Name: Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Apprenez l'injection intracérébroventriculaire et intravasculaire de particules virales et microbilles fluorescentes dans le cerveau néonatal de souris. Cette technique permet d'observer directement la distribution virale pendant la phase aiguë de l'infection dans le système nerveux central.

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Les auteurs remercient M. Masaaki Kaneta, Mme Hiromi Suzuki et Mme Mitsue Kawashima (Département de pathologie régénérative et infectieuse, Faculté de médecine de l’Université de Hamamatsu) pour leur excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science, KAKENHI numéro de subvention 23590445.

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de l&#39;Université Hamamatsu de l&#39;École de médecine de soins aux animaux. 1. Préparation de MCMV (souche Smith) et recombinant M32-protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) -MCMV <ol><li> Générer des recombinants M32-EGFP MCMV selon le procédé de la manière suivante (1.2 - 1.9) et 8 comme décrit précédemment. </li><li> Utilisez des virus recombinants dérivés de la souche Smith de type sauvage MCMV (numéro d&#39;accession: U68299). Insérer EGFP (4,361 paires de bases; pb) entre 37089 et 41450 pb (M32 - locus M31) dans le génome MCMV par recombinaison homologue. </li><li> Amplifier par réaction en chaîne de la polymérase du MCMV M32 (41450 - 39286 pb, à gauche séquence adjacente et M31 (37089 - 39246 pb, flanquant droit loci du gène de séquence en utilisant les amorces suivantes: M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(amorce sens), 5 &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(Amorce inverse); M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (amorce sens), 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(amorce inverse). </li><li> Insérer le locus dans le vecteur M32 exprimant EGFP en utilisant les sites de restriction Nhel et BamHl. Insérez le locus M31 dans le M32-EGFP -recombinant plasmide en utilisant des sites AflII et Xbal. Cliver le M32 - EGFP - séquence M31 avec Nhel et AflII du M32 - EGFP - M31 recombinaison plasmide et dissoudre dans H 2 O. </li><li> Transfecter la construction clivée dans les noyaux de MCMV (souche Smith) infectés par des cellules NIH3T3 post-infection 24 h (hpi) en utilisant un système d&#39;électroporation pour induire la recombinaison homologue. </li><li> Au bout de 3 jours après l&#39;infection, la co-culture, les cellules avec des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) non infectée dans un rapport de 1 / 1.000 dans des plaques à six puits et à l&#39;écran pour les foyers exprimant EGFP des cellules infectées. </li><li> Harvest les surnageants contenant le virus provenant des puits contenant des foyers vert fluorescent et on dilue dix fois. Pour la purification, choisissez des puits qui affichent simples foyers fluorescents verts. </li><li> Lorsque tous les foyers résultant de l&#39;affichage de l&#39;infection EGFP expression de limitation de la dilution, la préparation de virus est pur, indiquant qu&#39;aucun virus de type sauvage reste. Quantifier le virus par la méthode plaque-test comme décrit précédemment 17. </li><li> Traiter MCMV dans des armoires de biosécurité certifiées au niveau de biosécurité 2 portant des gants et un masque. </li><li> Passage MCMV (souche Smith) et MCMV recombinante dans MEFs préparés à partir de 12 jours d&#39;âge des embryons de souris ICR comme décrit précédemment 17. </li><li> Retirer les cellules des surnageants des cultures MEF infectées par centrifugation à 3000 x g pendant 20 min à 16 ° C. </li><li> Ultracentrifugation des surnageants pendant 40 min à 70 000 x g. Remettre en suspension les culots contenant les virions dans 1 ml de solution saline tamponnée au Tris et transférer sur un linéaire de préformésorbitol à gradient (25% - 70%). Ultracentrifugeuse de nouveau à 70.000 x g pendant 60 min 18. </li><li> La récolte de la bande contenant virion avec une seringue. Sédimenter les virions récoltées par une étape d&#39;ultracentrifugation supplémentaire à 70 000 x g pendant 40 min. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à ce que les expériences d&#39;infection. </li><li> Quantifier le titre viral par la méthode de dosage sur plaque 19 comme décrit précédemment. </li><li> Visualiser l&#39;expression de l&#39; EGFP des particules recombinantes MCMV (excitation à 489 nm, émission à 508 nm) , par microscopie à fluorescence (figure 1A) et la structure des particules par microscopie électronique à transmission (MET) 8 (figure 1B). </li></ol> 2. Préparation de microbilles Nile Red Fluorescent <ol><li> Achat carboxyle fluorescent Nil microbilles rouges et placer 500 ul de microbilles dans des tubes selon le diamètre (0,04- 0,06 pm, d&#39; environ 3,63 × 10 12 particules; De 0,1 à 0,3 um, d&#39; environ 5,75 x 10 10 particules; et 01.07 à 02.02 pm, d&#39; environ 6,85 x 10 7 particules). </li><li> Traiter perles avec 500 pi de NaOH 0,1 M pendant environ 1 jour pour enlever toutes les endotoxines et resuspendre les billes dans l&#39;eau stérile à la température ambiante. </li><li> Adsorber les billes O / N avec du sérum de souris à 10% obtenu à partir de souris C57BL / 6 à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Pour séparer les agrégats, les perles vortex et sonication soigneusement avant utilisation. </li></ol> 3. ICV Injection de mCMV et fluorescentes microbilles en souris néonatale <ol><li> Maintenir des souris ICR enceintes normales dans une installation à température contrôlée dans un cycle de 12 heures de lumière / obscurité. Les nouveau-nés sont désignés en tant que P 0,5 au jour de la naissance. </li><li> Stériliser une seringue de 10 ul et une aiguille 27 G avec 70% d&#39;alcool. </li><li> Charger la solution d&#39;injection (5 pl) contenant des micro MCMV ou fluorescentperles dans l&#39;aiguille en tirant avec précaution le piston de la seringue. </li><li> Retiens souris néonatale (P 0,5) en plaçant la souris sur la glace pendant 3 - 4 min. Une fois que l&#39;animal est sous anesthésie, utilisez la méthode de réponse des orteils de pincement pour déterminer la profondeur de l&#39;anesthésie. </li><li> Marquer le site d&#39;injection avec un stylo de laboratoire non-toxique à un endroit d&#39; environ 0,7 à 1,0 mm latéralement à la suture sagittale et 0,7 à 1,0 mm caudale de la bregma néonatale (figure 2A). </li><li> Insérer l&#39;aiguille de 2 mm de profondeur, perpendiculairement à la surface du crâne au niveau du site d&#39;injection marquée. Pour référence, marquer 2 mm de la pointe de l&#39;aiguille avec une machine non-toxique. </li><li> Injecter lentement 5 pi de MCMV (environ 5 x 10 5 pfu) dans le ventricule latéral sans ouvrir le cuir chevelu (Figure 2B). </li><li> Dans un autre groupe de souris, injecter une solution de 5 ul contenant des microbilles fluorescentes (0,1 à 0,3 um, d&#39; environ 5,75 x 10 8 particules) parla même méthode. </li><li> Retirez lentement l&#39;aiguille 10 - 20 secondes après l&#39;arrêt du mouvement de piston pour empêcher le reflux. </li><li> Pour récupérer, garder la souris pendant 5 - 10 min dans un récipient chaud jusqu&#39;à ce que le mouvement et la réactivité générale sont restaurés. </li><li> Récolter les cerveaux comme décrit dans la section 5, à une gamme de points de temps (3, 12, 24, 48, et 72 h) après l&#39;injection. </li></ol> 4. IV Injection de mCMV ou fluorescentes microbilles en souris néonatale <ol><li> Retiens souris néonatale (P 0,5) en plaçant la souris sur la glace pendant 3 - 4 min. </li><li> Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille 35 G pour effectuer l&#39;injection intraveineuse de 0,5 MCMV P nouveau-nés. </li><li> Utilisez un transilluminateur (veine finder) pour visualiser le temporel (facial) veine superficielle. Avant injection, fixer le nouveau - né à l&#39;transilluminateur en utilisant du ruban chirurgical (figure 2C). </li><li> Tout en portant des lunettes grossissantes (1.5X), infuser lentement 50 pi de MCMV (environ 5,45 ×; 10 9 particules) ou des microbilles fluorescentes (0,04 - 0,06 um, d&#39; environ 3,63 × 10 11 particules; 0,1 - 0,3 um, d&#39; environ 5,75 × 10 9 particules; et 1,7 - 2,2 um, d&#39; environ 6,85 x 10 6 particules) dans la veine temporale superficielle (figure 2D). </li><li> Après avoir retiré l&#39;aiguille, utiliser la gaze contenant 70% d&#39;alcool pour faire pression sur le site d&#39;injection jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. </li><li> Donnez le nouveau-né environ 5 min dans un récipient chaud pour récupérer avant de le retourner à la cage. </li><li> Récolter les cerveaux comme décrit dans la section 5, à une gamme de points de temps (3, 12, 24 et 72 heures) après l&#39;injection. </li></ol> 5. Cerveau Préparation des échantillons de tissus pour les sections paraffiniques <ol><li> Placez les nouveau-nés injectés dans un petit plat en plastique sur la glace pilée. </li><li> Une fois que l&#39;animal est sous anesthésie, utilisez la méthode de réponse des orteils de pincement afin de déterminer la profondeur de anesthesia. </li><li> Faire un coupes d&#39;extrémité centrales ou deux extrémités horizontales à travers la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique. </li><li> Faire une coupe dans l&#39;atrium avec des ciseaux pointus. Infuser paraformaldéhyde 4% (PFA) solution dans l&#39;oreillette. Arrêter la perfusion lorsque le mouvement spontané (PFA de danse) et de couleur allégée du foie sont observés. Ne pas être exsangue. </li><li> Disséquer le nouveau - né (comme décrit précédemment 20) en enlevant d&#39; abord la tête à l&#39; aide d&#39; une paire de ciseaux. </li><li> Faire une incision médiane le long du tégument du cou au nez pour exposer le crâne. </li><li> Placez l&#39;extrémité pointue d&#39;une paire de ciseaux d&#39;iris dans le foramen magnum d&#39;un côté, soigneusement glisser le long de la surface interne du crâne. </li><li> Faire une coupe étendant jusqu&#39;au bord distal de la surface du crâne postérieur, et faire une coupe identique sur le côté opposé. Dégagez le crâne autour du cervelet. </li><li> Retirer délicatement en arrière le crâne d&#39;un côté pour éviter d&#39;endommager le cerveau. Répétez cetteprocédure de l&#39;autre côté du cerveau. </li><li> Avec une spatule, couper les bulbes olfactifs et connexions nerveuses le long de la surface ventrale du cerveau. </li><li> Séparez délicatement le cerveau de la tête, le parage toute dure qui relient encore le cerveau sur le crâne à l&#39;aide de ciseaux, et retirer le cerveau. </li><li> Placer le cerveau dans un flacon de fixatif contenant 4% de PFA au moins 10 fois le volume du cerveau pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Déshydrater le tissu à travers une série de bains d&#39;éthanol graduées pour déplacer l&#39;eau, puis avec de la cire de paraffine infiltrer, la formation d&#39;un bloc. Couper le bloc de paraffine avec un microtome en tranches de 4 um d&#39; épaisseur 21. </li><li> Déparaffiner et réhydrater les diapositives des cerveaux infectés 22. Procéder à une hybridation in situ pour des sections de paraffine. </li></ol> 6. Cerveau Préparation des échantillons de tissus pour les sections congelées <ol><li> Retirez le cerveau en suivant les étapes décrites dans 05.01 à 05.11. </li><li> Pour observer les microbilles fluorescentes et M32-EGFP-MCMV, placez le cerveau réséquée sur cryomoules fond plat. Ajouter milieu d&#39;inclusion pour couvrir complètement l&#39;échantillon de cerveau. Snap geler les cryomoules dans prérefroidi n - hexane (-80 ºC), en utilisant une pince pour maintenir le bord des cryomoules avant de fixer au mandrin. </li><li> Pour sectionner, fixer le bloc de tissu congelé sur le cryostat chuck prérefroidi. Transférer le tissu congelé avec le mandrin dans une chambre de cryostat et abaisser la température entre -10 et -20 ° C, et couper les tranches d&#39; environ 8 à 10 um d&#39; épaisseur 23. </li><li> Fixer les sections avec cytofixative (mélange d&#39;alcool isopropylique et le polyéthylène glycol) par pulvérisation. Air sécher les sections pendant 30 min à température ambiante immédiatement après la pulvérisation, et les stocker à - 80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Equilibrer les sections de retour à température ambiante et laver trois fois avec PBS. </li><li> Colorer les sections avec l&#39; isothiocyanate de fluorescéine (FITC) Griffonia simplicifolia isolectine B4 à une concentration de 1: 100 pendant 10 min dans du PBS à la température ambiante (figure 5) ou avec un anticorps CD31 conjugué à PE , à une concentration de 1: 100 pendant 30 min dans du PBS à la température ambiante (figure 6). </li><li> Laver les sections avec du PBS à trois reprises. </li><li> Après le lavage, teinture avec les sections 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux cellulaires. Monter les sections dans le réactif anti-fade et de l&#39;image DAPI (excitation à 345 nm, émission à 455 nm), EGFP (excitation à 489 nm, émission à 508 nm) et rouge du Nil (excitation à 553 nm, émission à 637 nm) avec un microscope à fluorescence (figures 3, 5, 6). </li></ol> 7. Fluorescent in situ Hybridation (FISH) pour paraffine Sections <ol><li> Préparer la sonde FISH marqué directement avec fluorophore pour l&#39; ADN hybridation in situ par translation de coupure en utilisant un chromosome bactérien artificiel contenant l&#39;ensemble MCMV ADN genome (pSM3fr) 19. La concentration de la sonde FISH est de 0,1 pg / pl. </li><li> Déparaffiner et réhydrater les diapositives des cerveaux infectés 22. </li><li> Traiter les sections de tissu avec de la RNase (100 pg / ml dans du PBS) pour détecter l&#39;ADN viral. </li><li> Effectuer la récupération d&#39;antigène avec du NP40 à 0,05%, 0,01 M de tampon citrate (pH 6,0) à 95-98 ° C pendant 20 min. Refroidir les lames jusqu&#39;à la température ambiante pendant 20 min. </li><li> Dans un bocal de coloration de Coplin en verre, laver les lames dans l&#39;eau pure à trois reprises pendant 2 min à chaque fois. Effectuer une étape supplémentaire de récupération de l&#39;antigène avec une pepsine 0,06%, 0,01 solution N HCl pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Rincer les lames trois fois dans de l&#39;eau pure pendant 2 min à chaque fois dans un bocal de Coplin de coloration du verre. </li><li> Déshydrater les coupes de tissus en transférant à nouveau les lames de 70% d&#39;éthanol, 85% d&#39;éthanol, puis 100% d&#39;éthanol. </li><li> Pour la préparation de 10 ml du tampon d&#39;hybridation, mélanger 1,25 ml de sels d&#39;hybridation in situ (3 M de NaCl, 100 mM de Tris-HCl , PH 8,0, 100 mM de phosphate de sodium , pH 6,8, EDTA 50 mM) avec 5 ml de formamide désionisé, 2,5 ml de 50% de sulfate de dextran, 250 ul de 50 x solution de Denhardt, 125 ul de 100 mg / ml d&#39; ARNt et 875 ul de H 2 O. </li><li> Diluer la sonde d&#39;ADN marqué directement avec des fluorophores qui reconnaissent la totalité du génome de MCMV de façon aléatoire dans le tampon d&#39;hybridation. Le volume final doit être de 10 ul (tampon d&#39;hybridation 7 ul, 1 ul de la sonde (0,1 ug / ul) et 2 ul d&#39;eau distillée). </li><li> Ajouter le mélange de sonde (10 pi) à chaque diapositive et couvrir avec une lamelle (15 × 15 mm). Sceller la lamelle couvre-objet avec du ciment de caoutchouc. Dénaturer le mélange de la sonde pendant 5 min à 85 ° C, et terminer l&#39;étape d&#39;hybridation O / N à 42 ° C. </li><li> Laver les lames avec 0,3% de NP40, 0,4x SSC à 73 ° C pendant 2 minutes; avec 0,1% de NP40, 0,4 x SSC à 73 ° C pendant 1 min; et avec 2x SSC deux fois. </li><li> Counterstain les noyaux avec DAPI (10 ng / ml) et couvrir la lame avec une lamelle. </li><li> Monterles sections de réactif anti-fade et de l&#39; image DAPI (excitation à 345 nm, émission à 455 nm) et EGFP (excitation à 489 nm, émission à 508 nm) avec un microscope à fluorescence (figure 4). </li></ol>

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<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans les modèles animaux, ICV, intrapéritonéale, placentaire directe, et les infections IV ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l&#39;encéphalite virale. Nous nous sommes concentrés sur les modèles de ICV et d&#39;injection IV de souris néonatales pour la simplicité des procédures et l&#39;avantage de l&#39;injection directe de particules dans la région cible. Bien que l&#39; infection intrapéritonéale est une méthode facile, les particules virales se propagent de manière systémique par l&#39; intermédiaire ...

Lorsque l&#39;on étudie l&#39;encéphalite virale, la distribution initiale des particules virales est très important de comprendre la pathogenèse de la maladie et d&#39;identifier des cibles virales dans le cerveau. La plupart des virus varient en taille de 20 à 300 nm, bien que la pandoravirus est supérieure à 700 nm de taille 1. La distribution des particules virales dans la phase aiguë de l&#39;infection peut dépendre de la taille des particules, la distribution des récepteurs cellulaires, ou l&#39;affinité des récepteurs cellulaires pour le virus. Dans les modèles animaux, intracérébroventriculaire (ICV), intrapéritonéale, placentaires directe, et par voie intraveineuse (IV) infections ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l&#39;encéphalite virale. ICV inoculation du virus est souvent utilisé pour établir le système nerveux (SNC) chez les souris centrales. Les études utilisant cette technique signalent une infection généralisée, en particulier de cellules dans les zones périventriculaires et dans les régions du cerveau en contact direct avec le liquide céphalo-rachidien (LCR), similar aux effets de ventriculoencephalitis virale. La petite taille du virus adéno-associé (AAV) , des particules (20 à 25 nm de diamètre) facilite leur diffusion dans le cerveau , dans les infections ICV 2-4. Intrapéritonéal 5, placentaires directe 6, et IV injections 7 représentent l&#39; administration systémique hématogène. La pénétration des particules virales à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) leur permet d&#39;atteindre le parenchyme du cerveau du nouveau - né, ce qui représente des nodules microgliales diffuses 8,9. Cytomégalovirus (CMV) est un virus commun qui appartient à la famille des virus de l&#39;herpès. Aux États-Unis, 50% - 80% des gens ont eu une infection à CMV par âge 40. les infections à CMV sont rarement dangereux, mais peuvent causer des maladies chez les patients immunodéprimés et les fœtus. De toutes les livraisons, 0,2% - 2% sont nés avec CMV 10, entraînant des symptômes sévères tels que microcéphalie, calcifications périventriculaires, hypoplasie cérébelleuse, microphtalmie, et le nerf optique atrophie 11,12. En outre, le retard mental, la surdité de perception, les défauts visuels, la saisie et l&#39; épilepsie surviennent chez environ 10% des nourrissons infectées par le CMV non mortellement 13,14. un dysfonctionnement du SNC est le symptôme caractéristique la plus commune de CMV anomalie congénitale. Plus d&#39; enfants sont handicapés de façon permanente chaque année par CMV congénitale que par le syndrome de Down, le syndrome d&#39;alcoolisme foetal, ou le spina - bifida 15. Il n&#39;y a pas de vaccins contre le CMV disponible à l&#39;heure actuelle, appelant à un besoin d&#39;un vaccin sûr et efficace. L&#39;étude de l&#39;interaction des particules CMV avec leurs récepteurs dans la première phase de l&#39;infection est important de comprendre l&#39;effet de la vaccination. Ventriculoencephalitis et nodules microgliales diffuses sont les deux principales caractéristiques pathologiques de CMV encéphalite 16. Il a été incertain comment les particules CMV (150-300 nm) répartis à travers le cerveau dans la phase aiguë de l&#39;infection d&#39;unnd comment la distribution des récepteurs cellulaires et leur affinité pour les virus contribuent à la propagation virale. Kawasaki et al. Ont évalué ICV et IV infections du point de vue de la distribution des particules et de leurs récepteurs (β1 intégrines) dans la première phase de l&#39; infection. Nous avons constaté que la diffusion de particules CMV et l&#39;expression de β1 intégrines sont bien corrélées à la première phase de l&#39; infection dans les deux ICV et les infections IV 8. infection ICV est un modèle de ventriculoencephalitis et l&#39;infection IV est un modèle de nodules microgliales diffuses. L&#39;étude de la dynamique des particules virales ou fluorescentes donnerait des informations utiles sur l&#39;effet de la taille des particules, les interactions virales avec des récepteurs cellulaires, et le mécanisme de pénétration BBB dans le cerveau. Le protocole suivant peut être utilisé pour enquêter sur toute infection virale et vecteur viral dans le SNC.

<table><tbody><tr><td>tris ; tris(hydroxyméthyl)- aminométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vecteur&nbsp ;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Polystyrène fluorescent rouge du Nil 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&nbsp ;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10 % sérum de souris</td><td>DAKO&nbsp ;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 souris</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris ICR</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues modifiées d’un microlitre (série 7000)</td>Aiguille de calibre 35 de <td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de citrate (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt’s Solution (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Levure tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus verre</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Griffonia simplicifolia conjugué à la FITC isolectine B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&nbsp ; Or</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracérébroventriculaire et intravasculaire injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Dans l&#39;étude sur la pathogenèse de l&#39;encéphalite virale, la méthode d&#39;infection est critique. La première des deux voies principales infectieuses vers le cerveau est la voie hématogène, ce qui implique l&#39;infection des cellules et les pericytes du cerveau endothéliales. Le second est le intracérébroventriculaire (ICV) itinéraire. Une fois dans le système nerveux central (SNC), les virus peuvent se propager dans l&#39;espace sous-arachnoïdien, des méninges et plexus choroïde par le liquide céphalorachidien. Dans des modèles expérimentaux, les premiers stades de la distribution virale CNS ne sont pas bien caractérisées, et il est difficile de savoir si seules certaines cellules sont initialement infectées. Ici, nous avons analysé la distribution du cytomégalovirus (CMV) particules pendant la phase aiguë de l&#39;infection, appelée virémie primaire, suivant ICV ou intravasculaire (IV) l&#39;injection dans le cerveau de souris néonatale. Dans le modèle d&#39;injection ICV, 5 pi de CMV murin (MCMV), ou des microbilles fluorescentes ont été injectées dans le ventricule latéral du midpoint entre l&#39;oreille et l&#39;oeil en utilisant une seringue de 10 ul avec une aiguille 27G. Dans le modèle d&#39;injection intraveineuse, une seringue de 1 ml avec une aiguille de 35 G a été utilisée. Un transilluminateur a été utilisé pour visualiser le temps (faciale) veine superficielle de la souris néonatale. Nous infusé 50 pi de MCMV ou microbilles fluorescentes dans la veine temporale superficielle. Les cerveaux ont été récoltés à différents moments après l&#39;injection. Génomes Mcmv ont été détectés en utilisant la méthode dans d&#39;hybridation in situ. microbilles fluorescentes ou protéine fluorescente verte exprimant des particules Mcmv recombinantes ont été observées par microscopie à fluorescence. Ces techniques peuvent être appliquées à de nombreux autres agents pathogènes pour étudier la pathogenèse de l&#39;encéphalite.

Dans les études sur la pathogenèse de l&#39;encéphalite virale, la méthode d&#39;infection est importante. La voie hématogène représente une infection aiguë des cellules et des pericytes du cerveau endothéliales, alors que la route ICV représente une infection aiguë propagation via le CSF à travers l&#39;espace méningée, atteignant les méninges et le plexus choroïde. À analyser la première distribution de particules dans l&#39; encéphalite aiguë, une hybridation in situ pour la ...

Ici, nous décrivons une méthode simple d’injection intraventriculaire et intravasculaire de particules virales ou de microbilles fluorescentes dans le cerveau de souris néonatale. Le modèle de localisation du virus et des nanoparticules a pu être détecté par évaluation microscopique ou par hybridation in situ.

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer la distribution des particules virales durant la phase aiguë de l'infection dans le système nerveux central. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurovirologie, telles que : comment les particules virales se répartissent-elles dans le système nerveux central immature durant la phase aiguë de l'infection ?L'avantage principal de cette technique est que la distribution initiale des particules virales peut être observée directement au microscope à l'aide de deux méthodes simples, telles que l'injection intercérébroventriculaire et l'injection intravasculaire. Commencez par stériliser une seringue de 10 microlitres et une aiguille de calibre 27 avec de l'alcool à 70 %.Ensuite, charger cinq microlitres de solution d'injection de cytomégalovirus murin ou de microbilles fluorescentes dans l'aiguille en tirant soigneusement sur le piston de la seringue. Après avoir anesthésié et immobilisé un souriceau âgé de 0,5 jour (PO,5) en le plaçant sur de la glace pendant trois à quatre minutes, utiliser la méthode de réponse à la pression du pied pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Marquer le site d'injection sur le souriceau anesthésié à l'aide d'un stylo de laboratoire non toxique, à un emplacement situé approximativement entre 0,7 et 1,0 mm latéralement par rapport à la suture sagittale et entre 0,7 et 1,0 mm en direction caudale par rapport au bregma néonatal.Ce diagramme montre le site en détail. À titre de repère, marquez 2 mm à partir de l'extrémité de l'aiguille à l'aide d'un marqueur non toxique. Ensuite, insérez l'aiguille perpendiculairement à la surface du crâne sur une profondeur de 2 mm, au site d'injection marqué.Ensuite, injecter lentement 5 microlitres de cytomégalovirus murin dans le ventricule latéral sans ouvrir le cuir chevelu. Dans un autre groupe de souris, injecter une solution de 5 microlitres contenant des microbilles fluorescentes selon la même méthode. Après l'injection, laisser l'aiguille en place pendant 10 à 20 secondes afin de prévenir tout reflux.Retirer ensuite lentement l'aiguille. Laisser les animaux injectés se remettre pendant 5 à 10 minutes dans un récipient chaud jusqu'à ce que les mouvements et la réactivité générale soient rétablis. Pour l'injection intraveineuse, fixer le nouveau-né anesthésié sur le transilluminateur à l'aide de ruban chirurgical, puis visualiser la veine temporale superficielle.Ensuite, tout en portant des lunettes de grossissement 1,5x, utilisez une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de calibre 35 pour infuser lentement 50 microlitres de virus de la cytomégalovirose murine dans la veine temporale superficielle. Répétez à nouveau la procédure avec des microbilles fluorescentes de taille appropriée dans le groupe témoin. Après retrait de l'aiguille, appliquez un coton imbibé d’alcool à 70 % sur le site d'injection afin d'exercer une pression jusqu'à l'arrêt du saignement.Donnez au nouveau-né environ cinq minutes dans un récipient chaud pour qu'il se remette avant de le ramener dans la cage. Deux heures après l'injection intracérébroventriculaire, lors de la phase aiguë d'infection, les particules vertes recombinantes M32 EGFP MCMV sont principalement observées dans la zone marginale, comme indiqué par les flèches et visibles dans la région agrandie. À ce stade, les particules M32 EGFP MCMV sont également visibles dans le plexus choroïde et la zone sous-ventriculaire.Le génome du MCMV est d'abord détecté dans la zone subventriculaire trois heures après une injection intraventriculaire. À l'aide de l'hybridation fluorescente et C2, le génome du MCV apparaît sous forme de points verts et est indiqué par des flèches dans cette région agrandie. Trois heures après une injection intraveineuse, les particules de MCMV visibles sous forme de points verts et indiquées par des flèches se trouvent à l'intérieur et à l'extérieur de la zone vasculaire du parenchyme, comme le montre cette image à plus fort grossissement.À ce stade, les particules de MCMV sont encore visibles dans le plexus choroïde et la zone subventriculaire. À l’aide de l’hybridation fluorescente et de C2, le génome du MCMV est détecté dans la région vasculaire et les méninges 12 heures après l’injection intraveineuse. Comme indiqué par les flèches.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq minutes si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment observer la distribution des particules virales pendant la phase aiguë de l'infection dans le système nerveux central. N'oubliez pas que travailler avec un virus peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de masques et de gants, doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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Apprenez l'injection intracérébroventriculaire et intravasculaire de particules virales et microbilles fluorescentes dans le cerveau néonatal de souris. Cette technique permet d'observer directement la distribution virale pendant la phase aiguë de l'infection dans le système nerveux central.

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal (Vidéo) | JoVE Journal

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

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