Hautement sensible et rapide avec détection par fluorescence avec un analyseur FRET Portable

L'objectif général de ce protocole est de démontrer l'applicabilité générale de l'analyseur FRET dans des conditions optimales en quantifiant la teneur en sucre de boissons disponibles commercialement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la détection et de la surveillance de petites molécules, telles que le sucre. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de surveiller efficacement un signal frais en réponse aux petites molécules, sans recourir à des fluorimètres coûteux et haut de gamme.

Le Dr Han de notre laboratoire démontrera la procédure. Préparez d'abord le plasmide du biocapteur fluorescent cyan et jaune spécifique au maltose ou au saccharose. Ensuite, ensemencez cinq millilitres de bouillon Luria avec une colonie unique d’E. coli DE3, puis incubez la culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur agité pendant 16 heures.

Ensuite, placer un millilitre de la culture dans un flacon contenant 100 millilitres de LB. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius dans un incubateur agité jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres soit d'environ 0,5. Centrifuger la culture pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendre rapidement le culot dans 50 millilitres d'eau distillée glacée, puis centrifuger à nouveau pendant 20 minutes.

Resuspendre le culot dans 50 microlitres d'une solution à 10 pour cent en volume de glycérol et d'eau distillée glacée. Agiter doucement le mélange jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 100. Dans une cuvette d'électroporation glacée, combiner le mélange avec 10 nanogrammes de plasmide CMY.

Électroporer le mélange. Dans la cuvette, resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu SOC, puis les transférer dans un tube rond de 15 millilitres. Reprendre les cellules en agitant doucement à 37 degrés pendant une heure.

Étaler les cellules sur une boîte de Petri contenant du milieu LB avec 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Incuber les cellules à 37 degrés pendant 12 heures. À l’aide d’un anneau, transférer une colonie unique dans 10 millilitres de milieu LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline.

Incuber le mélange à 37 degrés sous agitation pendant 12 heures pour créer la culture initiale. Transférer cinq millilitres de la culture initiale dans 500 millilitres de LB contenant de l'ampicilline, puis incuber les cellules à 37 degrés dans un incubateur agité. Une fois que la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,5, ajouter l'IPTG pour obtenir une concentration finale de 0,5 millimolaire.

Après avoir incubé la culture pendant 24 heures, centrifuger les cellules pendant 20 minutes. Retirer soigneusement le surnageant et resuspendre le culot dans cinq millilitres de tampon de liaison. Soniquer les cellules sur glace pendant 10 secondes, puis refroidir les cellules pendant 10 secondes.

Répétez la sonication et la phase de refroidissement cinq fois supplémentaires. Centrifugez le lysat pendant 30 minutes. Transférez le surnageant dans un autre tube de collecte.

Purifiez le surnageant sur une colonne d'affinité au nickel NTA. Remplissez un concentrateur de 10 000 milliwatts avec 20 millilitres de l'échantillon purifié. Centrifugez l'échantillon pendant 10 minutes, puis remplissez à nouveau le concentrateur avec du tampon salin phosphate à 0,8 %.

Répétez ce processus avec le reste de l'échantillon de cette manière, 20 millilitres à la fois, jusqu'à ce que toute la protéine ait été concentrée et désalée. Conservez le capteur FRET purifié à 80 degrés Celsius. Préparez une solution de 0,2 micromolaire de la protéine du capteur CMY et de 0,8 % PBS comme solution de détection.

Activez un analyseur FRET portatif. Réglez la température d'analyse à 53 degrés Celsius. Puis configurez l'appareil en mode étalonnage.

Remplissez une cuvette avec du PBS à 0,8 % en tant que fond. Préchauffez l'échantillon à 53 degrés Celsius dans l'analyseur, puis réglez le fond. Ensuite, remplissez une cuvette avec la solution de détection.

Placer la cuvette dans l'analyseur et régler la ligne de base. Remplacer la cuvette par une contenant la solution de détection et un millimolaire de sucre. Régler l'intensité au niveau de saturation pour terminer l'étalonnage.

Pour commencer la préparation d'un échantillon de boisson en vue de l'analyse de sa teneur en sucres, à l'aide d'un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, centrifuger un millilitre de la boisson. Retirer le surnageant à l’aide d’une seringue de un millilitre et filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,2 micromètre. Combiner 0,1 millilitre de filtrat et 0,9 millilitre de PBS à 0,8 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Vortexez doucement le mélange pour assurer une dilution complète. Ajoutez cinq microlitres de l'échantillon de boisson dilué et 495 microlitres de solution de détection dans une cuvette. Placez la cuvette dans l'analyseur et préchauffez l'échantillon à 53 degrés Celsius.

Appuyez sur le bouton de réglage pour mesurer la teneur en sucre de l'échantillon. Dans cette méthode, l'efficacité de la transfert d'énergie par résonance de type FRET est mesurée par le rapport de l'intensité d'émission de la protéine fluorescente jaune sur celle de la protéine fluorescente cyan dans le biocapteur. La température de mesure optimale pour ces biocapteurs CMY se situe entre 50 et 55 degrés Celsius, car la différence du rapport d'intensité d'émission entre une solution témoin et une solution saturée de maltose est alors maximale.

Le biocapteur CMY-BII a été utilisé pour évaluer la teneur en maltose de trois boissons à 53 degrés. Une courbe de réponse dose-dépendante est générée en obtenant ce rapport à différentes concentrations de maltose à une température donnée. Le rapport d'émission est mis en relation avec la concentration en maltose à l'aide des valeurs obtenues lors de l'étalonnage.

Les teneurs en maltose mesurées sont indiquées conjointement avec les teneurs totales en sucres déclarées par les fabricants de boissons. La boisson A contenait des sources de maltose telles que le riz et l'orge. En conséquence, la quantité observée de maltose représente environ la moitié de la teneur totale en sucres déclarée.

La boisson C, une boisson énergisante, contenait une teneur très faible en maltose. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de faire fonctionner l'appareil et les capteurs FRET entre 50 et 55 degrés Celsius. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de quantifier de petites molécules de ce type à l’aide d’un analyseur FRET portable sur mesure.