Mucine Agarose Gel Electrophoresis: Western Blot pour les glycoprotéines de haut poids moléculaire,

L’objectif global de cette technique de western blot pour les glycoprotéines de haut poids moléculaire est de séparer par électrophorèse les mucines contenues dans des échantillons riches en mucus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des mucines, telles que l’étude de l’état polymérique dans les concentrations relatives de mucines spécifiques récoltées à partir de diverses surfaces muqueuses. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à mettre en place, relativement peu coûteuse et nécessite un équipement de laboratoire minimal.

La démonstration de cette procédure sera faite par Sophia Samir, spécialiste de recherche de mon laboratoire. Commencez l’expérience en préparant le gel. Versez 150 millilitres de 1 tampon TAE 0,1 % SDS dans un erlenmeyer allant au micro-ondes pour faire un gel de six millimètres d’épaisseur et ajoutez 1,2 gramme de poudre d’agarose.

Passez le ballon au micro-ondes pendant 30 secondes à intervalles intermittents jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Laissez refroidir la solution d’agarose jusqu’à 10 minutes. Ensuite, placez un plateau de coulée par électrophorèse de 10 x 15 centimètres dans une roulette de gel.

Versez lentement la solution d’agarose et placez les rayons en position. Retirez toutes les bulles qui auraient pu se former avec la pointe d’une pipette, puis laissez le gel refroidir et se solidifier. Une fois que le gel s’est complètement solidifié, retirez lentement le peigne pour éviter que les puits ne s’effondrent et retirez le plateau de la roulette de gel.

Placez le gel dans la boîte de gel et remplissez l’unité d’électrophorèse jusqu’à ce que le gel soit complètement recouvert. Ajoutez 10 % de colorant de chargement à chaque échantillon. Homogénéiser les échantillons en les pipetant de haut en bas.

Ensuite, faites tourner brièvement les tubes à 5000 tr/min pour collecter les gouttelettes. Ensuite, utilisez des pipettes à déplacement positif pour faciliter le chargement des échantillons très visqueux. Aspirez lentement 80 à 90 % de l’échantillon pour éviter les bulles de pipetage.

Chargez lentement à partir du fond du puits et déplacez progressivement la pointe de la pipette vers le haut. Pour les échantillons qui restent attachés à la pointe de la pipette, distribuez à un angle de 45 degrés et allongez-les directement au-dessus du puits ou utilisez doucement le côté du puits pour briser le mucus filandreux. Le chargement précis des échantillons viscoélastiques peut s’avérer difficile car le mucus adhère intrinsèquement aux pointes de chargement.

De plus, la force de flottabilité appliquée par le tampon sur le mucus peut déplacer la totalité ou une partie du volume chargé hors des puits. Faites fonctionner le gel à 80 volts pendant 60 à 75 minutes pour un gel à double peigne afin d’éviter le chevauchement entre les deux rangées. Une fois que le gel a parcouru une longueur adéquate, coupez l’alimentation du générateur et débranchez les électrodes de la source d’alimentation.

Retirez délicatement le gel de la boîte de gel avec une main de chaque côté du plateau de coulée pour vous assurer que le gel reste en place. Placez délicatement le gel à plat dans un récipient en verre. Ensuite, rincez le gel à l’eau distillée pour éliminer les traces de tampon TAE SDS.

Trempez le gel avec le tampon DTT 4x SSC préalablement préparé et couvrez le gel. Ensuite, secouez doucement le gel à 10 rotations par minute. Après avoir bercé pendant 20 minutes, rincez le gel avec un tampon 4x SSC sans DTT.

Préparez le buvard sous vide pour le transfert en coupant soigneusement la membrane de nitrocellulose légèrement plus large que le gel. Mouillez un tapis poreux avec de l’eau distillée et placez-le côté lisse vers le haut dans le buvard. Mouillez et placez deux couches de papier Whatman au centre du tapis poreux.

Mouillez une membrane nitrocellulosique avec un tampon 4x SSC sans DTT et placez-la sur le papier Whatman. Couvrez le tapis poreux avec un joint en caoutchouc en laissant l’ouverture du joint alignée avec précision avec la membrane de nitrocellulose. Si le tapis poreux est toujours visible, ajustez soigneusement la membrane pour vous assurer qu’il ne reste aucun espace entre le joint et la membrane.

Mouillez la membrane de nitrocellulose avec un média SSC sans DTT. Placez délicatement le gel d’agarose sur la membrane. Assurez-vous que le gel forme un joint étanche avec le joint et que les puits du gel sont positionnés sur la membrane pour le transfert.

Tout au long du transfert de protéines, assurez-vous de maintenir une étanchéité parfaite entre le gel d’agarose et la membrane de nitrocellulose. Une fois que le gel est placé sur la membrane, ne déplacez pas ou n’ajustez pas le gel et gardez le gel bien hydraté. Pour minimiser la formation de bulles, versez quelques gouttes de tampon 4x SSC sur la membrane et faites glisser le gel de haut en bas pour évacuer les bulles formées.

Couvrez soigneusement le gel avec 4x tampon SSC. Commencez le transfert de mucine en allumant le buvard sous vide pendant 90 minutes. Ajoutez quelques gouttes de 4x tampon SSC sur le gel toutes les cinq à 10 minutes pour éviter que le gel ne se dessèche.

Une fois terminé, marquez les puits avec un crayon pour vous orienter. Jetez le gel et récupérez la membrane de nitrocellulose à l’aide d’une pince à épiler en plastique par le bord de la membrane. Rincez immédiatement la membrane avec 1 solution saline tamponnée au phosphate ou PBS.

Plongez la membrane dans 15 millilitres de tampon bloquant le PBS à 3 % de lait et placez-la sur une bascule à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, jetez le tampon de blocage. Ensuite, plongez la membrane dans une solution d’anticorps primaires PBS à 1 % de lait et incubez la membrane pendant la nuit sur une bascule à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation, jeter la solution d’anticorps primaire. Ensuite, lavez la membrane avec du PBS tout en le berçant. Transférez la membrane dans un récipient non transparent et plongez la membrane dans une solution secondaire d’anticorps PBS à 1 % de lait et incubez la membrane à température ambiante pendant une heure sur une bascule.

Après l’incubation, jetez la solution d’anticorps secondaire. Lavez la membrane trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Enfin, rincez la membrane à l’eau distillée pour éliminer le sel.

Ce western blot montre la régulation positive des protéines Muc5ac et Muc5b dans les fluides de lavage broncho-alvéolaire des souris déficientes en IL-13 par rapport aux souris témoins. Une analyse quantitative montre que la régulation à la hausse était de 5,1 fois supérieure à celle des souris traitées au PBS. L’électrophorèse sur gel d’agarose de mucine a été utilisée pour montrer la réduction des polymères de mucine en monomères après un traitement avec des concentrations croissantes de DTT.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer la spécificité de l’anticorps avant d’étudier une mucine particulière. Pour les tests pharmacologiques, il est important d’examiner l’impact que les réactifs chimiques peuvent avoir sur la reconnaissance des épitopes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation d’échantillons viscoélastiques et de la détermination de l’état polymérique des mucines et de leur quantification relative.