Name: Méthode électrophysiologique de réponses denregistrement intracellulaire tension de Drosophila Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Découvrez l'enregistrement intracellulaire des réponses électriques des photorécepteurs et interneurones visuels de Drosophila à des stimuli lumineux contrôlés. Cette technique fournit des enregistrements de haute qualité avec un minimum de dommages cellulaires.

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Les auteurs remercient Mick Swann, Chris Askham et Martin Gautrey pour leurs importantes contributions à la conception et à la construction de nombreux composants électriques et mécaniques des plates-formes. Les recherches actuelles de MJ sont soutenues par le Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC Grant : BB/M009564/1), le fonds de recherche ouvert State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning (Chine), High-End Foreign Expert Grant (Chine), Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (Finlande) et la subvention Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

Les auteurs n’ont rien à révéler

Nous avons présenté les étapes clés de base de l’utilisation de microélectrodes conventionnelles tranchantes pour enregistrer les réponses intracellulaires des photorécepteurs R1-R6 et des LMC dans les yeux de mouche intacts. Cette méthode a été optimisée, en collaboration avec du matériel et des outils logiciels sur mesure, au cours des 18 dernières années pour fournir des enregistrements de haute qualité et durables afin de répondre à un large éventail de questions expérimentales. En investissant du temps et des ressources dans la construction d’installations expérimentales robustes et précises, et pour produire des microélectrodes aux propriétés électriques favorables, des enregistrements de haute qualité peuvent devenir la norme dans tout laboratoire travaillant sur la neurophysiologie visuelle de la drosophile . Bien que des systèmes d’enregistrement et de stimulation lumineuse bien conçus soient importants pour l’exécution rapide de différents paradigmes expérimentaux, il y a trois étapes procédurales qui sont encore plus essentielles pour obtenir des enregistrements réussis : (i) effectuer la préparation de la mouche avec un minimum de lésions oculaires, (ii) tirer des microélectrodes ayant les bonnes propriétés électriques, et (iii) enfoncer l’électrode d’enregistrement dans l’œil sans casser sa pointe. En fin de compte, pour enregistrer des données significatives, l’enquêteur doit comprendre les bases physiques de l’électrophysiologie et comment fabriquer des microélectrodes appropriées pour les types de cellules ciblés.
Par conséquent, les limites de cette technique sont principalement fixées par la patience, l’expérience et la capacité technique de l’investigateur. Parce que cette technique peut prendre beaucoup de temps à maîtriser pour les petites cellules de drosophile , il est conseillé aux électrophysiologistes stagiaires de s’entraîner d’abord avec des yeux d’insectes plus grands, tels que la moucheà viande 36 ou le criquet35, en utilisant le même montage. Une fois que la réalisation d’enregistrements intracellulaires de haute qualité à partir des photorécepteurs et des interneurones plus grands devient une routine, il est temps de passer à l’œil de la drosophile . Une autre limite de la technique concerne l’identification cellulaire. Les cellules de drosophile pénétrées peuvent être chargées électrophorétiquement avec des colorants, y compris le jaune de Lucifer ou la neurobiotine. Cependant, en raison de la petite taille de la pointe des microélectrodes, l’électrophorèse fonctionne moins efficacement qu’avec des électrodes à faible résistance, telles que les électrodes patch. De plus, les microélectrodes remplies de colorant ont généralement des propriétés électriques moins favorables, ce qui rend beaucoup plus difficile l’enregistrement de réponses de haute qualité à partir des photorécepteurs de la drosophile et des LMC.
Un problème technique qui se produit parfois est un signal d’entrée instable ou une absence totale de celui-ci. Cela est souvent associé au fait que le signal de tension est soit en constante dérive, soit supérieur/inférieur à la plage d’enregistrement de l’amplificateur. Dans la plupart des cas, ce comportement est causé par le blocage de l’électrode d’enregistrement (ou par le fait que sa pointe est trop fine - ayant une résistance ou une capacité intra-muros trop élevée - pour effectuer correctement des changements de signal rapides). Bien que l’on puisse essayer de débloquer la pointe en actionnant la capacité de l’électrode, ce qui fonctionne parfois, la meilleure solution est souvent de changer simplement l’électrode d’enregistrement. Cela peut nécessiter des ajustements de paramètres dans l’instrument d’extraction de microélectrodes pour réduire la résistance de la pointe des nouvelles électrodes. L’embout de l’électrode peut également se boucher dans les préparations, pour lesquelles il a fallu trop de temps pour couvrir le trou de la cornée avec de la vaseline. Un contact prolongé avec l’air peut assécher le tissu rétinien fraîchement exposé, transformant sa couche superficielle en une substance semblable à de la colle. Si tel est le cas, l’enquêteur voit généralement une tache rouge de tissu collée sur l’électrode d’enregistrement lorsqu’il la retire de l’œil. La seule solution ici est de faire une nouvelle préparation. La vaseline peut offrir de nombreux avantages pour les enregistrements électrophysiologiques : (i) elle empêche la coagulation de l’hémolymphe qui pourrait casser l’extrémité de l’électrode ; (ii) il recouvre la pointe de l’électrode, réduisant ainsi sa capacité intra-muros, ce qui abaisse la constante de temps de l’électrode, et a donc le potentiel d’améliorer la résolution temporelle des signaux neuronaux enregistrés40,41 ; (iii) il maintient la pointe de l’électrode propre, facilitant les pénétrations ; et après la pénétration, (iv) il peut même être utile de sceller l’extrémité de l’électrode à la membrane cellulaire42. 
Le signal peut en outre être instable ou perdu lorsque le fil de chlorure d’argent du porte-électrode est cassé ou déchloridisé ; Dans ce cas, il suffit de remplacer ou de rechloridiser l’ancien fil. Le signal manquant peut également résulter du fait que l’un (ou les deux) des porte-électrodes n’est pas correctement connecté à leurs prises. Cependant, il est extrêmement inhabituel qu’une pièce d’équipement fonctionne mal. Si le signal est indétectable et que toutes les autres possibilités ont été épuisées, vérifiez que chaque partie de l’appareil d’enregistrement, y compris le pavillon, l’amplificateur, les filtres passe-bas et les convertisseurs AD/DA, est correctement connectée et fonctionne normalement. Une façon d’y parvenir est de remplacer chaque instrument par un autre à partir d’une plate-forme connue pour fonctionner normalement. Vous pouvez également utiliser un générateur de signaux pour vérifier les performances des composants électroniques un par un.
Mais le problème technique le plus courant auquel l’électrophysiologiste est confronté est peut-être celui de l’enregistrement du bruit. D’une manière générale, l’enregistrement du bruit est l’activité électrique observée autre que la réponse neuronale directe à un stimulus donné. Parce que la préparation de la mouche, lorsqu’elle est correctement faite, est très stable, le bruit observé (au-delà de la variation naturelle des réponses) résulte le plus souvent de boucles de masse dans l’équipement d’enregistrement, ou est capté par des appareils électriques à proximité. Ce bruit est généralement un bourdonnement du secteur de 50/60 Hz et ses harmoniques ; mais parfois composé de formes d’onde plus complexes. Pour déterminer l’origine du bruit, retirez le support de préparation contre les mouches de l’installation, connectez les électrodes d’enregistrement et de référence à travers une goutte de Ringer (ou placez-les dans un petit bain de solution de Ringer ; voir étape 1.2.6) et enregistrez le signal en mode CC ou pont. Si le bruit est observable sur le signal enregistré, cela signifie probablement que le bruit est externe à la préparation de la mouche.
Un autre bon test pour identifier l’origine du bruit consiste à remplacer les porte-électrodes par un modèle de cellule électrique connecté à l’amplificateur. Dans une configuration idéalement configurée et mise à la terre, le signal enregistré devrait maintenant être pratiquement sans bruit, ne montrant que le bruit binaire stochastique du convertisseur AD (dans le meilleur des cas, même pas cela !). Si le bruit est toujours présent, vérifiez à nouveau que tout l’équipement de forage est correctement mis à la terre. Une approche pratique pour détecter les boucles de terre consiste à : (i) déconnecter tous les fils de mise à la terre de toutes les pièces à l’intérieur de la plate-forme ; (ii) s’assurer qu’après cela, chaque pièce est effectivement isolée de la terre, au moyen d’un ohmmètre ; (iii) Connectez les pièces, une par une, à la terre centrale directement, et non par l’intermédiaire d’une autre partie de la plate-forme. Essayez également de modifier la configuration de l’équipement. Par exemple, le fait d’éloigner l’ordinateur et le moniteur de l’appareil de forage peut parfois réduire le bruit. Pourtant, à d’autres moments, le déplacement de l’ordinateur à l’intérieur du rack d’équipement réduit le bruit. Il vaut également la peine de débrancher les équipements à proximité pour voir si le bruit est réduit ou protéger des composants supplémentaires. De plus, essayez de débrancher ou de remplacer différents composants de l’appareil d’enregistrement, en particulier les câbles BNC (qui peuvent avoir des connexions à la terre défectueuses). Si seul un bruit binaire est observé lors de l’utilisation du modèle de cellule, la source de bruit initiale est soit les électrodes, soit la préparation de la mouche elle-même. Par exemple, il se peut que l’électrode de référence touche par inadvertance un nerf moteur ou des fibres musculaires actives à l’intérieur de la capsule cérébrale (ou perturbe les muscles de vol du thorax - si elle y est placée). Il est généralement plus simple de préparer une nouvelle mouche pour l’enregistrement, en prenant soin de minimiser les dommages causés à la mouche. Mais si le bruit persiste et qu’il s’agit d’une large bande, il est probable que les électrodes ne soient pas optimales pour les expériences ; trop tranchant/fin (donc trop bruyant) ou tout simplement mauvais pour l’usage ; Nous avons même vu des électrodes de quartz agir comme des antennes - captant de faibles signaux de diffusion ! Bien que l’itération des paramètres de l’instrument extracteur pour générer les bonnes microélectrodes pour des enregistrements de haute qualité cohérents à partir de types de cellules spécifiques puisse demander beaucoup d’efforts, cela en vaut la peine. Une fois que les électrodes d’enregistrement sont bien adaptées aux expériences, elles peuvent fournir des enregistrements durables d’une qualité exceptionnelle.
Des techniques d’enregistrement à microélectrodes pointues peuvent être appliquées de la même manière pour étudier le traitement de l’information neuronale dans une multitude de préparations, y compris différentes couches de traitement dans les yeux etle cerveau des insectes. Étant donné que les pointes des microélectrodes peuvent être très fines, celles-ci endommagent généralement moins les cellules étudiées que la plupart des applications de patch-clamp. Il est important de noter que les amplificateurs modernes à microélectrodes d’échantillonnage et de maintien permettent un bon contrôle des propriétés électriques des pointes40, 45-47. Ainsi, lorsqu’elle est correctement appliquée, cette technique peut fournir des données fiables à partir de préparations in vivo3,5,7-10,44 ou in vitro48 avec un rapport signal/bruit élevé à une résolution inférieure à la milliseconde. Une telle précision serait impossible avec les techniques d’imagerie optique d’aujourd’hui, qui sont plus bruyantes et plus lentes. De plus, la méthode peut être utilisée pour caractériser les propriétés de la membrane électrique des petites cellules à la fois dans des configurations de pince de courant et de tension5,29,33,36,40-42,49, fournissant des données précieuses pour les approches de modélisation biophysique et empirique7,8,11,33,49-54 qui relient les expériences à la théorie.

La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) composé oeil est un système modèle grand pour enquêter sur l&#39;organisation fonctionnelle des photorécepteurs et interneurones tableaux pour l&#39; image neuronal échantillonnage et le traitement, et pour la vision des animaux. Le système a le schéma de câblage le plus complet 1,2 et est aimable aux manipulations génétiques et précise la surveillance de l&#39; activité neuronale (de haut rapport signal-bruit et résolution temporelle) 3-10. L&#39;œil de drosophile est modulaire, contenant ~ 750 structures de lentilles coiffées apparemment régulières appelées ommatidia, qui fournissent ensemble le champ visuel panoramique qui couvre presque toutes les directions autour de sa tête volée. L&#39; information primaire de l&#39;œil unités d&#39; échantillonnage sont ses photorécepteurs rhabdomeric 7,8,11. Chaque ommatidium contient huit cellules photoréceptrices (R1 à R8), qui partagent le même objectif de facette, mais sont alignés sur sept directions différentes. Alors que les photorécepteurs externes R1-R6 are plus sensible à la lumière bleu-vert, les sensibilités spectrales des cellules internes R7 et R8, qui se situent au - dessus de l&#39;autre et pointer vers la même direction, présentent trois sous - types distincts: pâle, zone de bord jaune et dorsale (DRA) 12- 15. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Figure 1. Organisation fonctionnelle du Drosophila Eye. (A) Les deux premiers noyaux optiques, rétine et lamina, sont mis en évidence en gris dans l&#39;œil de mouche. Photorécepteurs Retina R1-R6 et lamina grandes cellules monopolaires (LMC: L1-L3) sont facilement accessibles in vivo à des enregistrements classiques de microélectrodes pointus. L&#39;électrode schématique montre le trajet normal à enregistrer à partir de R1 à R6 dans la rétine. Un chemin d&#39;accès à enregistrer à partir de LMC dans le limbe est de déplacer en parallèle l&#39;électrode à gauche. (B) Lamina est une matrice d&#39;organe rétinotopiquecartouches lisés, dont chacun est emballé avec les neurones qui traite des informations à partir d&#39;une petite zone spécifique dans l&#39;espace visuel. En raison de la superposition de neurones, six photorécepteurs de différents ommatidia voisins envoient leurs axones (R1-R6) à la même cartouche de lame, formant des synapses de sortie histaminergiques à L1 à L3 et d&#39;une cellule amacrine (Am). (C) La diffusion de l&#39; information neuronale entre les terminaisons axonales R1-R6 et les interneurones visuels (y compris L4, L5, Lawf, C2, C3 et T1), à l&#39; intérieur d&#39; une cartouche de lamina est complexe. (D) R1-R6 axones photoréceptrices reçoivent des évaluations synaptiques de cellules monopolaires L2 et L4. (B) et (C) modifié de Rivera-alba et al 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> L&#39;œil de drosophile est du type neuronal superposition 16. Cela signifie que tchapeau les signaux neuronaux de huit photorécepteurs appartenant à sept ommatidia voisin, qui ressemblent au même point dans l&#39;espace, sont réunies ensemble à une cartouche de neurones dans les deux prochaines neuropils: le limbe et la moelle. Tandis que les six photorécepteurs externes du projet R1-R6 leurs terminaisons axonales de neurones à des colonnes dans la feuille (figure 1), les cellules R7 et R8 contourner cette couche et à établir des contacts synaptiques avec leur colonne rachidien 17-19 correspondante. Ces câblages exactes produisent le substrat neuronal pour la cartographie rétinotopique de mouche vision précoce, après quoi tous les lamina (Figures 1A-C) et de la colonne medulla (cartouche) représente un seul point dans l&#39; espace. Les apports directs de photorécepteurs R1-R6 sont reçus par les grandes cellules monopolaires (de LMC: L1, L2 et L3) et la Cellule amacrines (Am) dans la lamina 1,2,20. Parmi ceux - ci, L1 et L2 sont les plus grandes cellules, médiateurs principales voies d&#39;information (figure 1D), which répondent à l&#39; intérieur et à bords Off-déplacement, et forment ainsi la base de calcul du détecteur de mouvement 21,22. Expériences comportementales suggèrent qu&#39;au contraste intermédiaire, les deux voies facilitent la perception du mouvement des directions opposées: back-to-front en L1 et avant-arrière dans les cellules L2 23,24. Connectivité implique en outre que les neurones L4 peuvent jouer un rôle essentiel dans la communication latérale entre les cartouches voisines 25,26. synapses réciproques ont été trouvées entre les cellules L2 et L4 situées dans le même et deux cartouches adjacentes. En aval, chaque cellule L2 et ses trois cellules L4 associés projettent leurs axones vers un objectif commun, le neurone Tm2 dans le bulbe rachidien, où les entrées de cartouches voisines sont soupçonnés d&#39;être intégré pour le traitement de l&#39; avant vers l&#39; arrière le mouvement 27. Bien que les neurones L1 reçoivent des commentaires du même cartouche L2 via les jonctions lacunaires et synapses, ils ne sont pas directement reliés aux cartouches lamina L4S et donc adjacents. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; évaluations synaptiques à R1-R6 axones photoréceptrices sont fournis uniquement par les neurones appartenant aux circuits / L4 L2 mais pas la voie 1,2 L1 (figure 1D). Tandis que les connexions de même cartouche sont sélectivement L2 R1 et R2 et de R5 à L4, les photorécepteurs R1-R6 synaptiques reçoivent une rétroaction à partir L4 de l&#39;une ou les deux cartouches voisines. En outre, il y a de fortes connexions synaptiques de Am à R1, R2, R4 et R5, et les cellules gliales sont également synaptique connectés au réseau et peuvent ainsi participer au traitement de l&#39; image neuronal 6. Enfin, gap-jonctions axonales, reliant voisins R1-R6 et entre R6 et R7 / R8 photorécepteurs dans la lamina, contribuent à la représentation de l&#39; asymétrie d&#39; information et de traitement dans chaque cartouche 14,20,28. Enregistrements de tension intracellulaires de photorécepteurs individuels et des interneurones visuels dans presque intact Drosophila offrent une haute r signal-bruitdonnées atio à une résolution inférieure à la milliseconde 3,5,7-10,29, qui est nécessaire pour donner un sens aux calculs neuronaux rapides entre les neurones connectés. Ce niveau de précision est impossible par des techniques d&#39;imagerie optique actuelles, qui sont nettement plus bruyants et opèrent généralement à 10-100 résolution msec. En outre, parce que les électrodes ont de très petits et pointus conseils, la méthode ne se limite pas à des organismes cellulaires, mais peut fournir des enregistrements directs de petites structures neurales actives; tels que des arbres dendritiques des LMC ou axones photoréceptrices, qui ne peuvent être accessibles par beaucoup plus grandes pointes des électrodes de patch-clamp. Fait important, la méthode est aussi structurellement moins invasive et dommageable que la plupart des applications de patch-clamp, et affecte donc moins intracellulaire milieu et de l&#39;information d&#39;échantillonnage »les cellules étudiées. Ainsi, les techniques classiques de microélectrodes nettes ont contribué, et de continuer à contribuer, les découvertes fondamentales et un aperçu original dans infor neuronalle traitement de l&#39;infor- à l&#39;échelle de temps appropriée; améliorer notre compréhension des mécanismes de la vision 10/03. Cet article explique comment les enregistrements intracellulaires in vivo de la drosophile photorécepteurs et LMC R1-R6 sont effectuées dans le laboratoire Juusola. Ce protocole décrit comment construire une plate-forme d&#39;électrophysiologie approprié, préparer la mouche, et effectuer les enregistrements. Certaines données représentatives sont présentées, et des problèmes communs et les solutions possibles sont discutées qui peuvent être rencontrées lors de l&#39;utilisation de cette méthode.

<table><tbody><tr><td>Microscope stéréo Zoom pour la préparation de la mouche</td><td>Olympus</td><td>SZX12 Oculaires PF DFPLFL1,6x : WHN30x-H/22</td><td>Capable d’un grossissement de ~150X avec une longue distance de travail ; support de table en acier lourd sur mesure</td></tr> Support de table <tr><td>Stéréomicroscope dans la configuration intracellulaire</td> <td>et middot ; &nbsp ; Olympus</td><td>Olympus SZX7 ; oculaires : WHN30x-H/22</td><td>Les oculaires 30X sont nécessaires pour bien voir les réflexions de la pointe de l’électrode lors de son passage à travers le petit trou cornéen dans l’œil</td></tr><tr><td>Microscope Nikon</td><td>SMZ645 ; oculaires : C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibration</td><td>Melles Griot</td><td>Avec trous métriques M6 sur la plaque d’essai</td><td>Nos plates-formes sur mesure ont un grand trou percé à travers l’épaisse planche à pain qui laisse entrer le poteau de la plate-forme de préparation des mouches (abrite un dissipateur thermique en cuivre avec électronique) sous</td></tr> les micromanipulateurs <tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige Narishige</td><td>NMN-21</td><td>Dans nos installations intracellulaires, différents systèmes de micromanipulateurs sont utilisés pour enfoncer les électrodes d’enregistrement Shap dans l’œil de la mouche. Tous les manipulateurs répertoriés fournissent avec succès des enregistrements stables et durables à partir des photorécepteurs de la drosophile et des LMC.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley axe xyz avec commande</td><td></td><td></td>manuelle fine</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex triple axe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml ; rzh&auml ; utilisateur</td><td>M&auml ; rzh&auml ; utilisateur DC-3K avec pas à pas piézoélectrique supplémentaire sur l’axe X et contrôleur</td><td></td><td></td>MS 314</tr><tr><td>Supports magnétiques</td><td>N’importe quelle base magnétique avec interrupteur marche/arrêt fera l’affaire</td><td></td><td>Par exemple, pour gérer les câbles à l’intérieur de la cage de Faraday</td></tr><tr><td>Porte-électrodes</td><td>Harvard Apparatus Harvard</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments&nbsp ;</td><td>AGW1510</td><td>0,3 à 0,5 mm de diamètre ; doit être chloridisé pour les porte-électrodes</td></tr><tr><td>Source de lumière à fibre optique</td><td>De nombreuses applications différentes, y compris</td> les faisceaux de fibres optiques Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Technologie</td><td>UltraFine</td><td></td><td>Pour fournir le stimulus lumineux LED au système de bras à cardan. Nous utilisons à la fois des guides de lumière liquide et en quartz (allant de l’UV à l’IR)</td></tr><tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack de 100 Pcs</td><td>Coupez le fond conique du tube de centrifugation en plastique de 50 ml et collez-y une pointe de pipette de 1 ml.</td></tr><tr><td>Système d’acquisition numérique</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur à microélectrodes à pince de courant/tension à électrode</td><td>unique npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Performant !</td></tr><tr><td>Étage de tête</td><td>Standard (+/- 150 nA)</td>Pour les sources lumineuses et les pilotes <td>LED npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 canaux OptoLED (Cairn Research Ltd., Royaume-Uni)</td><td></td><td>Beaucoup de nos systèmes de stimulus sont construits en interne.</td></tr><tr><td>De</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>nombreuses entreprises choisissent parmi Biosyst</td><td></td><td>, un système basé sur Matlab écrit sur mesure pour les travaux expérimentaux et théoriques dans le laboratoire de Juusola,</td></tr><tr><td>un ordinateur personnel ou un Mac</td><td></td><td></td><td>Assurez-vous que le PC ou le Mac est compatible avec le système et le logiciel d’acquisition de données</td></tr><tr><td>.</td><td>Conçu et construit</td><td></td> par <td>l’entreprise Positionnement précis des stimuli lumineux Système de contrôle de</td></tr><tr><td>la température Peltier</td>Cage de Faraday <td>auto-conçue</td> et construite <td></td><td></td></tr><tr><td>Blindage contre le bruit électromagnétique</td><td></td><td></td> Capillaires en verre borosilicaté filamenté Diamètre extérieur : 1 mm Diamètre intérieur : 0,5 - 0,7 mm Capillaires en verre de quartz filamenté Diamètre extérieur : 1 mm Diamètre intérieur : 0,5 -<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Extracteur de pipette 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modèle P-2000 laser Extracteur de micropipette flamboyant/brun</td><td>Pour les électrodes de référence en borosilicate, utilisez le programme prédéfini #11 (électrodes de patch) : Chaleur = 350 ; Filament = 4 ; Vitesse 36 ; Retard = 200).1.2.1). Pour les électrodes d’enregistrement en borosilicate, utilisez le programme prédéfini #12 (cela permet généralement d’obtenir de bons dièses conventionnels pour les enregistrements de photorécepteurs) : Chaleur = 355 ; Filament = 4 ; Vélocité 50 ; Retard = 225 ; Traction = 150. Pour les enregistrements LMC, qui nécessitent des électrodes avec des pointes plus fines, ces valeurs doivent être ajustées. Pour tirer des capillaires en quartz, le manuel P-2000 suggère des programmes pour les microélectrodes à pointe fine. Ces programmes' Les paramètres prédéfinis servent de points de départ utiles pour des modifications systématiques afin de générer des électrodes avec un bon succès de pénétration et un faible bruit d’enregistrement.</td></tr><tr><td>Solution de résonance extracellulaire pour l’électrode de référence</td><td>Produits chimiques de Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, saccharose</td><td>Voir la recette dans le protocole</td></tr><tr><td>section 3 M KCl solution pour le remplissage de la microélectrode d’enregistrement filamentée</td><td>Sels de Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de</td><td></td><td></td><td></td>rasoir non en acier inoxydable</tr><tr><td>Porte-lame/brise-lames</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternativement, utilisez de la pâte à modeler</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (pointes super-fines)</td></tr></tbody></table>

méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; drosophila</em&gt; photorécepteurs et interneurones à light stimuli<em&gt; in vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Les réponses en tension des photorécepteurs d’insectes et des interneurones visuels peuvent être enregistrées avec précision avec des microélectrodes pointues conventionnelles. La méthode décrite ici permet à l’investigateur de mesurer des réponses intracellulaires de haute qualité de longue durée (de quelques minutes à quelques heures) à partir de photorécepteurs uniques R1-R6 de la drosophile et de grandes cellules monopolaires (LMC) à des stimuli lumineux. Parce que le système d’enregistrement a un faible bruit, il peut être utilisé pour étudier la variabilité entre les cellules individuelles de l’œil de la mouche et comment leurs sorties reflètent les propriétés physiques de l’environnement visuel. Nous décrivons toutes les étapes clés de la réalisation de cette technique. Les étapes de base de la construction d’un dispositif électrophysiologique approprié pour l’enregistrement, telles que la conception et le choix de l’équipement expérimental, sont décrites. Nous expliquons également comment se préparer à l’enregistrement en faisant un enregistrement approprié (tranchant) et des électrodes de référence (émoussées). Des détails sont donnés sur la façon de fixer une mouche intacte dans un porte-mouche sur mesure, de préparer une petite fenêtre dans son œil et d’insérer une électrode d’enregistrement à travers ce trou avec un minimum de dommages. Nous expliquons comment localiser le centre du champ récepteur d’une cellule, adapter l’obscurité ou la lumière de la cellule étudiée et enregistrer ses réponses en tension aux stimuli lumineux dynamiques. Enfin, nous décrivons les critères d’enregistrement de normales stables, montrons les réponses en tension caractéristiques de haute qualité des cellules individuelles à différents stimuli lumineux et définissons brièvement comment quantifier leurs performances de signalisation. De nombreux aspects de la méthode sont techniquement difficiles et nécessitent de la pratique et de la patience pour être maîtrisés. Mais une fois appris et optimisé pour les objectifs expérimentaux de l’investigateur, il fournit des données neurophysiologiques in vivo exceptionnelles.

La méthode d&#39;enregistrement de microélectrodes forte, adaptée ici pour l&#39;œil de drosophile, peut être utilisé pour quantifier de façon fiable neuronal échantillonnage de l&#39; information et de traitement dans les cellules de la rétine et de la lamina, et la communication entre les 4,5,7,8,10,33. En l&#39;utilisant pour étudier le codage dans différentes actions de type sauvage, des mutants ou des souches de mouches génétiquement modifiées, la méthode a fait ses preuves; non seulement pour quantifier les effets d&#39;une mutation, la température, l&#39; alimentation ou l&#39; expression sélectionnée 3,4,6,9,10,14,30,34, mais aussi en révélant des raisons mécanistes pour les comportements visuels altérés 14,34. Le procédé est également facilement applicable à d&#39; autres préparations d&#39;insectes, 35,36 habilitation des études de vision neuroethological. Ensuite, nous présentons quelques exemples de ses applications réussies. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Figure 7 TensionRéponses d&#39;un Fruit Fly R1-R6 photorécepteur à une impulsion de lumière à 20 et 25 o C. Parce que les pénétrations de microélectrodes vives sont souvent très stable, il est possible d&#39;enregistrer les réponses de tension de la même photorécepteur R1-R6 à un stimulus lumineux donné au différentes températures ambiantes par le réchauffement ou le refroidissement de la mouche. Dans nos set-ups, le porte-mouche est placé sur un système de contrôle de température à base Peltier-élément en boucle fermée. Cela nous permet de changer la température de la tête de la mouche en quelques secondes. Une température plus élevée accélère les réactions de tension et abaisse le potentiel de repos de photorécepteurs R1-R6 (comme indiqué par des flèches rouges) caractéristique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> L&#39; étude de l&#39;effet de la température sur photorécepteur sortie <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Avec un bien conçu et un système d&#39;enregistrement isolé des vibrations, la méthode peut être utilisée pour mesurer l&#39;effet de la température sur la production de neurones d&#39;une cellule individuelle par le réchauffement ou le refroidissement de la mouche. L&#39;exemple suivant montre les réponses de tension à une impulsion de 10 msec de temps lumineux, enregistré dans le même photorécepteur R1 à R6 et 20 à 25 ° C (figure 7). Comme quantifiée avant 4,9, le réchauffement réduit le potentiel de repos d&#39;un photorécepteur dans l&#39; obscurité, et accélère ses réponses de tension. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Figure 8. Signalisation Performance d&#39; un Fruit Fly R1-R6 photorécepteur améliore avec l&#39; intensité lumineuse (A) Sortie de photorécepteur à dim (ci - dessous) et lumineux. (Ci - dessus; 10.000 fois la lumière plus brillante) répétées séries temporelles d&#39;intensité lumineuse naturaliste enregistrée par le même microélectrodesdans la même cellule à 20 ° C. Les réponses au stimulus lumineux sont plus grandes, parce qu&#39;ils intègrent plus d&#39; échantillons, des réponses élémentaires (bosses) à photons uniques 4,5,7,8. (B) 20 réponses consécutives de tension d&#39; une seconde-longues sont superposées. Les réponses individuelles (lumière gris) ont été prises après les tendances adaptatives (flèche en A) a reculé (encadré en pointillés dans A). Les moyens de réponse correspondants (les signaux) sont les traces foncées. La différence entre le signal et les réponses individuelles est le bruit. (C) Les cellules «performances de signalisation a été quantifiée par les enregistrements de signal-bruit Ratios (SNR) en utilisant les méthodes standard 4,5,7,8. Sortie photorécepteur a une portée d&#39; environ 64 Hz plus large de la signalisation fiable à la stimulation lumineuse ( &#39;de ≥1 vive, jusqu&#39;à 84 Hz qu&#39;au dim (SNR SNR)&#39; Dim ≥1, jusqu&#39;à 20 Hz), avec s-Ignal à bruit en améliorant grandement; de SNR Dim MAX = 87 à SNR brillant MAX = 1,868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Etudier l&#39; adaptation et Neural Encoding par Répétitive Stimulation La non - invasivité du procédé, ce qui provoque relativement peu de dommages aux structures de la rétine et de la lame, il est idéal pour étudier les performances de la signalisation des cellules individuelles à différents stimuli lumineux dans leur état ​​physiologique naturel près in vivo. La figure 8 montre les réponses de tension d&#39;un R1- R6 photorécepteur à un naturaliste temps d&#39;intensité lumineuse série stimulus répété faible et lumineux à 20 ° C, tandis que la figure 9 </strong&gt; montre les réponses d&#39; une autre photorécepteur R1-R6 et un LMC à un stimulus naturaliste différent à 25 o C. Les enregistrements pré et post - synaptiques ont été réalisées séparément de deux mouches différentes parce que les enregistrements intracellulaires simultanés par deux tranchants microélectrodes dans la même volée, l&#39; une dans la rétine et l&#39;autre dans la lamina, sont trop difficiles pour être viable 30. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> Figure 9. Réponses de tension d&#39;un Fruit Fly R1-R6 photorécepteur et LMC à répétition Naturalistic Stimulation à 25 o C (A) R1-R6 (gris) et LMC (noir) sorties enregistrées par microélectrodes différentes de différentes mouches. (B) 20 avant entièrement la lumière adaptée consécutive (ci - dessus) et post - synaptiques (ci - dessous) les réponses au même schéma de relance naturaliste avec des réponses individuelles, représenté en gris clair und les moyens correspondants de réponse (les signaux) que les traces les plus sombres. La différence entre le signal et les réponses individuelles est le bruit. (C) Les cellules «performances de signalisation a été quantifiée par les enregistrements de signal-bruit Ratios (SNR). Sortie LMC a une portée d&#39; environ 10 Hz plus large de la signalisation fiable (SNR &#39;LMC ≥1, jusqu&#39;à 104 Hz) que la sortie R1-R6 (SNR&#39; R ≥1, jusqu&#39;à 94 Hz). Les deux rapports signal sur bruit est élevé (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), et comme le bruit d&#39;enregistrement était faible, leurs différences reflètent des différences réelles de codage entre les cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.</a> Après le début de relance, les enregistrements typiquesly montrent l&#39;adaptation rapide des tendances qui s&#39;atténuent largement dans 5-6 sec. A partir de là, les cellules produisent des réponses très cohérentes à chaque présentation à long stimulus 1 sec (chaque boîte en pointillés entoure 20 de ceux-ci). La reproductibilité des réponses devient évidente lorsque celles - ci sont superposées (figure 8B et figure 9B). Les réponses individuelles sont les traces grises minces, et de leur dire la trace sombre plus épaisse. La réponse moyenne est pris comme signal de neurones, alors que le bruit de neurones est la différence entre la moyenne et chaque 4,5,9,37,38 de réponse individuelle. Les rapports respectifs signal-bruit dans le domaine fréquentiel (figure 8C et la figure 9C) ont été obtenus par transformation de Fourier du signal et de bruit blocs de données dans les spectres de puissance, et en divisant le spectre de puissance moyenne du signal avec le spectre de puissance de bruit moyenne correspondante 4, 5,9,37,38. De façon caractéristique, les rapports maximaux signal-bruit of les sorties neuronaux enregistrées à la stimulation naturaliste sont élevés (100 - 1000), et dans les préparations les plus stables avec le bruit d&#39;enregistrement très bas peut atteindre des valeurs &gt;&gt; 1000 (par exemple, la figure 8C.). Notez également que le réchauffement augmente les cellules de la bande passante de données fiables de signalisation 4 (SNR Bright ≥ 1); par exemple, la différence relative entre les deux R1- les R6 sur les figures 8 et 9, respectivement, est de 10 Hz (84 à 20 ° C et 94 Hz à 25 ° C). On peut en outre estimer le taux de transfert d&#39;information de son rapport signal sur bruit de chaque cellule en utilisant l&#39;équation Shannon 32, ou en calculant la différence entre l&#39; entropie et le bruit des taux d&#39;entropie des réponses grâce à la méthode d&#39;extrapolation triple 39. Plus de détails sur les informations des analyses théoriques, et leur utilisation et limitations spécifiquement avec cette méthode sont donnés dans les publications antérieures 7,8,39. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> Figure 10. Réponses de tension d&#39;un tueur Fly R1-R6 photorécepteur et LMC à répétition Naturalistic Stimulation à 19 o C (A) R1-R6 (gris) et LMC (noir) sorties enregistrées par le même microélectrodes de la même volée; postsynaptique premier et ensuite présynaptique, que l&#39;électrode a été avancé dans l&#39;oeil. (B) 20 pré consécutifs (ci - dessus) et post - synaptiques (ci - dessous) Réponses (traces gris clair) pour le même motif de stimulus naturaliste ont été capturés après l&#39; adaptation initiale (boîte en pointillés dans A). Leurs moyens sont les signaux (les traces sombres sur le dessus), tandis que leurs différences respectives aux réponses individuelles donnent le bruit. (C) correspondant SignaLes ratios l-bruit (SNR) ont été calculées comme dans les figures 8C et 9C. Sortie LMC a environ une plage de 100 Hz plus large de signalisation fiable (SNR &#39;LMC MAX ≥1, jusqu&#39;à 234 Hz) que la sortie R1-R6 (SNR&#39; R MAX ≥1, jusqu&#39;à 134 Hz). Les deux rapports signal sur bruit est élevé (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), et que le même microélectrodes a été utilisé dans les enregistrements, leurs différences reflètent des différences réelles dans les sorties de neurones pré- et post - synaptiques. Ces résultats impliquent que le système d&#39;enregistrement avait peu de bruit, et son influence sur les analyses était marginal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Neuroethological études Vision </p&gt; Le procédé peut également être utilisé pour enregistrer les réponses pré- et post - synaptiques tension des yeux composés de différentes espèces d&#39;insectes 7,8,35,36 (figure 10), ce qui permet des études comparatives neuroethological de traitement de l&#39; information visuelle. Pour le système d&#39;enregistrement présenté, la seule adaptation nécessaire est-détenteurs de préparation de nouvelles, chacune avec une ouverture de taille appropriée pour les espèces étudiées. Ces enregistrements sont exemplaires à partir d&#39;un tueur femelle voler (Coenosia de attenuata). Ils montrent des réponses de tension intracellulaire d&#39;un photorécepteur R1 à R6 et LMC à une stimulation lumineuse répétitif identique, que celle utilisée pour les homologues de Drosophila de la figure 9, mais à 19 ° C Dans ce cas, à la fois pré- et post-synaptiques des données ont été enregistrées à la même volée; une après l&#39;autre, avec la même électrode d&#39;enregistrement (rempli de 3 M de KCl) avançant à travers la première lame latérale avant de la saisirment la rétine frontale. En comparaison avec les données de drosophile à 25 o C, les données Coenosia - même à la température plus froide - montre les réponses avec une dynamique plus rapide; élargir la gamme de signalisation fiable (rapport signal-bruit &gt;&gt; 1) sur une gamme de fréquences plus large. De telles adaptations fonctionnelles dans le codage neuronal des stimuli naturalistes sont compatibles avec le mode de vie prédateur de Coenosia 36, qui exigent de haute précision des informations spatiotemporelle pour atteindre les comportements de chasse aériens rapides.

Des microélectrodes tranchantes permettent une caractérisation électrophysiologique précise des photorécepteurs et de la sortie d’interneurones visuels chez la drosophile vivante. Nous montrons ici comment utiliser cette méthode pour enregistrer les réponses en tension de haute qualité de cellules individuelles à une stimulation lumineuse contrôlée. Cette méthode est idéale pour étudier le traitement de l’information neuronale dans les yeux composés d’insectes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer les réponses électriques intracellulaires des photorécepteurs de la drosophile et des interneurones visuels à des stimuli lumineux contrôlés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du neurocodage, telles que la façon dont un stimuli lumineux l’encode dans l’une de ses réponses, ou comment ses informations visuelles, ses photorécepteurs et ses interneurones s’extraient des stimuli lumineux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir des enregistrements durables et de haute qualité de l’étude, avec peu de dommages au milieu intracellulaire et à l’échantillonnage d’informations.La caractéristique de démonstration que cela peut affecter est essentielle car ses différentes étapes sont difficiles à apprendre à exécuter correctement sans les voir. Tirez une microélectrode de référence à partir de borosilicate filamenté ou d’un tube en verre de quartz à l’aide d’un extracteur de pipette standard. Essayez d’obtenir une réduction courte et progressive.Les réglages exacts varient d’un instrument à l’autre. La taille des pores à l’extrémité n’est pas cruciale car elle sera cassée pour les expériences. Ensuite, tirez une électrode d’enregistrement du même tube de verre et essayez d’obtenir un cône fin et progressif de 10 à 15 millimètres de long.Au microscope optique, montez l’électrode sur une face en verre avec plusieurs adhésifs et utilisez un objectif à air 40x pour inspecter sa pointe. Une bonne électrode se rétrécit doucement jusqu’à une pointe invisiblement petite, autour de laquelle des motifs d’interférence parallèles continus plus sombres et plus clairs peuvent être vus. Juste avant l’expérience, remplissez l’électrode de référence avec des bagues anti-mouches, à l’aide d’une seringue de cinq millilitres reliée à un filtre à particules, avec un embout en plastique fin.Pour les expériences sur les photorécepteurs, chargez l’électrode d’enregistrement avec 3 molaires de chlorure de potassium jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme à son extrémité large. Cela minimisera le bruit de la jonction liquide pendant l’enregistrement. Pour travailler avec des LMC histaminergiques, remplissez les électrodes d’enregistrement avec de l’acétate de potassium à 3 molaires, du chlorure de potassium à 0,5 millimolaire pour minimiser l’effet sur la batterie de chlorure de la cellule.Commencez par remplir un flacon de mouches fraîches avec des mouches âgées de cinq à 10 jours. Les jeunes mouches sont plus fragiles, mais peuvent être enregistrées. Sélectionnez la première mouche pour l’électrophysiologie.Les grandes femelles sont les plus faciles à travailler. Lorsqu’ils sont dans le tube de capture, profitez de leur tendance inhérente à grimper vers le haut dans la pointe de la pipette et à boucher la plus petite pointe. Ensuite, connectez une seringue de 100 millilitres avec un tuyau en plastique flexible à la pointe de la pipette, qui est agrandie juste pour laisser passer une drosophile et connectez l’autre extrémité à une grande pointe de pipette fixée au porte-mouche.Ensuite, pressez un petit volume d’air de la seringue pour éjecter la mouche dans le porte-mouche. Regardez à travers le stéréomicroscope et administrez doucement plus d’air jusqu’à ce que la tête de la mouche dépasse de l’extrémité conique du porte-mouche. Assurez-vous que la mouche est fermement coincée par son thorax.Fixez ensuite la mouche avec de la cire d’abeille. Utilisez la température la plus basse du chauffe-cire pour faire fondre proprement la cire, qui apparaîtra transparente. S’il fait trop chaud, la cire brûlera.Immobilisez la tête de la mouche en appliquant un peu de cire d’abeille sur le proboscis et le coin de l’œil droit, en évitant la cornée. Fixez ces deux points au porte-mouche. Terminez cette étape rapidement pour éviter de brûler la mouche.Ensuite, mettez des lunettes et fabriquez un microcouteau. Serrez une lame de rasoir non en acier inoxydable avec deux porte-lames à prise plate et cassez une petite bande de son bord tranchant. Idéalement, produisez un bord tranchant comme un rasoir qui ressemble à une flèche.Maintenant, avec précaution et une grande attention aux détails, utilisez le microcouteau pour ouvrir quelques ommatidies de l’œil gauche de la mouche, comme à quatre ou cinq ommatidies de la cuticule dorsale juste au-dessus de l’équateur de l’œil. Celle-ci fournira le passage pour la microélectrode d’enregistrement. C’est assez difficile, nécessite un couteau bien fait et doit être appris avec de la pratique.Retirez ensuite délicatement le petit morceau de cornée de l’ouverture, exposant la rétine en dessous. Maintenant, à l’aide des poils fins de l’applicateur de vaseline, couvrez rapidement le trou avec une petite goutte de vaseline. La gelée a l’avantage supplémentaire de réduire la capacité intra-muros de la pipette.Évitez de tacher l’œil car cela brouille l’optique. Lors de l’utilisation de l’amplificateur à microélectrodes, soyez toujours mis à la terre en touchant la surface métallique de la cage de Faraday ou de la table anti-vibration pour éviter les charges statiques. Fixez le double-toit monté au poteau de la plate-forme de préparation des mouches.Faites pivoter le porte-mouche de sorte que l’œil gauche de la mouche soit directement face à l’enquêteur. Ensuite, utilisez un petit micromanipulateur pour insérer doucement l’électrode de référence émoussée à travers les ocelles de la mouche dans la capsule céphalique. Assurez-vous que la mouche semble toujours en bonne santé et bouge ses antennes.La préparation doit être superbe pour mériter l’enregistrement. Enfoncez maintenant la microélectrode d’enregistrement tranchante dans l’œil gauche à travers l’ouverture recouverte de gelée. Lorsqu’elle pénètre dans le tissu, l’emplacement de l’extrémité de l’électrode doit être apparent par son motif de réflectance.La pointe fragile de l’électrode doit être parfaitement guidée ou elle se cassera, ce qui est très difficile. Selon le type de cellule à partir de laquelle l’enregistrement est effectué, la tête de la mouche doit être orientée légèrement différemment. Une fois les électrodes en place, allumez l’amplificateur de microélectrodes.Ensuite, éteignez la source de lumière froide, débranchez-la du secteur et connectez-la à la terre centrale pour minimiser le bruit électrique induit par la boucle de terre. Ensuite, ajustez les guides de lumière en col de cygne de sorte que le système de bras Carden puisse être déplacé librement autour de la mouche. Éteignez ensuite les lumières de la pièce pour mettre la préparation contre les mouches dans une obscurité relative.Mesurez maintenant la résistance de l’électrode d’enregistrement dans l’œil. Il doit être compris entre 100 et 260 mégaohms. Parfois, la pointe est bloquée et peut être dégagée à l’aide des fonctions de bourdonnement capacitif et d’impulsion de courant de l’amplificateur.Si cela ne vous aide pas, utilisez une nouvelle électrode. Ensuite, réglez l’amplificateur sur la pince ou le pont de courant et mettez à zéro la tension entre les électrodes. Une fois que la mouche s’est adaptée à l’obscurité pendant quelques minutes, enfoncez la pointe de l’électrode d’enregistrement dans l’œil par pas de 0,1 à un micron à l’aide d’un pas piézoélectrique ou en utilisant une rotation douce du bouton de résolution fine.À chaque étape, stimulez l’œil avec un flash lumineux d’une à 10 millisecondes. Chaque flash lumineux provoquera une brève baisse de la tension ou de l’ERG. Lorsque la pointe de l’électrode pénètre dans la lame et se referme sur les LMC, l’ERG s’inverse.Procédez ensuite à la prise de mesures. En raison de la non-invasivité, la performance du signal des cellules individuelles peut être étudiée dans leur état proche de la nature. La réponse en tension d’un photorécepteur R1-R6 à une lumière faible et brillante a été mesurée à 20 degrés Celsius.Ensuite, un photorécepteur R1-R6 a été comparé à un LMC à 25 degrés Celsius. Chacun a été mesuré sur une mouche différente, car les enregistrements intracellulaires par deux microélectrodes pointues dans la même mouche sont trop difficiles pour être viables. La répétabilité des réponses devient évidente lorsque les données sont superposées.Les rapports signal/bruit dans le domaine fréquentiel ont été obtenus en transformant les morceaux de données de signal et de bruit en spectre de puissance, puis en divisant le spectre de puissance moyenne du signal par le spectre de puissance de bruit moyen correspondant. Le résultat peut être extrêmement sensible aux signaux dans les meilleures préparations. Cette technique peut être utilisée pour enregistrer de nombreuses espèces.Les mouches Coenocia ont reçu la même stimulation lumineuse naturaliste et répétitive à 19 degrés Celsius. Les données ont été prélevées avant et après la synthèse de la même mouche en avançant l’électrode d’enregistrement. La dynamique plus rapide de l’enregistrement est cohérente avec la nature prédatrice de cette espèce.Une fois masterisée, cette technique permet des enregistrements toujours longs et de haute qualité si elle est correctement réalisée. En essayant cette procédure, il est important de réaliser, je veux dire que c’est comme apprendre à jouer du piano. Plus vous pratiquez, meilleurs seront les résultats que vous obtiendrez.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que des interventions pharmacologiques, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que le rôle des neuromodulateurs dans la formation des réponses. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiophysique pour explorer comment optimiser l’information lumineuse, capturer et transférer, ainsi que les réactions biochimiques caustiques dans la machinerie de phototransduction et dans les sciences biologiques suivantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer la drosophile pour les expériences intracellulaires et comment réveiller les réponses neurologiques de ses photorécepteurs et interneurones.

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Méthode électrophysiologique de réponses denregistrement intracellulaire tension de Drosophila Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal

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