A phénotypage Regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement

L’objectif global de ce schéma de test est d’établir une série de tests simples qui peuvent être utilisés comme pipeline de phénotypage initial pour orienter les investigations ultérieures détaillées sur les phénotypes comportementaux et la structure et la fonction des tissus. Si les phénotypes comportementaux et cellulaires des maladies humaines sont récapitulés dans le modèle murin. Le principal avantage de cette technique est que les tests peuvent être effectués dans des laboratoires sans expérience préalable de telles expériences, sans investissement important, tout en informant des études plus détaillées.

Effectuez le test des membres postérieurs tous les jours du quatrième au dixième jour postnatal pour évaluer la force, la faiblesse et la fatigue musculaires des membres postérieurs proximaux. Pour commencer, laissez les souris s’acclimater à la zone de test pendant 30 minutes. Pendant ce temps, préparez un nouveau tube conique de 500 millilitres en le lavant avec de l’éthanol à 70 %, puis en enfonçant une ou deux boules de coton au fond du tube.

Fixez ce tube en position verticale pour le test. Lorsqu’ils ne sont pas testés, gardez les petits avec le barrage pour maintenir leur température. Après l’acclimatation d’une demi-heure, sortez un chiot de la cage et notez son poids.

Ensuite, suspendez doucement le nouveau-né par ses membres postérieurs sur le bord du tube, de sorte que le chiot soit face au coton. Comptez ensuite le nombre de tentatives de traction effectuées par le chiot et mesurez sa latence jusqu’à la chute. Après avoir attendu 30 secondes, répétez le test.

Après le deuxième test, étiquetez le chiot avec un marqueur. Ensuite, frottez doucement le chiot avec la litière de la cage familiale et remettez-le dans la digre. Parce que les chiots P8 plus âgés ne peuvent pas être marqués, identifiez-les avec une coupe d’orteil.

Avant de passer au chiot suivant, essuyez le tube à essai avec de l’éthanol à 70 %. Administrez le test d’observation du sevrage tous les jours de P19 à P21 pour noter les niveaux de mouvement et d’activité générale. Commencez par laisser les souris s’acclimater à la zone d’essai pendant 30 minutes.

Pendant que les chiots s’acclimatent, préparez l’arène. Marquez une boîte de test en plexiglas avec une grille de six par six carrés de deux pouces. Avant d’utiliser la boîte, nettoyez-la avec de l’éthanol à 70 %.

Placez ensuite une caméra vidéo de manière à ce qu’une vue latérale de l’ensemble de la boîte remplisse le champ de vision. Uniformisez l’apparence de l’environnement pour éviter d’introduire de la nouveauté. Avant le test, transférez le sevré dans un bonnet de maintien propre et notez son poids.

Puis a commencé l’enregistrement vidéo. Tout d’abord, filmez une carte d’identification de test avec le numéro d’identification de la souris, son âge et la date du jour. Transférez ensuite la souris de la tasse de maintien vers le carré central.

Pendant trois minutes, comptez le nombre de lignes croisées par les deux pattes avant. Au bout de trois minutes, remettez la souris dans une cage propre et terminez l’enregistrement vidéo. Entre chaque test, nettoyez la boîte avec 70 % d’éthanol.

À partir des vidéos, comptez les événements de cabrage, c’est-à-dire lorsqu’une souris se tient debout avec les deux pattes avant dégagées de tout support. Comptez également les événements de toilettage, qui se produisent lorsque les deux pattes avant sont engagées dans le nettoyage. Effectuez le test de force de préhension un jour sur deux entre P22 et P26 pour évaluer la force neuromusculaire.

Comme d’habitude, donnez aux souris 30 minutes pour s’adapter à la zone de test. L’appareil d’essai est une boîte en plexiglas avec une grille grillagée. Nettoyez les deux avec de l’éthanol à 70 %.

Tapissez ensuite le fond de la boîte d’une couche de papier bulle pour le rembourrage et couvrez le papier bulle de papier pour absorber les excrétions. Procédez à la séparation des souris de test et chargez-les dans des tasses individuelles. Maintenant, placez la première souris au centre du treillis métallique et inversez lentement le treillis à 10 à 20 centimètres au-dessus de la surface molle de la boîte.

Mesurez la latence jusqu’à la baisse ou terminez le test après 60 secondes, si la souris ne tombe pas. Remettez ensuite la première souris dans la tasse de maintien. Entre les tests, essuyez le filet avec de l’éthanol à 70 % et replacez le papier sur le papier bulle.

Effectuez ensuite le test sur les deux autres souris du groupe. Après avoir testé une fois chaque souris, répétez le processus deux fois de plus pour trois essais par souris. S’il y a moins de trois souris dans un groupe, assurez-vous qu’il y a un temps de récupération entre les essais d’au moins cinq minutes.

Pour une coloration à la diaphorase NADH, combinez des volumes égaux de solution de NADH fraîchement préparée et de solution de NBT fraîchement préparée. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de coloration à chaque lame et incubez les lames dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour une coloration à la succinate hydrogénase, préparez une solution de succinate de sodium à 0,1 molaire, de NBT à 1,25 molaire et de tampon de phosphate à 0,2 molaire.

Ajoutez ensuite un millilitre à chaque lame. Emballez les lames dans une chambre humidifiée et incubez les lames à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir incubé avec l’une ou l’autre des taches, aspirez la solution de coloration et lavez les lames trois fois avec de l’eau distillée.

Ensuite, lavez les lames à travers une série de bains d’acétone qui augmentent et diminuent la concentration. Avec chaque concentration d’acétone, effectuez trois lavages pendant deux minutes par lavage. Enfin, rincez les lames trois fois à l’eau distillée.

Montez ensuite les lames avec un milieu aqueux. Des souris sans expression de HTRA2 ont été examinées à l’aide de la batterie de tests décrite et comparées à des témoins de portée. Aucun changement dans le nombre de tirages ou la latence de chute n’a été observé entre P4 et P6. Entre P7 et P10, une réduction de la force neuromusculaire a été notée.

Dans le test d’activité, il y avait une activité réduite des souris knock-out HTRA2. Les souris knock-out HTRA2 ont également montré une réduction de la résistance dans le test de préhension en treillis métallique. Les colorations H et E montrent que les souris knock-out HTRA2 n’ont présenté aucun changement apparent dans la structure rétinienne par rapport aux témoins à P35.

Enfin, la coloration histochimique de l’activité complexe de la chaîne de transport d’électrons a été utilisée pour identifier les changements dans les fonctions des enzymes respiratoires. Il y avait une diminution de la coloration chez les souris knock-out HTRA2 par rapport aux témoins. Cela a été noté dans le cervelet et le striatum, mais pas dans le cortex.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’activité et la force neuromusculaire des souris génétiquement modifiées, ainsi que de la façon de combiner ces études avec des axes cellulaires. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.