur les échantillons après une nuit de réconstitution et après plusieurs cycles de congélation-décongélation des échantillons.Dans une configuration « inside-out » excisée à partir de vésicules de asolectine reconstituées, GLIC est activé par des sauts de pH à l’aide d’un échangeur de solution rapide. Les canaux s’activent en environ 10 millisecondes et se désensibilisent avec une constante de temps d’une à trois secondes. Des réarrangements structuraux sont observés durant l’activation du canal.Ici, les spectres de résonance paramagnétique électronique en onde continue pour une position de l'hélice M2 bordant le pore montrent des changements d'amplitude et de forme en réponse à des variations de pH. La spectroscopie de résonance paramagnétique électronique est une approche structurelle inégalée pour mesurer les changements conformationnels des protéines membranaires dans leur environnement natif, et elle permet d'observer des détails moléculaires de la dynamique des protéines qui restent invisibles dans les structures tridimensionnelles à haute résolution obtenues par cristallographie aux rayons X ou par microscopie électronique cryogénique. Lors de l'utilisation de cette technique, il est important de garder à l'esprit que les mutations entraînent souvent une faible stabilité oligomérique de la protéine.Par conséquent, vous devrez peut-être élaborer une stratégie pour faire face à ces problèmes. La combinaison de ces résultats issus des études de RPE avec les mesures fonctionnelles peut nous fournir une image plus complète pour étudier la relation structure-fonction, et les progrès technologiques futurs visent à utiliser cette approche puissante pour étudier des canaux humains plus complexes dans des conditions lipidiques plus sophistiquées.

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