Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses

L’objectif global de cette technique est de traiter efficacement de longues sections de tissu intestinal de souris pour une coloration histologique uniforme sur toute sa longueur. Pour obtenir les sections intestinales, il peut y avoir des variations de coloration sur toute la longueur de l’intestin. J’ai essayé d’utiliser la technique de roulage suisse standard, mais j’ai constaté qu’elle produisait du tissu intestinal très rigide et difficile à ouvrir.

Après quelques expérimentations, j’ai mis au point une méthode de fixation rapide qui utilise moins de produits chimiques toxiques et qui permet un bien meilleur roulement suisse du tissu intestinal. Le fixateur modifié peut être utilisé pour réparer rapidement d’autres tissus épais. En préparation, euthanasiez l’animal d’essai selon le protocole textuel et préparez le cadre chirurgical.

Pour commencer, utilisez une pince à dissection et des ciseaux pour faire une incision latérale au milieu de l’abdomen à environ un à deux centimètres sous la cage thoracique selon la taille de la souris. Ensuite, séparez et coupez doucement la peau pour exposer les muscles abdominaux. Ensuite, saisissez et tirez sur les muscles sans tenir ou tirer sur les intestins.

Ensuite, faites soigneusement une incision initiale dans les muscles abdominaux et coupez-les soigneusement pour exposer les intestins. Identifiez maintenant le côlon et suivez-le jusqu’à son extrémité distale où il rejoint le rectum. Ensuite, à l’aide de ciseaux, transectez le côlon le plus près possible de l’ouverture anale.

Ensuite, trouvez où l’estomac rejoint l’intestin grêle et, à l’aide de ciseaux, coupez les intestins à environ un centimètre de l’estomac. Transférez maintenant toute la longueur de l’intestin grêle libre et du côlon dans une boîte de Pétri propre contenant du PBS. Ensuite, fixez l’extrémité distale du côlon et démêlez doucement toute la longueur du côlon en enlevant tous les tissus mésentériques attachés.

Ensuite, identifiez le cæcum et transectez l’intestin où le cæcum rejoint le côlon, isolant ainsi le côlon. De même, démêlez le reste de l’intestin grêle à partir des tissus conjonctifs mésentériques et adipeux attachés. Ensuite, transectez l’intestin grêle où il rejoint le cæcum.

Le caecum peut ensuite être retiré et jeté. Remplissez maintenant une seringue de 10 millilitres avec le fixateur de Bouin modifié et fixez-y une aiguille à gavage. Insérez l’aiguille à environ un demi-centimètre dans l’ouverture antérieure d’un segment intestinal.

Tout en fixant fermement l’aiguille de gavage à l’intérieur du segment, rincez lentement le contenu du tissu avec un fixateur. Attention, car une pression trop importante fera éclater le segment. Si l’intestin grêle semble trop long à manipuler, vous voudrez peut-être le couper d’abord en trois segments égaux et rincer chaque segment séparément.

La fixation fera que la couleur du segment intestinal deviendra opaque. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez le segment longitudinalement le long de la ligne mésentérique, puis rincez brièvement le segment dans un plat de PBS tout en le maintenant ouvert avec une pince. Coupez maintenant l’intestin grêle en trois segments égaux, proximal, moyen et distal, qui correspondent à peu près au duodénum, au jéjunum et à l’iléon.

Macroscopiquement, il n’y a pas de caractéristiques distinctives dans chaque section. Assurez-vous de faire une marque pour identifier l’extrémité proximale de l’extrémité distale sur chaque segment. Placez ensuite un segment avec le côté lumineux vers le haut sur le couvercle d’une boîte de Pétri.

Sur le segment du côlon, identifiez le côté luménal par les crêtes qui traversent sa largeur à l’extrémité proximale. Les régions médiane et distale présentent quelques panachures longitudinales. Sur l’intestin grêle, identifiez le côté luménal par la surface plus rugueuse qui marque les villosités.

L’examen microscopique montre que les villosités sont les plus longues dans les régions proximales de chaque segment, tandis que les cryptes du côlon sont les plus courtes dans les régions proximales et sont les plus hautes dans la section médiane. Procédez au roulement suisse du côlon. Avec le côlon plat ouvert et le côté lumenal vers le haut, tirez-le avec une pince de son extrémité proximale vers le bord de la boîte de Pétri.

En gardant le côté lumineux vers le haut, tenez l’extrémité proximale avec la pince et enroulez le bord de l’extrémité proximale autour d’un cure-dent et pincez fermement le bord enroulé contre le cure-dent. Ensuite, enroulez doucement et lentement le côlon autour du cure-dent pour former un rouleau suisse. Une fois que toute la longueur du côlon a été enroulée, utilisez une autre paire de pinces pour glisser soigneusement le rouleau dans une cassette de traitement des tissus.

Transférez ensuite la cassette dans du formol tamponné à 10 % et laissez-la incuber toute la nuit à température ambiante. Pour rouler un segment de l’intestin grêle, ouvrez-le côté lumenal vers le haut et tirez-le avec une pince de son extrémité proximale vers le bord d’un plat. Ensuite, utilisez la même technique que celle illustrée avec le côlon pour faire le rouleau suisse et fixez-le dans du formol.

En utilisant les méthodes décrites, la coloration HND du gros intestin d’une souris C57 black 6 a révélé toutes les parties du côlon pour une évaluation histologique complète. Ensuite, la préparation a été utilisée pour des souris exprimant l’EGFP piloté par le promoteur LGR5 qui n’est actif que dans les cryptes intestinales périphériques. Ce transgène EGFP n’a qu’environ 5 à 10 % de pénétrance, mais des régions d’intérêt pourraient être facilement trouvées.

En utilisant les mêmes souris avec l’expression EGFP LGR5, KLF5 et KI67 ont été colorés. Les premières souris témoins avec une expression normale de LGR5 ont été étudiées. Les cellules positives EGFP sont marquées de flèches bleues et les cellules négatives EGFP sont marquées de flèches blanches.

Ensuite, les mêmes transgènes ont été exprimés chez une souris knock-out KLF5. La co-coloration de KLF5 et KI67 est absente dans les cellules souches positives à l’EGFP, mais reste présente dans les cryptes négatives à l’EGFP. De toute évidence, la qualité de la préparation pour la coloration multi-fluoro est très bonne.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 15 minutes par souris si vous collectez à la fois l’intestin grêle et le côlon. N’oubliez pas que travailler avec le fixateur de Bouin peut être extrêmement dangereux pour les yeux. Des précautions telles qu’une protection oculaire appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Merci d’avoir regardé et bon regard avec vos expériences.