Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la purification, le marquage par spin dirigé sur site et la reconstitution d'un canal ionique ligand-dépendant pentamérique pour des études par résonance paramagnétique électronique. L'étude de la dynamique des protéines membranaires dans un environnement physiologiquement pertinent est cruciale pour comprendre pleinement le fonctionnement de cette protéine de transport membranaire. Et en raison de ces besoins, je pense que le marquage par spin dirigé sur site et la technique de RPE sont particulièrement adaptés.

Le principal avantage de cette technique est qu'il n'est pas limité par la taille de la protéine. Par conséquent, le marquage paramagnétique dirigé et la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) constitueraient une méthode de choix si vous souhaitez étudier la dynamique de protéines de grande taille ou des protéines réconstituées dans des membranes. Introduisez des mutations uniques de la cystéine dans le gène GLIC par mutagenèse dirigée.

Préparer une culture de nuit du mutant de la GLIC porteur d'une cystéine, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, ajouter 100 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium au milieu de terrifique bouillon stérilisé par autoclavage. Puis, ajouter du glucose stérile, de la kanamycine et 10 millilitres de la culture de nuit.

Incuber à 37 degrés Celsius dans un agitateur à 250 tr/min. Ajouter 50 millilitres de glycérol et continuer à agiter la culture jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 1,0 à 1,2. Après induction des cellules avec 200 micromolaire de IPTG, réinitialiser l'agitateur à 250 tr/min et poursuivre l'incubation pendant environ 16 heures à 18 degrés Celsius.

Récupérez les cellules dans des bouteilles de centrifugeuse d’un litre en centrifugeant à 8500 fois G, à 4 degrés Celsius, pendant 15 minutes. Versez le surnageant et pesez la bouteille contenant le culot cellulaire comme décrit dans le protocole écrit. Resuspendez le culot bactérien dans 150 millilitres de tampon A glacé par litre de culture.

Homogénéisez les cellules en les faisant passer dans un disrupteur cellulaire dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Répétez le processus trois fois afin que la majorité des bactéries soit lysée. Centrifugez les cellules à 14 000 ×g pendant 15 minutes.

Ensuite, prélevez le surnageant à la pipette et transférez-le dans un tube de centrifugation propre. Après avoir centrifugé le surnageant à 168 000 ×g pendant une heure, décantez soigneusement le surnageant sans perturber le culot membranaire. Récupérez le culot membranaire provenant d'un litre de culture et resuspendez-le dans le tampon A, supplémenté avec 10 % de glycérol, jusqu'à un volume final de 50 millilitres.

Ajouter 0,5 gramme de DDM à la suspension membranaire et agiter doucement pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après la solubilisation des membranes, éliminer les débris cellulaires du lysat par centrifugation à 168 000 ×g pendant une heure. Pendant ce temps, préparer la résine amylose.

Transférez trois millilitres de résine à l’aide d’une pipette dans une colonne de chromatographie en polypropylène vide. Lavez la résine en faisant passer 10 volumes de lit d’eau trois fois, puis 10 volumes de lit de tampon A, contenant du DDM à 0,5 millimolaire. Après centrifugation, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et transférez-le dans un tube conique propre de 50 millilitres.

Pour la liaison par lots, ajoutez la résine amylose pré-équilibrée dans le tube conique. Liez la protéine extraite à la résine amylose en agitant doucement le mélange pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, faites passer toute la suspension à travers une colonne de chromatographie et récupérez l'écoulement.

Diluez la protéine GLIC avec 10 millilitres de tampon A contenant 40 millimolaire de maltose en plus de 0,5 millimolaire de DDM et de 0,5 millimolaire de TCEP. Le TCEP empêche l'oxydation des chaînes latérales de cystéine. Récupérez tout l'éluat.

Concentrer la protéine élutée à l’aide d’un concentrateur centrifuge à une concentration comprise entre quatre et six milligrammes par millilitre. Ajouter la protéase HRV 3C et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Pour effectuer le marquage par spin dirigé par site, ajouter d’abord un excès molaire dix fois supérieur d’étiquette de spin MTSL à l’échantillon digéré par la protéase, afin d’obtenir un rapport molaire monomère GLIC/MTSL de 1:10.

Après une heure d'incubation, ajouter un excès molaire cinq fois supérieur d'étiquette paramagnétique et incuber pendant une heure supplémentaire. Faire passer l'échantillon à travers une colonne de chromatographie d'exclusion stérique en liquide rapide, ou FPLC, prééquilibrée avec le tampon A et 0,5 millimolaire de DDM afin de séparer la balise MBP clivée et l'excès d'étiquette paramagnétique libre des pentamères de GLIC. Concentrer la solution protéique à l'aide d'un concentrateur centrifuge jusqu'à une concentration finale d'environ huit à dix milligrammes par millilitre, puis placer la solution sur de la glace.

L'échantillon est désormais prêt à être reconstitué. Pour préparer les liposomes, rincez un flacon rond propre de 25 millilitres avec cinq millilitres de chloroforme et séchez le flacon sous un courant d'azote gazeux dans la hotte. Ensuite, transférez 10 milligrammes d'asolectine dans le flacon et séchez les lipides sous un courant continu d'azote gazeux.

Lorsque le chloroforme s'est évaporé, placez le flacon sous vide pendant une heure afin de garantir un séchage complet. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de reconstitution A au lipide sec et vortexez vigoureusement le flacon pour mettre le culot lipidique en suspension. Pour préparer des vésicules unilamellaires petites, soniquez la suspension lipidique dans un bain ultrasons refroidi jusqu'à ce que la solution de vésicules devienne plus ou moins translucide et qu'aucun agrégat ne soit observé.

À ce mélange, ajouter du DDM pour obtenir une concentration finale de quatre millimolaire et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Pour reconstituer la protéine, ajouter la protéine purifiée au mélange lipidique. Après incubation de l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant une heure sous agitation douce, diluer l'échantillon à 15 millilitres avec le tampon A. Éliminer le détergent résiduel dans la suspension à l'aide de billes de polystyrène munies de pores hydrophobes qui piègent le détergent.

Ajouter 80 milligrammes de billes propres et incuber la suspension de liposomes toute la nuit sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, transférer le liposome dans un tube d'ultracentrifugation de 25 millilitres à l'aide d'un filtre en colonne pour éliminer les billes, puis diluer davantage l'échantillon jusqu'à 25 millilitres. Après centrifugation des échantillons à 168 000 ×g pendant deux heures, décantation du surnageant et remise en suspension du culot à l'aide de 100 microlitres de tampon B. Pour réaliser une spectroscopie EPR en onde continue, transférer d'abord la suspension de liposomes dans un tube de 200 microlitres et centrifuger les échantillons pour former un culot.

Après avoir éliminé le surnageant, l'échantillon est prêt pour les mesures de RPE. Retirez autant de tampon que possible de l'échantillon de liposomes. Pour effectuer l'échange de tampon, transférez 20 microlitres du culot de liposomes dans un tube microcentrifuge à l’aide d’une pipette.

Ajouter 180 microlitres de tampon D et incuber à 42 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifuger l'échantillon, éliminer le surnageant à l'aide d'une pipette et répéter le processus trois fois afin de garantir un échange complet de tampon. Des capillaires en plastique perméables aux gaz sont adaptés aux mesures des formes des raies spectrales ainsi qu'à l'accessibilité du solvant.

Appuyez sur la capillarité contre le protéoliposome en pellet pour aspirer l'échantillon à l'intérieur, puis scellez l'extrémité avec de la cire osseuse. On observe ici la caractérisation biochimique de mutants de GLIC marqués par un spin, obtenue par chromatographie de filtration sur gel de GLIC marqué par un spin après clivage protéolytique du marqueur MBP. Les pics correspondent au pentamère de GLIC et au MBP libre.

Le gel SDS-PAGE montre la protéine de fusion monomérique GLIC-MBP non clivée avant la filtration sur gel, ainsi que les fractions MBP et GLIC recueillies après filtration sur gel. Un dosage basé sur la FRET a été réalisé pour surveiller l'état d'agrégation du GLIC réconstitué dans divers lipides membranaires. Des mesures de FRET ont été effectuées sur les échantillons après une nuit de réconstitution et après plusieurs cycles de congélation-décongélation des échantillons.

Dans une configuration « inside-out » excisée à partir de vésicules de asolectine reconstituées, GLIC est activé par des sauts de pH à l’aide d’un échangeur de solution rapide. Les canaux s’activent en environ 10 millisecondes et se désensibilisent avec une constante de temps d’une à trois secondes. Des réarrangements structuraux sont observés durant l’activation du canal.

Ici, les spectres de résonance paramagnétique électronique en onde continue pour une position de l'hélice M2 bordant le pore montrent des changements d'amplitude et de forme en réponse à des variations de pH. La spectroscopie de résonance paramagnétique électronique est une approche structurelle inégalée pour mesurer les changements conformationnels des protéines membranaires dans leur environnement natif, et elle permet d'observer des détails moléculaires de la dynamique des protéines qui restent invisibles dans les structures tridimensionnelles à haute résolution obtenues par cristallographie aux rayons X ou par microscopie électronique cryogénique. Lors de l'utilisation de cette technique, il est important de garder à l'esprit que les mutations entraînent souvent une faible stabilité oligomérique de la protéine.

Par conséquent, vous devrez peut-être élaborer une stratégie pour faire face à ces problèmes. La combinaison de ces résultats issus des études de RPE avec les mesures fonctionnelles peut nous fournir une image plus complète pour étudier la relation structure-fonction, et les progrès technologiques futurs visent à utiliser cette approche puissante pour étudier des canaux humains plus complexes dans des conditions lipidiques plus sophistiquées.