Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

L’objectif global de ce protocole étape par étape est de quantifier l’abondance de fragments de cortex ou de sucres réducteurs lors de la germination des spores bactériennes. Cette méthode détaillera les étapes nécessaires pour détecter la présence de fragments de cortex ou de sucres réducteurs lors de la germination des spores. Le principal avantage de cette technique est que la plupart des laboratoires disposent des réactifs et de l’équipement nécessaires pour mener à bien le protocole.

Commencez cette procédure en plaçant un tube de spores de Clostridium difficile dans un bloc chauffant et en l’incubant à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, placez le tube sur de la glace. La solution de germination est spécifique à l’espèce de spores bactériennes étudiées.

Pour doser la germination des spores de C. difficile, nous utilisons une solution de 10 millimolaires de Tris à pH 7,5 avec 150 millimolaires de chlorure de sodium, 100 millimolaires de glycine et 10 millimolaires d’acide taurocholique dans de l’eau déminéralisée. Préparez un millilitre de solution de germination par échantillon plus un millilitre supplémentaire. Avant de commencer le test, transférez un millilitre de la solution de germination dans un tube de microcentrifugation et mettez-le de côté.

Cela servira de blanc pour la détection des fragments de cortex. Ensuite, à la solution de germination, ajoutez des spores à une OD600 d’environ 3,0 et vortex brièvement. Cette quantité de spores fonctionne bien pour modérer la libération de fragments de cortex pendant la germination des spores de C. difficile.

Immédiatement après avoir ajouté les spores, prélevez un échantillon de 1,2 millilitre dans un nouveau tube de microcentrifugation et mettez-le dans la centrifugeuse. Ensuite, centrifugez à température ambiante pendant une minute à 14 000 fois G.C’est le point de temps zéro. Après l’essorage, transférez un millilitre de surnageant dans un nouveau tube à bouchon à vis de deux millilitres et congelez-le à moins 80 degrés Celsius.

Répétez le processus de prise d’aliquotes, de rotation et de congélation à intervalles réguliers jusqu’à ce que l’échantillon ait été prélevé pour chaque point temporel. En raison du temps nécessaire à la centrifugation et à l’échantillonnage, des points temporels de moins de deux minutes ne sont pas possibles au cours de cette procédure, de sorte que ces échantillons sont prélevés une fois toutes les deux minutes pendant 14 minutes. Lors de la préparation des échantillons de cortex, si l’acide dipicolinique doit être surveillé, prélever un échantillon séparé de 100 microlitres et le distribuer dans un tube de microcentrifugation sur de la glace.

Préparez également des échantillons pour générer une courbe standard avec les quantités suivantes de N-acétylglucosamine. Zéro, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 et 5 000 nanomoles dans une solution de germination. Une fois qu’un échantillon a été prélevé pour chaque point temporel, sortez les échantillons du congélateur et lyophilisez-les avec les échantillons à blanc et la courbe standard.

Conservez ensuite tous les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Le jour de l’essai, remettre en suspension les échantillons lyophilisés, y compris les échantillons témoins et les échantillons de la courbe standard, dans 120 microlitres d’acide chlorhydrique avec du phénol et du bêta-mercaptoéthanol. Ensuite, transférez tous les échantillons remis en suspension dans des tubes à bouchon à vis de deux millilitres frais.

Ensuite, incubez-les dans un bain d’eau à recirculation à 95 degrés Celsius pendant quatre heures. Après l’incubation, placez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce qu’ils refroidissent. Ajoutez ensuite 120 microlitres d’hydroxyde de sodium à trois molaires pour les neutraliser.

Ensuite, ajoutez 80 microlitres d’une solution saturée de bicarbonate de sodium et 80 microlitres d’une solution d’anhydride acétique à 5 % à chaque échantillon et vortex-le. Ensuite, incubez les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, transférez les échantillons dans le bain-marie à 95 degrés Celsius pendant exactement trois minutes.

Notez que cette étape est sensible au temps et que des temps plus longs peuvent affecter le développement du signal en aval. Retirez les échantillons du bain-marie et refroidissez-les sur de la glace. Ajoutez 400 microlitres de tétraborate de potassium tétrahydraté à 6,54 % dans chaque tube et vortex.

Incuber les échantillons dans un bain d’eau à recirculation à 95 degrés Celsius pendant exactement sept minutes. Cette étape est également urgente. Retirez les échantillons et placez-les sur de la glace pendant cinq minutes.

Pendant que les échantillons sont sur de la glace, préparez le réactif de couleur. Dissoudre 0,320 gramme de DMAB dans 1,9 millilitre d’acide acétique glacial. Notez que ce réactif est sensible au temps, à la température et à la lumière et ne doit pas être préparé à l’avance.

Une fois que le DMAB s’est complètement dissous, ajoutez 100 microlitres de 10 acides chlorhydriques normaux et vortex l’échantillon. Ajoutez ensuite cinq millilitres d’acide acétique glacial et vortex à nouveau. Pour la réaction colorimétrique, transférez 100 microlitres de chaque cortex refroidi ou échantillon de contrôle dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Ajoutez 700 microlitres de la solution de couleur fraîchement préparée à chaque échantillon. Transférez immédiatement les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez les échantillons pendant exactement 20 minutes. Après l’incubation, transférez 200 microlitres de chaque échantillon dans une plaque transparente à 96 puits.

Les échantillons doivent être de couleur jaune au départ, mais passeront au violet si le sucre réducteur, qui indique la présence de cortex, est présent. Ici, de nombreux échantillons ne montrent pas de couleur violette visible. Cependant, les échantillons de 250, 500 et 5 000 nanomoles semblent visuellement différents de la nanomole de contrôle négatif.

À l’aide d’un lecteur de plaques, déterminez l’absorbance à 585 nanomètres. Lorsqu’il est mesuré dans un diamètre extérieur de 585 nanomètres, le signal généré à partir des échantillons standard correspond le mieux à une régression linéaire. Ce tableau montre les résultats typiques obtenus à l’aide d’étalons de N-acétylglucosamine.

Ces données ont ensuite été utilisées pour générer la courbe standard illustrée ici. Un essai de germination a été effectué dans des conditions favorables à la germination avec un tampon de germination complété par 100 millimolaires de glycine et 10 millimolaires d’acide taurocholique. Dans des conditions non germinatives, 100 millimolaires de glycine seulement.

En l’absence d’acide taurocholique, les spores de C. difficile ne germent pas et la présence de fragments de cortex dans la solution change peu. Cependant, en présence d’acide taurocholique et de glycine, les spores de C. difficile germent et libèrent des fragments de cortex dans la solution. Celle-ci est absorbée sous forme d’augmentation de la DO 585 au fil du temps des échantillons ayant réagi.

La quantité de fragments de cortex libérés au cours de ce test a été calculée à l’aide d’une courbe standard. Comme on peut le voir ici dans cet essai, la majeure partie du cortex a été hydrolysée ou libérée 15 minutes après l’exposition aux germinants. Cela suggère que la plupart des spores ont germé dans cette période.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les fragments de cortex ou les sucres réducteurs dans une solution de germination pendant la germination des spores bactériennes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de porter une attention particulière aux temps de réaction afin que le test se développe correctement.