Name: Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Apprenez à détecter les fragments de cortex et les sucres réducteurs pendant la germination des spores bactériennes de Clostridium difficile. Cette méthode colorimétrique accessible permet de quantifier les processus métaboliques clés.

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1. Échantillons Génération <ol><li> Heat activer C. difficile spores à 65 ° C pendant 30 min et magasin sur la glace. Remarque: C. Les spores difficile peuvent être produits et purifiés comme décrit précédemment 7,9,10. </li><li> Préparer la solution de germination à X + 1 ml où X est le nombre d&#39;échantillons à prélever au cours de l&#39;essai. Remarque: La solution de germination est spécifique aux espèces de bactéries SPORE à l&#39;étude. Pour doser C. difficile la germination des spores, on a utilisé une solution de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glycine 100 mM , et 10 mM d&#39; acide taurocholique dans de l&#39; eau déminéralisée. </li><li> Avant de commencer l&#39;essai, prélever un échantillon de la solution de germination 1,0 ml sans spores pour servir de blanc pour la détection de fragments de cortex. </li><li> Ajouter des spores à une DO 600 de 3,0 ~ à la solution de germination et vortexer rapidement. Remarque: Pour nos études de germination en B. subtilis, nous avons utilisé le même OD 600 spores en tant que de C. difficile. Note: Cette quantité de spores a bien fonctionné pour la surveillance du cortex fragment de presse au cours de C. difficile la germination des spores. La quantité de spores utilisée dans cet essai doit être déterminée expérimentalement pour chaque bactérie ou souche. </li><li> Prélever un échantillon de 1,2 ml immédiatement après l&#39;addition des spores et centrifuger à la température ambiante pendant 1 min à 14 000 x g. Ceci est le point de temps zéro. </li><li> Transférer 1,0 ml du surnageant de l&#39;échantillon centrifugé à un nouveau tube pour analyse subséquente des fragments de cortex. Remarque: Si DPA doivent être surveillés, prélever un échantillon de 100 pi séparé pour la détection de la DPA dans la solution en utilisant un test basé sur la fluorescence de terbium 9,18,19. </li><li> Congeler l&#39;échantillon prélevé à -80 ° C. </li><li> Répétez les étapes 1.4 et 1.5 à intervalles réguliers jusqu&#39;à ce que tous les points de temps terminés. Remarque: En raison du temps nécessaire pour la centrifugation et de l&#39;échantillonnage, des points de temps moins th2 min étaient en dehors pas possible lors de notre procédure, de sorte que nos intervalles d&#39;échantillonnage ont été une fois toutes les 2 min pour 14 min. </li><li> En tant que contrôle positif pour la réduction de la détection du sucre et la quantification, comprennent les montants suivants de N - acétylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 et 5000. Préparer ces échantillons en même temps que des échantillons de cortex et exécuter en même temps que les échantillons de cortex de telle sorte que la courbe d&#39;étalonnage est pertinente pour les données générées par la germination des spores. </li><li> Une fois que tous les échantillons de points de temps sont collectées, lyophiliser les échantillons. Note: Nous lyophilisée nos échantillons dans 2 ml tubes à bouchon à vis. </li></ol> 2. La mesure Cortex Fragments <ol><li> Remettre en suspension les échantillons lyophilisés dans 120 ul de HCl 3N additionné de 1% de phénol et 0,5% de β-mercaptoéthanol. </li><li> Transférer les échantillons remis en suspension à 2 ml tubes à bouchon à vis. Remarque: Pour la reproductibilité, d&#39;assurer toute l&#39;échantillon lyophilisé est remis en suspension et transféré. </li> &lt;li&gt; Incuber les échantillons dans un bain d&#39;eau de remise en circulation à 95 ° C pendant 4 heures. </li><li> Après incubation, placer les échantillons sur la glace jusqu&#39;à ce qu&#39;ils sont cool. </li><li> Neutraliser les échantillons avec 120 pi de NaOH 3 M. </li><li> Ajouter 80 ul d&#39;une solution de bicarbonate de sodium saturée et de 80 ul d&#39;une solution à 5% d&#39;anhydride acétique à chaque échantillon et vortexer. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Transférer les échantillons vers le bain C de l&#39;eau à 95 ° C pendant EXACTEMENT 3 min. Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval. </li><li> Retirer les échantillons du bain d&#39;eau et refroidir sur glace. </li><li> Ajouter 400 pi de 6,54% de K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O dans chaque tube et vortexer. </li><li> Incuber les échantillons dans un bain d&#39;eau de remise en circulation à 95 ° C pendant exactement 7 minutes. Remarque: Cette étape est temps fois plus sensibles et peuvent affecter le développement du signal en aval. </li><li> Retirerles échantillons et les placer sur la glace pendant 5 min. </li></ol> 3. Couleur Réactif <ol><li> Alors que les échantillons sont sur la glace (étape 2.12), préparer le réactif coloré. Dissoudre 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB, le réactif d&#39;Ehrlich) dans 1,9 ml d&#39;acide acétique glacial. Remarque: Le réactif est temps, la température et sensible à la lumière et ne doit pas être fait à l&#39;avance. </li><li> Après la DMAB se dissout complètement, ajouter 100 pi de N HCl et vortex 10. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;acide acétique glacial et vortex. </li></ol> 4. Réaction Colorimétrie <ol><li> Transfert 100 ul de chaque échantillon refroidi cortex dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 700 ul de la solution de couleur fraîchement préparé pour chaque échantillon. </li><li> transférer immédiatement les échantillons dans un bain d&#39;eau C 37 ° et incuber pendant EXACTEMENT 20 min. </li><li> Transfert 200 ul de chaque échantillon à une plaque de 96 puits clair. </li><li> Quantifier les échantillons à 585 nm sur une plaquelecteur. Les échantillons doivent commencer à une couleur jaune et une réaction positive se déplacera au violet. Plus cortex présente, plus la couleur pourpre. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Lors de la stimulation, les spores subissant le processus de germination perdent leurs propriétés de résistance, sans la nécessité de la synthèse macromoléculaire. Lorsque la germination des spores est déclenchée, le noyau de spores libère DPA en échange d&#39;eau 2. En raison de la forte teneur en DPA de la spore dormante, le noyau de spores est sous pression osmotique intense et le peptidoglycane spécialisé, cortex, aide à prévenir le noyau de l&#39; enflure en agissant, sans doute, comme un obstacle à l&#3...

Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l&#39; exposition à l&#39; oxygène ou d&#39; autres contraintes 1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel 2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d&#39;études dans l&#39;organisme modèle, Bacillus subtilis. Le processus de sporulation commence avec la réplication de l&#39; ADN et la formation d&#39;un filament de 3,4 axiale. Un septum asymétrique divise ensuite la cellule en deux compartiments de taille inégale. Le grand compartiment, la cellule mère, engloutit plus petit compartiment, préspore. Tant la cellule mère et préspore coordonner l&#39;expression des gènes à mûrir la spore et la cellule mère lyses finalement, libérant le dormant spores dans le milieu environnant 1. La structure des spores et la composition est conservée dans de nombreuses espèces bactériennes. Le noyau de spores a une teneur en eau inférieure à la cellule végétative et est riche en acide dipicolinique (DPA) 1,2. Au cours de la formation de spores, le DPA est pompée dans le noyau de spores en échange de l&#39;eau. Entourant le noyau est une membrane de spores intérieure où, dans la plupart des bactéries sporulantes, les récepteurs qui reconnaissent les petites molécules qui stimulent la germination germinants (2) sont situés. Situé juste en dehors de la membrane interne de la spore est une couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Une couche de peptidoglycane spécialisée (cortex) entoure le peptidoglycane de la paroi cellulaire et se compose d&#39;un grand nombre des mêmes composants que le peptidoglycane de la paroi cellulaire [alternance N-acétylglucosamine (NAG) et de l&#39;acide N-acétylmuramique (NAM)]. Toutefois, environ 50% des résidus non alignés dans le cortex ont été convertis en muramique-δ-lactame 5,6 </sup&gt;. Au cours de la germination des spores, ces résidus muramique-δ-lactame sont reconnus par les spores cortex enzymes lytiques (les SCLEs), permettant ainsi le cortex à dégrader (un processus essentiel pour achever la germination), mais pas de la paroi cellulaire. Autour du cortex est une membrane externe et plusieurs couches de protéines d&#39;enveloppe 2. Contrôle du processus de germination est d&#39;une importance cruciale pour les bactéries formant des spores. Germination est déclenchée lorsque les récepteurs de germination interagissent avec leurs germinants respectifs 2. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, ces plantules sont des acides aminés, des sucres, des nucléotides, des ions ou des combinaisons de ces deux. C. difficile la germination des spores est initiée par des combinaisons de certains acides biliaires, [par exemple, l&#39; acide taurocholique (TA)] et des acides aminés (par exemple la glycine) , 7-10. Bien qu&#39;il existe des différences entre le C. voie de germination difficile et les voies étudiées dans d&#39; autres sporuléedes bactéries telles que B. subtilis, commun à tous est l&#39;exigence absolue de dégrader le cortex de spores pour permettre à une cellule végétative de croître à partir de la spore germée 2,8. La dégradation de Cortex peut être accompli par le SCLEs CWLj / SLEB (que l&#39;on trouve dans B. subtilis) ou SLEC (que l&#39;on trouve dans de nombreux Clostridia). Cortex hydrolyse réduit la contrainte sur la paroi cellulaire et de la spore. Cela permet noyau pleine réhydratation, une étape nécessaire dans réactivant la plupart des protéines nécessaires pour le métabolisme cellulaire 2. Lorsque les spores germent, les spores dormantes passe d&#39;un état de phase lumineuse à un état de phase sombre et ce processus peut être mesurée par un changement de densité optique (DO) à 600 11 nm. Un précédent rapport suggère qu&#39;une grande partie de ce changement de OD est due à la libération de DPA de la spore 12. Au cours de notre étude récente, nous avons cherché à comparer le moment de C. difficile la germination des spores et la surveillancelibération de DPA et cortex fragments 9. Pour cette étude, il était essentiel de surveiller la libération de fragments de cortex comme ils ont commencé à être libéré par la germination des spores. Le dosage colorimétrique utilisé ici a été basé sur une méthode de détection des sucres avec des extrémités réductrices développé Ghuysen et al. 13. Parce que d&#39; autres ont décrit des protocoles pour la détection des sucres réducteurs 14 ou ont modifié les protocoles 15, la littérature sur ce sujet peut être déroutant. Ici, nous détaillons une méthode étape par étape pour la détection colorimétrique de sucres réducteurs libérés de germant C. Les spores difficile. Bien que cette étude utilise C. Les spores difficile, les sucres réducteurs libérés au cours de la germination des spores provenant d&#39; autres bactéries formant des spores puissent être détectées avec ce protocole 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>Tube à bouchon à vis de 2,0 ml</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipette Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipette Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &#956 ; l pointes de pipette</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956 ; ll pointes de pipette</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acétyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tétraborate de potassium</td><td>tétrahydraté Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Diméthylamino)benzaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phénol saturé</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Dispositifs</td><td></td><td></td>moléculaires</tr><tr><td>Acide acétique, glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau chaude et circulante</td><td>VWR Modèle scientifique</td><td>1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 plaques de culture de tissus bien claires Tubes</td></tr><tr><td>de culture</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de chaleur Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détecter cortex fragments pendant bactérienne spore germination

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Le processus de germination des endospores chez Clostridium difficile, et d’autres Clostridium, diffère de plus en plus de celui de la bactérie sporulée modèle, Bacillus subtilis. La germination est déclenchée par de petites molécules germinantes et se produit sans qu’il soit nécessaire de procéder à une synthèse macromoléculaire. Bien qu’il existe des différences entre les mécanismes de germination des spores chez les espèces de Bacillus et de Clostridium, une exigence commune est l’hydrolyse du cortex de type peptidoglycane qui permet au noyau des spores de gonfler et de se réhydrater. Après la réhydratation, le métabolisme peut commencer, ce qui conduit éventuellement à l’excroissance d’une cellule végétative. La détection de fragments de cortex hydrolysés pendant la germination des spores peut être difficile et les modifications apportées aux tests décrits précédemment peuvent être déroutantes ou difficiles à reproduire. Ainsi, sur la base de notre récent rapport utilisant ce test, nous détaillons un protocole étape par étape pour la détection colorimétrique des fragments de cortex lors de la germination des spores bactériennes.

Le tableau 1 présente des résultats typiques en utilisant des normes NAG. Les données sont utilisées pour générer une courbe standard. Le tableau 2 montre des résultats typiques d&#39;un essai de germination dans un tampon de germination supplémenté avec de la glycine 100 mM et TA 10 (conditions de germination favorisant) ou mM de glycine 100 uniquement (conditions de non-germination). En l&#39;absence de TA, C. spores Difficile ne germ...

Ici, nous décrivons un dosage colorimétrique pour détecter la présence de sucres réducteurs lors de la germination des spores bactériennes.

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

L'objectif général de ce protocole étape par étape est de quantifier l'abondance de fragments de cortex ou de sucres réducteurs au cours de la germination des spores bactériennes. Cette méthode détaillera les étapes nécessaires pour détecter la présence de fragments de cortex ou de sucres réducteurs durant la germination des spores. Le principal avantage de cette technique est que la plupart des laboratoires disposent des réactifs et de l'équipement nécessaires pour mener à bien ce protocole.Commencez cette procédure en plaçant un tube contenant des spores de Clostridium difficile dans un bloc chauffant et en l'incubant à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, placez le tube sur de la glace. La solution de germination est spécifique à l'espèce de spore bactérienne étudiée.Pour tester la germination des spores de C.difficile, nous utilisons une solution de 10 millimolaire de Tris à pH 7,5 contenant 150 millimolaire de chlorure de sodium, 100 millimolaire de glycine et 10 millimolaire d'acide taurocholique dans de l'eau déionisée. Préparez un millilitre de solution de germination par échantillon, plus un millilitre supplémentaire. Avant de commencer le test, transférez un millilitre de la solution de germination dans un tube de microcentrifugeuse et mettez-le de côté.Cela servira de témoin pour la détection des fragments de cortex. Ensuite, ajoutez les spores à la solution de germination jusqu'à une DO600 d'environ 3,0 et vortexez brièvement. Cette quantité de spores convient bien pour modérer la libération des fragments de cortex lors de la germination des spores de C.difficile.Immédiatement après l'ajout des spores, prélever un échantillon de 1,2 millilitre dans un nouveau tube microcentrifuge et le placer dans la centrifugeuse. Puis centrifuger à température ambiante pendant une minute à 14 000 × g. Il s'agit du point zéro. Après la centrifugation, transférer un millilitre du surnageant dans un tube neuf de deux millilitres à bouchon vissé et le congeler à −80 degrés Celsius.Répétez le prélèvement d’aliqotes, la centrifugation et la congélation à intervalles réguliers jusqu’à ce que l’échantillon ait été recueilli pour chaque point temporel. En raison du temps nécessaire à la centrifugation et au prélèvement, des points temporels inférieurs à deux minutes ne sont pas possibles au cours de cette procédure ; par conséquent, ces échantillons sont prélevés toutes les deux minutes pendant 14 minutes. Lors de la préparation des échantillons de cortex, si une surveillance de l’acide dipicolinique est nécessaire, retirez un échantillon distinct de 100 microlitres et déposez-le dans un tube de microcentrifugeuse placé sur de la glace.Préparer également des échantillons pour la génération d'une courbe standard contenant les quantités suivantes de N-acétylglucosamine : 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 et 5 000 nanomoles en solution de germination. Une fois qu'un échantillon a été prélevé pour chaque point temporel, retirer les échantillons du congélateur et les lyophiliser conjointement avec les échantillons témoins et ceux de la courbe standard.Ensuite, conserver tous les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Le jour du dosage, resuspendre les échantillons lyophilisés, y compris les échantillons témoins et ceux de la courbe étalon, dans 120 microlitres d'acide chlorhydrique contenant du phénol et du bêta-mercaptoéthanol. Puis, transférer tous les échantillons resuspendus dans des tubes propres de deux millilitres à bouchon vissé.Ensuite, incubez-les dans un bain-marie à circulation d'eau à 95 degrés Celsius pendant quatre heures. Après l'incubation, placez les échantillons sur de la glace jusqu'à ce qu'ils refroidissent. Ajoutez alors 120 microlitres de soude à trois molaire pour les neutraliser.Ensuite, ajoutez 80 microlitres d'une solution saturée de bicarbonate de sodium et 80 microlitres d'une solution d'anhydride acétique à 5 % à chaque échantillon, puis vortexez. Incubez ensuite les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l'incubation, transférez les échantillons de nouveau dans le bain-marie à 95 degrés Celsius pendant exactement trois minutes.Remarquez que cette étape est sensible au temps et que des durées plus longues peuvent affecter le développement du signal en aval. Retirez les échantillons du bain-marie et refroidissez-les sur de la glace. Ajoutez 400 microlitres de tétraborate de potassium tétrahydraté à 6,54 % dans chaque tube et vortexez.Incubez les échantillons dans un bain-marie à circulation d'eau à 95 degrés Celsius pendant exactement sept minutes. Cette étape est également sensible au temps. Retirez les échantillons et placez-les sur de la glace pendant cinq minutes.Pendant que les échantillons sont sur de la glace, préparez le réactif coloré. Dissolvez 0,320 gramme de DMAB dans 1,9 millilitre d'acide acétique glacial. Remarquez que ce réactif est sensible au temps, à la température et à la lumière et ne doit pas être préparé à l'avance.Une fois que le DMAB est complètement dissous, ajoutez 100 microlitres d'acide chlorhydrique 10 N et vortexez l'échantillon. Ajoutez ensuite cinq millilitres d'acide acétique glacial et vortexez à nouveau. Pour la réaction colorimétrique, transférez 100 microlitres de chaque échantillon de cortex refroidi ou témoin dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Ajouter 700 microlitres de la solution colorée fraîchement préparée à chaque échantillon. Transférer immédiatement les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incuber les échantillons exactement pendant 20 minutes. Après l'incubation, transférer 200 microlitres de chaque échantillon dans une plaque claire de 96 puits.Les échantillons doivent être initialement de couleur jaune, mais ils deviennent violets en présence d'un sucre réducteur, ce qui indique la présence de cortex. Ici, de nombreux échantillons ne présentent pas de couleur violette visible. Toutefois, les échantillons de 250, 500 et 5 000 nanomoles semblent visuellement différents du témoin négatif à zéro nanomole.À l'aide d'un lecteur de plaque, déterminez l'absorbance à 585 nanomètres. Lorsqu'elle est mesurée à une DO de 585 nanomètres, le signal provenant des échantillons standards correspond le mieux à une régression linéaire. Ce tableau présente des résultats typiques obtenus avec des étalons de N-acétylglucosamine.Ces données ont ensuite été utilisées pour générer la courbe standard présentée ici. Un essai de germination a été réalisé dans des conditions favorisant la germination, à l’aide d’un tampon de germination complété par 100 millimolaire de glycine et 10 millimolaire d’acide taurocholique. Dans les conditions non germinatives, uniquement 100 millimolaire de glycine a été ajouté.En l'absence d'acide taurocholique, les spores de C. difficile ne germent pas, et il y a peu de changement dans la présence de fragments de cortex en solution. Toutefois, en présence d'acide taurocholique et de glycine, les spores de C. difficile germent et libèrent des fragments de cortex dans la solution. Ceci est observé sous forme d'une augmentation de l'OD585 au fil du temps des échantillons réagis.La quantité de fragments de cortex libérés lors de ce dosage a été calculée à l’aide d’une courbe standard. Comme on peut le voir dans ce dosage, la majeure partie du cortex avait été hydrolysée ou libérée 15 minutes après l’exposition au germinant. Cela suggère que la majorité des spores ont germé durant cet intervalle de temps.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter des fragments de cortex ou des sucres réducteurs dans une solution de germination au cours de la germination des spores bactériennes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prêter une attention particulière aux durées de réaction afin que le test se développe correctement.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

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