Méthode électrophysiologique de réponses d'enregistrement intracellulaire tension de Drosophila Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli In Vivo

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les réponses électriques intracellulaires des photorécepteurs de la drosophile et des interneurones visuels à des stimuli lumineux contrôlés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du neurocodage, telles que la façon dont un stimuli lumineux l’encode dans l’une de ses réponses, ou comment ses informations visuelles, ses photorécepteurs et ses interneurones s’extraient des stimuli lumineux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir des enregistrements durables et de haute qualité de l’étude, avec peu de dommages au milieu intracellulaire et à l’échantillonnage d’informations.

La caractéristique de démonstration que cela peut affecter est essentielle car ses différentes étapes sont difficiles à apprendre à exécuter correctement sans les voir. Tirez une microélectrode de référence à partir de borosilicate filamenté ou d’un tube en verre de quartz à l’aide d’un extracteur de pipette standard. Essayez d’obtenir une réduction courte et progressive.

Les réglages exacts varient d’un instrument à l’autre. La taille des pores à l’extrémité n’est pas cruciale car elle sera cassée pour les expériences. Ensuite, tirez une électrode d’enregistrement du même tube de verre et essayez d’obtenir un cône fin et progressif de 10 à 15 millimètres de long.

Au microscope optique, montez l’électrode sur une face en verre avec plusieurs adhésifs et utilisez un objectif à air 40x pour inspecter sa pointe. Une bonne électrode se rétrécit doucement jusqu’à une pointe invisiblement petite, autour de laquelle des motifs d’interférence parallèles continus plus sombres et plus clairs peuvent être vus. Juste avant l’expérience, remplissez l’électrode de référence avec des bagues anti-mouches, à l’aide d’une seringue de cinq millilitres reliée à un filtre à particules, avec un embout en plastique fin.

Pour les expériences sur les photorécepteurs, chargez l’électrode d’enregistrement avec 3 molaires de chlorure de potassium jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme à son extrémité large. Cela minimisera le bruit de la jonction liquide pendant l’enregistrement. Pour travailler avec des LMC histaminergiques, remplissez les électrodes d’enregistrement avec de l’acétate de potassium à 3 molaires, du chlorure de potassium à 0,5 millimolaire pour minimiser l’effet sur la batterie de chlorure de la cellule.

Commencez par remplir un flacon de mouches fraîches avec des mouches âgées de cinq à 10 jours. Les jeunes mouches sont plus fragiles, mais peuvent être enregistrées. Sélectionnez la première mouche pour l’électrophysiologie.

Les grandes femelles sont les plus faciles à travailler. Lorsqu’ils sont dans le tube de capture, profitez de leur tendance inhérente à grimper vers le haut dans la pointe de la pipette et à boucher la plus petite pointe. Ensuite, connectez une seringue de 100 millilitres avec un tuyau en plastique flexible à la pointe de la pipette, qui est agrandie juste pour laisser passer une drosophile et connectez l’autre extrémité à une grande pointe de pipette fixée au porte-mouche.

Ensuite, pressez un petit volume d’air de la seringue pour éjecter la mouche dans le porte-mouche. Regardez à travers le stéréomicroscope et administrez doucement plus d’air jusqu’à ce que la tête de la mouche dépasse de l’extrémité conique du porte-mouche. Assurez-vous que la mouche est fermement coincée par son thorax.

Fixez ensuite la mouche avec de la cire d’abeille. Utilisez la température la plus basse du chauffe-cire pour faire fondre proprement la cire, qui apparaîtra transparente. S’il fait trop chaud, la cire brûlera.

Immobilisez la tête de la mouche en appliquant un peu de cire d’abeille sur le proboscis et le coin de l’œil droit, en évitant la cornée. Fixez ces deux points au porte-mouche. Terminez cette étape rapidement pour éviter de brûler la mouche.

Ensuite, mettez des lunettes et fabriquez un microcouteau. Serrez une lame de rasoir non en acier inoxydable avec deux porte-lames à prise plate et cassez une petite bande de son bord tranchant. Idéalement, produisez un bord tranchant comme un rasoir qui ressemble à une flèche.

Maintenant, avec précaution et une grande attention aux détails, utilisez le microcouteau pour ouvrir quelques ommatidies de l’œil gauche de la mouche, comme à quatre ou cinq ommatidies de la cuticule dorsale juste au-dessus de l’équateur de l’œil. Celle-ci fournira le passage pour la microélectrode d’enregistrement. C’est assez difficile, nécessite un couteau bien fait et doit être appris avec de la pratique.

Retirez ensuite délicatement le petit morceau de cornée de l’ouverture, exposant la rétine en dessous. Maintenant, à l’aide des poils fins de l’applicateur de vaseline, couvrez rapidement le trou avec une petite goutte de vaseline. La gelée a l’avantage supplémentaire de réduire la capacité intra-muros de la pipette.

Évitez de tacher l’œil car cela brouille l’optique. Lors de l’utilisation de l’amplificateur à microélectrodes, soyez toujours mis à la terre en touchant la surface métallique de la cage de Faraday ou de la table anti-vibration pour éviter les charges statiques. Fixez le double-toit monté au poteau de la plate-forme de préparation des mouches.

Faites pivoter le porte-mouche de sorte que l’œil gauche de la mouche soit directement face à l’enquêteur. Ensuite, utilisez un petit micromanipulateur pour insérer doucement l’électrode de référence émoussée à travers les ocelles de la mouche dans la capsule céphalique. Assurez-vous que la mouche semble toujours en bonne santé et bouge ses antennes.

La préparation doit être superbe pour mériter l’enregistrement. Enfoncez maintenant la microélectrode d’enregistrement tranchante dans l’œil gauche à travers l’ouverture recouverte de gelée. Lorsqu’elle pénètre dans le tissu, l’emplacement de l’extrémité de l’électrode doit être apparent par son motif de réflectance.

La pointe fragile de l’électrode doit être parfaitement guidée ou elle se cassera, ce qui est très difficile. Selon le type de cellule à partir de laquelle l’enregistrement est effectué, la tête de la mouche doit être orientée légèrement différemment. Une fois les électrodes en place, allumez l’amplificateur de microélectrodes.

Ensuite, éteignez la source de lumière froide, débranchez-la du secteur et connectez-la à la terre centrale pour minimiser le bruit électrique induit par la boucle de terre. Ensuite, ajustez les guides de lumière en col de cygne de sorte que le système de bras Carden puisse être déplacé librement autour de la mouche. Éteignez ensuite les lumières de la pièce pour mettre la préparation contre les mouches dans une obscurité relative.

Mesurez maintenant la résistance de l’électrode d’enregistrement dans l’œil. Il doit être compris entre 100 et 260 mégaohms. Parfois, la pointe est bloquée et peut être dégagée à l’aide des fonctions de bourdonnement capacitif et d’impulsion de courant de l’amplificateur.

Si cela ne vous aide pas, utilisez une nouvelle électrode. Ensuite, réglez l’amplificateur sur la pince ou le pont de courant et mettez à zéro la tension entre les électrodes. Une fois que la mouche s’est adaptée à l’obscurité pendant quelques minutes, enfoncez la pointe de l’électrode d’enregistrement dans l’œil par pas de 0,1 à un micron à l’aide d’un pas piézoélectrique ou en utilisant une rotation douce du bouton de résolution fine.

À chaque étape, stimulez l’œil avec un flash lumineux d’une à 10 millisecondes. Chaque flash lumineux provoquera une brève baisse de la tension ou de l’ERG. Lorsque la pointe de l’électrode pénètre dans la lame et se referme sur les LMC, l’ERG s’inverse.

Procédez ensuite à la prise de mesures. En raison de la non-invasivité, la performance du signal des cellules individuelles peut être étudiée dans leur état proche de la nature. La réponse en tension d’un photorécepteur R1-R6 à une lumière faible et brillante a été mesurée à 20 degrés Celsius.

Ensuite, un photorécepteur R1-R6 a été comparé à un LMC à 25 degrés Celsius. Chacun a été mesuré sur une mouche différente, car les enregistrements intracellulaires par deux microélectrodes pointues dans la même mouche sont trop difficiles pour être viables. La répétabilité des réponses devient évidente lorsque les données sont superposées.

Les rapports signal/bruit dans le domaine fréquentiel ont été obtenus en transformant les morceaux de données de signal et de bruit en spectre de puissance, puis en divisant le spectre de puissance moyenne du signal par le spectre de puissance de bruit moyen correspondant. Le résultat peut être extrêmement sensible aux signaux dans les meilleures préparations. Cette technique peut être utilisée pour enregistrer de nombreuses espèces.

Les mouches Coenocia ont reçu la même stimulation lumineuse naturaliste et répétitive à 19 degrés Celsius. Les données ont été prélevées avant et après la synthèse de la même mouche en avançant l’électrode d’enregistrement. La dynamique plus rapide de l’enregistrement est cohérente avec la nature prédatrice de cette espèce.

Une fois masterisée, cette technique permet des enregistrements toujours longs et de haute qualité si elle est correctement réalisée. En essayant cette procédure, il est important de réaliser, je veux dire que c’est comme apprendre à jouer du piano. Plus vous pratiquez, meilleurs seront les résultats que vous obtiendrez.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que des interventions pharmacologiques, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que le rôle des neuromodulateurs dans la formation des réponses. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiophysique pour explorer comment optimiser l’information lumineuse, capturer et transférer, ainsi que les réactions biochimiques caustiques dans la machinerie de phototransduction et dans les sciences biologiques suivantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer la drosophile pour les expériences intracellulaires et comment réveiller les réponses neurologiques de ses photorécepteurs et interneurones.