Name: A phénotypage Regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez un protocole de phénotypage pour souris génétiquement modifiées utilisant le gène HtrA2 lié à la maladie de Parkinson. Cette méthode évalue la force musculaire et les déficits neurologiques.

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Le financement de cette recherche provient du Fonds de recherche du doyen Yale Medical School (JH) Foundation et médicale Rosebay. Nous remercions le Dr Claire Koenig pour l&#39;aide avec des expériences comportementales. Génétiquement lignées de souris Engineered ont été générés à Ozgene (Perth, Australie).

Ethique Déclaration: Les études portant sur des animaux ont été menées en conformité avec les instituts nationaux de recommandations de santé dans le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Commission (IACUC) à l&#39;Université de Yale. 1. Test du comportement des souris génétiquement modifiées Remarque: Toutes les souris doivent être soumis au même régime de tests pour limiter les différences de habituation à la manipulation. Les essais doivent être effectués à la même heure chaque fois. <ol><li> Neonatal Hind Limb test Note: Le test de membre postérieur est effectué tous les jours de jour postnatal (P) 4 à P10 pour évaluer proximale force musculaire des membres postérieurs, la faiblesse et la fatigue. <ol><li> souris de transport vers la zone d&#39;essai et laisser reposer pendant 30 minutes avant le test. </li><li> Préparer un appareil d&#39;essai par un nettoyage 50 ml tube conique de 70% d&#39;éthanol, en poussant deux (P4-P8) ou un (P9-P10) des boules de coton au fond du tUbe et la fixation dans une position verticale. </li><li> Retirer un chiot à partir du poids de la cage et enregistrer. Gardez chiot dans la tenue plateau sur coussin chauffant chaque fois pas tester. </li><li> suspendre doucement les membres postérieurs du nouveau-né sur le rebord du tube conique, de telle sorte qu&#39;il est orienté vers le bas vers les boules de coton. Comptez le nombre de tentatives de traction faites et mesure la latence de tomber à l&#39;aide d&#39;un chronomètre. </li><li> Répéter une fois de plus, puis étiqueter le chiot avec le marqueur. Ensuite, identifier les chiots P6 par orteil écrêtage. Frottez doucement les chiots avec une literie de cage avant de remplacer. </li><li> Essuyez tube conique avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Répétez le test sur le prochain chiot jusqu&#39;à ce que toute la litière a été testée. </li><li> Jeter boule de coton et d&#39;un tube conique. Nettoyer tout l&#39;équipement avec 70% d&#39;éthanol. </li></ol></li><li> Weanling test Observation Note: Le test d&#39;observation de sevrage est administré tous les jours de P19 à P21 pour marquer les niveaux de mouvement et d&#39;activité générale. <ol><li> souris de transport vers la zone d&#39;essai d&#39;unnd laisser reposer pendant 30 minutes avant le test. </li><li> Boîte de test en plexiglas marqué d&#39;une grille de 6x6 de 2 pouces carrés sur la base d&#39;un nettoyage avec 70% d&#39;éthanol préparer. Mettre en place un équipement vidéo sur le côté de telle sorte que toute la boîte est dans le champ de vision. Gardez le mettre en place et alentours de la même chaque jour pour éviter l&#39;introduction de la nouveauté. </li><li> Retirer un weanling de la cage et placer dans une tasse de maintien propre. poids Record. </li><li> Commencez l&#39;enregistrement vidéo en filmant la carte d&#39;identification de test, avec le numéro d&#39;identification de la souris, l&#39;âge et la date de l&#39;essai. Transférer la souris de tenir tasse à la place du centre. Le temps de trois minutes, en comptant le nombre de lignes parcourues par les deux pattes avant de la souris lors de l&#39;essai. </li><li> Retour à la souris un enregistrement vidéo de la cage et l&#39;extrémité propre. </li><li> Nettoyer l&#39;appareil d&#39;essai avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que tous les déchets est testé, puis retourner tous les chiots à la cage. </li><li> Nettoyer tous les équipements de test avec 70% d&#39;éthanol. </li><li&gt; Utilisation des vidéos, quantifier le nombre d&#39;élevage des événements en comptant après l&#39;observation visuelle, où une souris se tient avec les deux pattes avant claires de soutien, et des événements, où les deux pattes avant sont engagés dans le nettoyage de toilettage. </li></ol></li><li> Grillage Grip Test de résistance Note: Le test de la force de préhension est réalisée sur deux jours entre P22 et P26, pour évaluer la force neuromusculaire. <ol><li> souris de transport vers la zone d&#39;essai et permettent de se reposer en cage pendant 30 minutes avant le test. </li><li> Préparer l&#39;appareil par le nettoyage d&#39;une boîte et maille grille Plexiglas avec 70% d&#39;éthanol. Placez le film à bulles dans le fond de la boîte et couvrir avec du papier. </li><li> souris séparés en groupes de trois, en plaçant dans chaque coupelles de retenue. </li><li> Placez la première souris sur le centre du treillis métallique et inverser lentement 10-20 cm au-dessus de la surface molle dans le fond de la boîte en plexiglas. Mesurer la latence de tomber à l&#39;aide d&#39;un chronomètre. Terminate test après 60 secondes se sont écoulées si la souris ne fonctionne pastomber. </li><li> souris Retour à la tasse de maintien, lingette engrener avec 70% d&#39;éthanol et remplacer le papier sur le film à bulles. Effectuer le test sur les deux souris restantes dans le groupe avant de revenir à la première. Répétez jusqu&#39;à ce que chaque souris a été testé un total de trois fois. </li><li> Retour du groupe à une cage propre et continuer avec les groupes restants. S&#39;il y a moins de trois souris dans un groupe quelconque, veiller à ce qu&#39;un 5 min entre les essais intervalle de récupération est autorisé. </li><li> Retour toutes les souris à la cage, disposer de papier et de l&#39;équipement d&#39;essai propre avec 70% d&#39;éthanol. </li></ol></li></ol> 2. Examen de la structure rétinienne <ol><li> Anesthésier les animaux à P30-35 par injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie en pinçant la patte et procéder uniquement en l&#39;absence d&#39;une réponse, conformément aux directives du IACUC. Perfuser avec 4% PFA / PBS 48. </li><li> Pour supprimer les yeux, nettoyer la peau au si l&#39;incisionTE avec 70% d&#39;éthanol, avant de couper à travers la peau à la base du crâne. Peler la peau pour exposer le crâne et propre avec 70% d&#39;éthanol. Utilisation d&#39;instruments propres, couper soigneusement à travers le crâne pour atteindre les orbites et d&#39;exposer les yeux. Sever le nerf optique, retirez délicatement l&#39;œil de la prise et rincer dans du PBS. </li><li> Fixer les yeux dans 4% de PFA / PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Placez les yeux dans une petite boîte de Pétri contenant du PBS. Faire une petite incision dans le centre de la cornée en utilisant le point de ciseaux d&#39;enlèvement. Retirer la cornée en coupant l&#39;arête entre la cornée et la sclérotique. Utilisez une pince pour enlever l&#39;iris. Enfin, décoller les couches de l&#39;EPR, en laissant intacte la rétine et la lentille en place. Note: Les 4% de PFA / PBS fixation va provoquer un détachement RPE permettant l&#39;EPR d&#39;être facilement détachée de l&#39;extérieur de la rétine. </li><li> Nouveau fix dans 4% de PFA / 30% de saccharose / PBS pendant 15 min à température ambiante avant de retourner l&#39;oeil à une boîte de Petri contenant du PBS. Retirez le lens en utilisant une pince, ce qui porte le corps vitré avec elle. </li><li> Cryoprotect dans 30% de saccharose pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> yeux Coat dans Optimum composé de coupe de température (OCT) et transfert à un moule enrobage contenant frais octobre. Orienter l&#39;oeil de telle sorte que le plan sagittal est parallèle à la face de coupe, en utilisant le moins de mouvements possibles et d&#39;éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air. gel Flash en immergeant le moule dans un bain de glace / éthanol sec. blocs de conserver à -80 ° C. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cryostat, couper 20 um sections sagittal et de recueillir sur des lames préalablement nettoyées. </li><li> Sections Stain avec hématoxyline et éosine selon des protocoles standards 49. L&#39;image à l&#39;aide d&#39;un microscope optique équipé pour la microscopie en champ clair. </li></ol> 3. histochimique Coloration <ol><li> La préparation des échantillons <ol><li> Euthanasier animaux à P30-35 utilisant overdose isoflurane (30% dans du propylène glycol) par inhalation de chute libre. Évaluer l&#39;euthanasie par la cessationde la respiration, le rythme cardiaque et l&#39;absence de réponse à pincer la patte. Confirmer la mort par dislocation cervicale et le prélèvement d&#39;organes, conformément aux directives du IACUC. </li><li> Pour supprimer le cerveau, nettoyer la peau au niveau du site d&#39;incision avec 70% d&#39;éthanol, avant de couper à travers la peau à la base du crâne. Peler la peau pour exposer le crâne et propre avec 70% d&#39;éthanol. Utilisation d&#39;instruments propres, soigneusement coupés à travers le crâne et enlever pour exposer le cerveau. Retirer les membranes, et retirez délicatement le cerveau de la cavité du crâne. Rincer dans du PBS. </li><li> Enduire le cerveau dans l&#39;OCT et le transfert à un moule enrobage contenant frais octobre Orienter le cerveau de telle sorte que le plan sagittal est parallèle à la face de coupe, en utilisant le moins de mouvements possibles et d&#39;éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air. gel Flash en immergeant le moule dans un bain de glace / éthanol sec et conserver à -80 ° C. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cryostat, couper 10 um sections sagittal et de recueillir sur des lames préalablement nettoyées. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH diaphorase Coloration <ol><li> Préparer tampon Tris 0,05 M, à pH 7,6 par dissolution de 5,72 g de Tris-HCl et 1,66 g de Tris base dans de l&#39;eau déminéralisée-1L. Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à six semaines. </li><li> Préparer la solution de NADH (mM NADH 2,25 dans un tampon Tris 0,05 M). Aliquoter et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer une solution NBT (2,5 mM Nitro-Blue tétrazolium dans un tampon Tris 0,05 M). Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à six semaines dans une bouteille en verre. </li><li> Combiner des volumes égaux de solution NADH et une solution NBT pour faire solution de coloration et ajouter 1 ml à chaque diapositive. Incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes. </li><li> Solution de coloration Aspirer et laver trois fois avec dH 2 O. </li><li> Laver trois fois chacun dans l&#39; ordre croissant et décroissant des concentrations d&#39;acétone / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) pendant 2 minutes à la température ambiante. </li><li> Rincer trois fois en dH 2 O et monter des sections avec un milieu aqueux. L&#39;image à l&#39;aide d&#39;un microscope optique équipé pour lumineux fmicroscopie ield. Coloration au bleu correspond à l&#39;activité enzymatique. </li></ol></li><li> Succinate déshydrogénase histochimique Coloration <ol><li> Préparer 0,2 M monosodique / phosphate dH 2 O et 0,2 M de phosphate de sodium dibasique / dH 2 O. </li><li> Faire 0,2 M de tampon phosphate, pH 7,6, en combinant 3 parties de phosphate monobasique avec 20 parties de phosphate de sodium dibasique. </li><li> Préparer une solution de coloration (0,1 M de succinate de sodium, 1,25 M dans un tampon de NBT phosphate 0,2 M) et ajouter 1 ml à chaque diapositive. Incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée pendant 60 min. </li><li> Solution de coloration Aspirer et laver trois fois en dH 2 O. </li><li> Laver trois fois chacun dans ascendantes et descendantes des concentrations d&#39;acétone / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) pendant 2 minutes à la température ambiante. </li><li> Rincer trois fois en dH 2 O et monter des sections avec un milieu aqueux. L&#39;image à l&#39;aide d&#39;un microscope optique équipé pour la microscopie en champ clair. Coloration au bleu correspond enactivité zymatic. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

traitements robustes sont nécessaires pour limiter l&#39;impact des conditions liées au vieillissement humain débilitante, mais ils restent hors de portée pour de nombreuses conditions. Pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d&#39;intervention, les causes et la pathologie des maladies associées au vieillissement doivent d&#39;abord être compris. Toutes les souris génétiquement modifiées immédiatement présentes avec des phénotypes clairs qui sont liés à la maladie d&#39;intérêt,...

les maladies liées à l&#39;âge sont de plus en plus répandue dans la société moderne. Comme la science médicale améliore et l&#39;espérance de vie augmente, la population continue de vieillir et le fardeau de ces maladies augmente. Des traitements efficaces sont nécessaires pour réduire l&#39;impact des conditions débilitantes, mais restent difficiles dans de nombreux cas. Seule la compréhension des causes et de la pathologie des maladies associées au vieillissement scientifiques peuvent commencer à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d&#39;intervention. des conditions liées à l&#39;âge communs comprennent des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson (PD) et la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA). PD est trouble du mouvement le plus courant causé par la neurodégénérescence chez les humains. La plupart des patients parkinsoniens présentent des symptômes tels que tremblements de repos, bradykinésie et la rigidité après 50 ans. L&#39;apparition précoce a également été observée dans environ 10% des cas. La DMLA est la principale cause de cécité dansles photorécepteurs, les personnes âgées endommageant progressivement et l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans l&#39;oeil. La vision centrale est altérée, mais la vision périphérique est généralement affectée. Il existe deux formes de DMLA. Dans la forme «sèche», les dépôts de protéines extracellulaires connus sous forme de drusen entre l&#39;EPR et la membrane de Bruch (BM), conduisant à une atrophie géographique et le flou de la vision centrale. Les &quot;humides&quot; plus sévères forment les résultats de néovascularisation de la choroïde à travers BM dans les couches de l&#39;EPR et de photorécepteurs et peuvent conduire à des hamorrhaging sous la rétine qui provoque des dommages permanents au tissu rétinien. Le génome des études d&#39;association de large ont déjà identifié des loci qui sont associés à une susceptibilité accrue à la maladie et a identifié deux régions d&#39;intérêt: le facteur H du complément (CFH) sur le chromosome 1 et le locus 10q26, où liée à l&#39;âge maculopathie susceptibilité 2 (ARMS2) et à haute température facteur de condition A1 (HtrA1) gènes sont situés 1-5 </sup&gt;. Des combinaisons de ces allèles augmentent la probabilité d&#39; une DMLA d&#39;une manière dépendante de la dose et les SNP spécifiques peuvent être associés soit préférentiellement des formes sèches ou humides , de la DMLA 3-6. CFH agit comme un régulateur négatif de la voie alternative (AP) du système du complément en inhibant l&#39;activation de C3. Un polymorphisme nucléotidique simple (SNP) a été liée à un risque accru d&#39;AMD, ce qui provoque l&#39; échange de la tyrosine 402 dans l&#39; exon 9 avec histidine en raison d&#39;un T à C substitution 1. Dans la DMLA on pense que le PA est misregulated en raison d&#39;une perte de fonction de CFH, mais si le SNP joue un rôle causal est peu claire. Une hypothèse est que l&#39;histidine chargée positivement est pensé à nier la capacité de CFH à se lier à l&#39; interaction des protéines C-réactive protéine et du sulfate d&#39;héparine 1,7. Des études in vitro de CFH Y402H fournissent des résultats contradictoires sur les différences fonctionnelles entre les variantes, et vivo travail &lt;em&gt; Cfh - / - souris exprimant humanisé CFH est en cours 8. ARMS2 est situé en amont HtrA1 dans le génome des primates, bien que le gène est absent chez la souris. HtrA1 est une sérine-protéase, mais ARMS2 est mal caractérisée. Le déséquilibre de liaison entre les SNP dans le locus AMD associée a rendu difficile de déterminer les contributions au risque de mutations individuelles des gènes dans cette région, mais des travaux récents ont suggéré qu&#39;il est surexpression de HtrA1 plutôt que ARMS2 qui mène à la néovascularisation et dépôts de protéines sous - rétiniens 9-11. Toutefois, la proximité des gènes de ce locus peut permettre des interactions qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des transgènes insérés au hasard. En plus de la DMLA, la famille HtrA de sérine-protéases ont été associées à de nombreuses maladies humaines. Toutes les protéines HtrA contiennent un domaine de sérine-protéase suivi d&#39;au moins un domaine PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 et HtrA4 partagent le grmanges d&#39;homologie, se composant d&#39;un domaine de peptide signal, de liaison du facteur ressemblant à l&#39;insuline de croissance, un domaine inhibiteur de protéase Kazal, le domaine de la sérine protéase et un domaine PDZ. HtrA2 a une extrémité N-terminale différente, composée d&#39;une séquence de localisation mitochondriale, un domaine transmembranaire et un inhibiteur de domaine de liaison à l&#39; apoptose suivie par la protéase et les domaines PDZ 12-16. HtrA1 chez les mammifères est régulée par le remodelage induit par le substrat dans le site actif de son domaine de protéase 17-20 et HtrA2 peut aussi être modulée par l&#39; interaction entre la sérine protéase et les domaines PDZ qui supprime l&#39; activité de protease 21. Fait intéressant, le domaine PDZ ne semble pas conférer une réglementation similaire à HtrA3 16. Les protéases HtrA peuvent également être réglementées par des facteurs extrinsèques: il a été récemment démontré qu&#39;il existe une interaction réglementaire entre HtrA1 et protoporphyrines 22 et HtrA2 peuvent être régulées par la phosphorylation lors de l&#39; activation de la kinase MAP p38la voie d&#39;une manière dépendante PINK1 23. La suppression des membres individuels de la famille HtrA chez la souris a été documentée, mais les effets mécanistes sont pour la plupart peu claire en partie à cause du manque de phénotypes visibles. HtrA1 joue un rôle important dans le contrôle de la qualité de la protéine et de sa mauvaise régulation ou la mutation a été associée à de nombreuses maladies humaines différentes , y compris l&#39; arthrite, le cancer et un risque accru de DMLA 3,4,24-32. Perte de la fonction HtrA2 dans les tissus neuronaux ont été associés à des phénotypes parkinsoniens chez les humains et les souris, tandis que sa perte de tissus non neuraux entraîne un vieillissement accéléré 33-37. HtrA3 dysrégulation a été associée à des maladies telles que la pré - éclampsie et certains types de cancer 38,39. Up-régulation de HtrA4 a été observée dans les placentas de patients atteints de prééclampsie , mais les souris knock - out ne pas afficher un phénotype manifeste 40,41. Le manque de phénotypes observés chez certaines souris knock-out a étépostulé pour être le résultat d&#39; une compensation entre le membre de la famille HtrA: on pense que les deux HtrA4 et HtrA1 interagissent avec la famille des protéines TGF-B, ce qui permet une compensation par HtrA1 sur la suppression de HtrA4 41. De même, on pense que depuis HtrA1 et HtrA3 ont un degré élevé d&#39;homologies de domaine qu&#39;ils peuvent avoir des fonctions complémentaires 42. Cependant, il a été suggéré que les protéines HtrA peuvent avoir un rôle partiellement antagonistes, en concurrence pour réguler 43 cibles communes. Pour approfondir ces facteurs de risque trois lignées de souris knock-in humanisés ont été générés. Dans Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh et Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 du gène CFH remplacé par exon 9 de l&#39;homologue humain. Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh code pour la non-maladie associée tyrosine résidu en position 402, tandis que Cfh tM2 (CFH * 9) jhoh porte le Y402H, SNP de risque associé. DansARMS2 tm1jhoh la séquence ARMS2 humaine a été la cible d&#39;une région en amont de HtrA1. Une séquence d&#39;arrêt loxP flanquée placé en amont de la séquence du gène , mais en aval du promoteur inclus UBIC a été excisé par croisement des souris OzCre, qui expriment la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Rosa26, 34 comme décrit précédemment. En plus de ces knock-in lignes, allèles knock - out conditionnel pour Cfh et HtrA1 (Cfh tm1jhoh et HtrA1 tm1jhoh), ainsi que les autres membres connus de la famille HtrA ont été générés: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) et HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Les KO lignée germinale ont été créés par le croisement des souris OzCre aux animaux conçus pour flanquer exons spécifiques avec des sites loxP, tels que la suppression provoque un décalage du cadre et / ou suppression du domaine actif (Cfh; exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; &#39; exon 3, HtrA4; exons 4-6) 34,41. Une délétion neuronal de HtrA2, supprimé en utilisant Cre recombinase sous le contrôle du promoteur de la nestine (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), a également été décrite 34. Seules les souris dépourvues de HtrA2, soit systémique ou dans les tissus neuronaux, affichés phénotypes clairs, présentant des phénotypes parkinsoniens. Comme certains de ces gènes d&#39;intérêt sont posés à être localisées aux mitochondries 11,44-47, et la suppression de HtrA2 généré phénotypes parkinsoniens, un régime de phénotypage avec un accent mitochondrial et neurologique est décrit ici et des résultats représentatifs des tests d&#39;intérêt sont fournis . Afin d&#39;examiner des souris génétiquement modifiées produites pour enquêter sur l&#39;homme, la maladie liée à l&#39;âge à fond et systématiquement un calendrier de phénotypage initial a été créé, composé d&#39;une série de tests relatifs aux deux principauxmaladies d&#39;intérêt: AMD et de Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>boules de coton</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tapis chauffant</td><td>Sunbeam</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de maintien (bac à glaçons)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chronomètre électronique</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Boîte en plexiglas</td><td>construite en atelier</td><td></td><td>12 » par 12"&nbsp ;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Caméscope</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Tasses transparentes</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 pouce treillis</td><td>métallique Home Depot</td><td>204331884 (en ligne) / 554219 (en magasin)</td><td>12 » par 12"&nbsp ;</td></tr><tr><td>Papier bulle</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Pince à éprouvette droite</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection à pointe fine</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 16 % solution</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>lames de superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Solution de coloration d’hématoxyline</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Solution de teinture Y d’éosine</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adénine dinucléotide, hydrate de sel disodique réduit</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de bleu de nitrotétrazolium</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique monohydraté</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Succinate de sodium dibasique hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount milieu de montage aqueux</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trépied pour caméra vidéo</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Sectioning&nbsp ; Machine</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>CM1900</td><td>Abandonné mais remplacé depuis par CM1950</td></tr></tbody></table>

a phénotypage regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Les maladies liées à l’âge sont de plus en plus fréquentes et le fardeau continue de croître à mesure que notre population vieillit. Des traitements efficaces sont nécessaires pour atténuer l’impact des affections débilitantes, mais restent insaisissables dans de nombreux cas. Ce n’est qu’en comprenant les causes et la pathologie des maladies associées au vieillissement que les scientifiques peuvent commencer à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et à élaborer des stratégies d’intervention. Les affections liées à l’âge les plus courantes sont les troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson et la cécité. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la principale cause de cécité chez les personnes âgées. Des études d’association à l’échelle du génome ont précédemment identifié des loci associés à une susceptibilité accrue à cette maladie et identifié deux régions d’intérêt : le facteur H du complément (CFH) et le locus 10q26, où se trouvent les gènes de la susceptibilité 2 de la maculopathie liée à l’âge (ARMS2) et du facteur A1 du besoin à haute température (HtrA1). CFH agit comme un régulateur négatif de la voie alternative (AP) du système du complément tandis que HtrA1 est une protéase à sérine extracellulaire. ARMS2 est situé en amont de HtrA1 dans le génome du primate, bien que le gène soit absent chez la souris. Pour étudier les effets de ces gènes, des lignées de souris knock-in humanisées de Cfh et ARMS2, des knock-outs de Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 et HtrA4 ainsi qu’une délétion neurale conditionnelle de HtrA2 ont été générés. De toutes les souris génétiquement modifiées produites, seules les souris dépourvues de HtrA2, que ce soit de manière systémique ou dans les tissus neuraux, présentaient des phénotypes clairs. Afin d’examiner ces souris de manière approfondie et systématique, un premier schéma de phénotypage a été établi, consistant en une série de tests liés à deux maladies d’intérêt principales : la DMLA et la maladie de Parkinson. Les souris génétiquement modifiées peuvent être soumises à des expériences appropriées pour identifier les phénotypes qui peuvent être liés aux maladies associées chez l’homme. Un schéma de phénotypage axé sur les mitochondries est présenté ici aux côtés des résultats représentatifs des tests d’intérêt.

Cette section décrit des exemples de résultats obtenus en utilisant ces méthodes. Dans le test de membre postérieur, le nombre d&#39;essais de traction réalisés et le temps d&#39;attente de tomber sont additionnés sur deux essais consécutifs pour chaque jour. Ce test peut être utilisé pour comparer génétiquement différents groupes de distinguer les souris avec une réduction de force neuromusculaire HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) de souris dans la Figure 1A ...

Une approche de génétique inverse pour comprendre les familles de gènes associées à la maladie humaine est présentée, en utilisant la souris comme système modèle, et le calendrier de phénotypage ultérieur de la souris est décrit. Parce que les souris défectueuses d’un gène d’intérêt, HtrA2, ont manifesté des symptômes parkinsoniens, le régime de phénotypage est axé sur l’identification des défauts neurologiques.

A phénotypage Regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

L'objectif général de ce protocole de test est d'établir une série de tests simples pouvant être utilisés comme un pipeline de phénotypage initial afin de guider des investigations ultérieures détaillées sur les phénotypes comportementaux ainsi que sur la structure et la fonction des tissus. Déterminer si les phénotypes comportementaux et cellulaires des maladies humaines sont recréés dans le modèle murin. Le principal avantage de cette technique est que les tests peuvent être réalisés dans des laboratoires n'ayant aucune expérience préalable dans ce type d'expériences, sans investissement important, tout en fournissant des informations utiles pour des études plus approfondies.Réalisez le test des membres postérieurs quotidiennement du quatrième au dixième jour après la naissance afin d'évaluer la force, la faiblesse et la fatigue des muscles proximaux des membres postérieurs. Pour commencer, laissez les souris s'acclimater à la zone de test pendant 30 minutes. Pendant ce temps, préparez un nouveau tube conique de 500 millilitres en le rinçant avec de l'éthanol à 70 %, puis en insérant une ou deux boules de coton au fond du tube.Fixez ce tube en position verticale pour le test. Lorsqu'elles ne sont pas testées, gardez les petits avec la mère afin de maintenir leur température. Après une période d'acclimatation de trente minutes, retirez un petit de la cage et notez son poids.Ensuite, suspendez délicatement le nouveau-né par ses membres postérieurs au-dessus du bord du tube, de sorte que le petit soit orienté vers le coton. Comptez alors le nombre de tentatives de traction effectuées par le petit et mesurez sa latence à tomber. Après avoir attendu 30 secondes, répétez le test.Après le deuxième test, étiquetez le petit avec un marqueur. Ensuite, frottez doucement le petit avec de la litière provenant de la cage d'origine et remettez-le auprès de la mère. Comme les petits plus âgés de P8 ne peuvent pas être marqués, identifiez-les par une coupe d'orteil.Avant de passer à la portée suivante, essuyez le tube à essai avec de l’éthanol à 70 %. Appliquez le test d’observation des sevrés quotidiennement entre le J19 et le J21 afin d’évaluer les niveaux de mouvement et d’activité générale. Commencez par laisser les souris s’acclimater à la zone de test pendant 30 minutes.Pendant que les petits s'habituent, préparez l'arène. Marquez une boîte de test en plexiglas avec une grille de six par six carrés de deux pouces de côté. Avant d'utiliser la boîte, nettoyez-la avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, positionnez une caméra vidéo de manière à ce qu'une vue latérale de l'ensemble de la boîte remplisse le champ de vision. Standardisez l'apparence de l'environnement pour éviter d'introduire un élément de nouveauté. Avant le test, transférez le jeune sevré dans un gobelet de contention propre et enregistrez son poids.Commencez alors l'enregistrement vidéo. Commencez par filmer une carte d'identification-test avec le numéro d'identification de la souris, son âge et la date actuelle. Ensuite, transférez la souris du récipient de contention vers le carré central.Pendant trois minutes, comptez le nombre de lignes traversées par les deux pattes avant. Après trois minutes, remettez la souris dans une cage propre et arrêtez l'enregistrement vidéo. Entre chaque test, nettoyez la boîte avec de l'éthanol à 70 %.À partir des vidéos, comptez les épisodes de redressement, qui correspondent au moment où une souris se tient debout avec ses deux pattes avant complètement détachées d'un support. Comptez également les épisodes de toilette, qui surviennent lorsque les deux pattes avant sont occupées à se nettoyer. Réalisez le test de force de préhension tous les deux jours entre les jours P22 et P26 afin d'évaluer la force neuromusculaire.Comme d'habitude, laissez les souris s'adapter à la zone de test pendant 30 minutes. L'appareil de test est une boîte en plexiglas équipée d'une grille en treillis. Nettoyez les deux éléments avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, recouvrez le fond de la boîte d'une couche de papier bulle pour l'assouplir et recouvrez la papier bulle de papier afin d'absorber les excrétions. Procédez ensuite à la séparation des souris d'essai et placez-les dans des gobelets individuels. Placez maintenant la première souris au centre du treillis métallique et retournez lentement le treillis à une hauteur de 10 à 20 centimètres au-dessus de la surface souple de la boîte.Relevez la latence avant la chute ou mettez fin au test après 60 secondes, si la souris ne tombe pas. Ensuite, remettez la première souris dans le gobelet de contention. Entre chaque test, essuyez la grille avec de l’éthanol à 70 % et remplacez le papier placé au-dessus de la mousse protectrice.Ensuite, réalisez le test sur les deux autres souris du groupe. Une fois que chaque souris a été testée une fois, répétez le processus deux fois supplémentaires pour obtenir trois essais par souris. S’il y a moins de trois souris dans un groupe, veillez à ce qu’un temps de récupération inter-essai d’au moins cinq minutes soit respecté.Pour une coloration à la diaphorase-NADH, mélangez des volumes égaux de solution fraîchement préparée de NADH et de solution fraîchement préparée de NBT. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de coloration sur chaque lame et incubez les lames dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour une coloration à la succinate déshydrogénase, préparez une solution contenant 0,1 molaire de succinate de sodium, 1,25 molaire de NBT et un tampon phosphate 0,2 molaire.Ensuite, ajoutez un millilitre sur chaque lame. Placez les lames dans une chambre humidifiée et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation avec l'un ou l'autre colorant, aspirez la solution de coloration et lavez les lames trois fois avec de l'eau distillée.Ensuite, laver les lames dans une série de bains d'acétone dont la concentration augmente puis diminue. Pour chaque concentration d'acétone, effectuer trois lavages de deux minutes chacun. Enfin, rincer les lames trois fois dans de l'eau distillée.Ensuite, montez les lames avec un milieu aqueux. Les souris dépourvues d'expression de HTRA2 ont été examinées à l'aide de la batterie de tests décrite et comparées à des témoins provenant de la même portée. Aucun changement du nombre de tractions ou de la latence avant la chute n'a été observé entre P4 et P6. Entre P7 et P10, une réduction de la force neuromusculaire a été notée.Dans le test d'activité, l'activité des souris HTRA2 de type knock-out était réduite. Ces souris présentaient également une diminution de la force dans le test de préhension sur treillis métallique. La coloration H-E montre que les souris HTRA2 de type knock-out ne présentaient pas de modifications apparentes de la structure rétinienne par rapport aux témoins à P35.Enfin, une coloration histochimique de l'activité du complexe de la chaîne de transport des électrons a été utilisée pour identifier les modifications des fonctions des enzymes respiratoires. Une diminution de la coloration a été observée chez les souris knock-out pour HTRA2 par rapport aux témoins. Cette diminution a été notée dans le cervelet et le striatum, mais pas dans le cortex.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer l'activité et la force neuromusculaire de souris génétiquement modifiées, ainsi que de la façon de combiner ces études avec des axes cellulaires. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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