Méthyl-liaison par capture d'ADN de séquençage pour les tissus du patient

L’objectif global de cette technique est d’étudier systématiquement le paysage de méthylation de l’ADN à l’échelle du génome dans de grandes cohortes de patients. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, en particulier en ce qui concerne les régions du paysage de la méthylation de l’ADN qui sont déréglementées chez les patients. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de patients peuvent être examinés de manière rentable.

Cette technologie peut avoir des implications positives dans le traitement et le diagnostic du patient, car nous pouvons étudier les biomarqueurs existants et identifier de nouveaux biomarqueurs. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur une cohorte de patients, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la méthylation de l’ADN dans des cellules dérivées de lignées cellulaires cultivées à partir d’échantillons dérivés de souris. M. Joseph Liu, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de cette procédure avec le Dr Ya-Ting Hsu.

La partie séquençage sera démontrée par Mme Dawn Garcia qui est technicienne dans notre noyau de séquençage. Après avoir isolé l’ADN génomique de la tumeur ou du tissu normal conformément au protocole de texte, ajoutez 1,2 microgramme d’ADN génomique total à 96 microlitres de tampon TE et 24 microlitres de tampon de lavage de liaison 5X pour obtenir une solution de 120 microlitres. Sonicez la solution d’ADN pendant 30 secondes, puis laissez-la reposer pendant 30 secondes.

Répétez la sonication 20 à 25 fois au total. Utilisez un système de bioanalyseur avec un kit d’ADN commercial à haute sensibilité selon le protocole du fabricant pour faire fonctionner un microlitre de solution d’ADN soniqué afin de vérifier la taille des fragments. Ils doivent être compris entre 150 et 350 paires de bases.

Pour effectuer une élution à fraction unique, préparez le tampon d’élution en préparant une solution individuelle de tampon à faible teneur en sel et de tampon à haute teneur en sel. Utilisez 200 microlitres de tampon d’élution pour remettre en suspension l’ADN de liaison au méthyle ou les billes MBD et incubez la suspension sur un mélangeur rotatif pendant trois minutes. Après l’incubation, placez le tube sur le support magnétique pendant une minute, puis pipetez soigneusement le liquide sans toucher la pointe de la pipette sur les billes et transférez-le dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 millilitre sans DNase.

Conservez cet échantillon sur de la glace. Répétez l’élution pour le deuxième échantillon et collectez-le dans le même tube que le premier échantillon. À chaque fraction de lavage et de dilution non capturée, ajoutez un microlitre de glycogène, un dixième du volume de trois molaires d’acétate de sodium, pH 5,2, et deux volumes d’échantillon d’éthanol à 100 %.

Après avoir bien mélangé la solution, incubez à moins 80 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Ensuite, centrifugez la réaction à 11, 363 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger le granulé et ajoutez 500 microlitres d’éthanol froid à 70 %.

Faites tourner à nouveau le tube avant de répéter le lavage à l’éthanol. Faites sécher la pastille à l’air libre pendant cinq minutes. Utilisez ensuite de l’eau ou un tampon sans DNase pour le remettre en suspension.

Vérifiez que la quantité totale d’ADN est supérieure à 20 nanogrammes selon le protocole de texte. Placez ensuite l’ADN sur de la glace ou conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Pour la préparation de banques de séquençage d’ADN, utilisez un système de construction de banques entièrement automatisé et suivez le protocole standard fourni par le fabricant.

Sélectionner des fragments d’ADN de 200 à 400 paires de bases pour la préparation de la banque. Après avoir préparé la banque de séquençage de l’ADN, retirez la réaction et utilisez un système de quantification fluorométrique pour quantifier la banque de séquençage de l’ADN. Pour mettre en place une réaction d’amplification PCR, ajoutez dans un tube PCR 15 microlitres de bibliothèque de séquençage d’ADN, 25 microlitres de mélange maître PCR, deux microlitres de mélange d’amorces PCR et huit microlitres d’eau.

Utilisez le programme décrit dans le protocole texte, en faisant les ajustements nécessaires en fonction des recommandations du fabricant du mélange PCR. Effectuez suffisamment de cycles pour produire de deux à 10 millimolaires d’ADN de banque. Après avoir nettoyé les réactions PCR, codez-barres chaque échantillon et rassemblez quatre échantillons dans une voie d’une cellule d’écoulement.

Utilisez le protocole standard de lecture unique de 50 paires de bases de notre séquençage. Effectuer la bioinformatique selon le protocole texte. À l’aide de la recherche MBD cap pour identifier les îlots CpG dans différentes régions génomiques qui sont méthylés de manière différentielle dans la tumeur par rapport aux tissus normaux, cette étude a révélé que sur le total des îlots CpG situés dans les promoteurs de gènes, 19,5 % présentaient une méthylation différentielle dans les tumeurs par rapport à la normale.

De même, 55,2 % des îlots de CpG intragéniques étudiés ont montré une méthylation différentielle. Les promoteurs intragéniques ont montré 28,1 % et pour les promoteurs de gènes sans îlots CpG, 1,8 % ont montré une méthylation différentielle. Cette carte thermique représente clairement les régions méthylées différentiellement à travers 77 tumeurs du sein, 10 tissus normaux du sein et 38 lignées cellulaires de cancer du sein.

Dans cette figure, la méthylation est quantifiée dans deux sous-groupes de cancer de l’endomètre, non récurrent vs récurrent, chez deux patientes à différents sites CpG dans l’îlot promoteur CpG du gène cible identifié SFRP1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq jours si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de tester d’abord la qualité d’un ADN génomique testé. À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que le pyroséquençage peuvent être effectuées afin de répondre à des questions telles que : quels sont les CpG exacts dans les régions enrichies différentiellement identifiées qui ont été modifiées ? Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique pour explorer la méthylation de l’ADN dans de grandes cohortes de patients.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la méthylation de l’ADN à l’échelle du génome dans les échantillons de patients à l’aide de la technique de séquençage du capuchon MBD. Gardez cela à l’esprit, il peut parfois être difficile de saisir la haute qualité de l’ADN à partir d’échantillons tels que le FFP et les échantillons d’ADN, de sorte qu’une évaluation appropriée de l’ADN génomique est toujours effectuée lorsque nous effectuons la procédure.