Name: typage de Campylobacter jejuni Ssp. doylei Les isolats utilisant PhyloProteomics basés sur la spectrométrie de masse (MSPP) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez le typage par phylo-protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MSPP) pour Campylobacter jejuni ssp. doylei. Cette méthode rapide et économique permet d'analyser la parenté des souches bactériennes.

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Nous sommes reconnaissants à Hannah Kleinschmidt pour son excellent support technique. Cet article a été financé par le programme de soutien à l’Open Access de la Deutsche Forschungsgemeinschaft et le fonds de publication de la Georg August Universität Göttingen.

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<li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+on-target+lysis+%28YOTL%29%2C+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;étape la plus critique dans la mise en place d&#39;un régime MSPP est la détermination génétique sans équivoque des identités biomarqueur d&#39;ions. S&#39;il est impossible d&#39;identifier un biomarqueur sans aucun doute, alors il devrait être exclu du régime 13. C. ssp. doylei régime jejuni comprend 14 ions de biomarqueurs différents. Ceux - ci sont 5 moins par rapport à C. ssp jejuni. schéma jejuni MSPP 13 ...

Au cours de la dernière décennie, laser assistée par matrice désorption ionisation spectrométrie à temps de vol de masse (MALDI-TOF MS) a avancé comme une méthode standard très apprécié pour le genre microbienne et l&#39; identification des espèces en microbiologie clinique 1, 2. L&#39;identification des espèces est basée sur l&#39;enregistrement des petites empreintes de protéines des cellules intactes ou des lysats cellulaires. La gamme typique de masse pour un spectromètre de masse utilisé en microbiologie clinique de routine est 2-20 kDa. En outre, les spectres résultant peut être utilisé pour distinguer les souches aux dessous-espèces et sous - espèces ci - dessous-niveau 3. Les premières études pionnières ont identifié des ions de biomarqueurs spécifiques pour un sous - groupe particulier de souches de Campylobacter jejuni 4, 5 Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica sérotype Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9 et Escherichia coli 10-12. La combinaison de plusieurs masses de biomarqueurs variables correspondant aux isoformes alléliques offre la possibilité de sous-typage plus profond. Auparavant, nous avons mis en place avec succès une méthode pour convertir ces variations dans les profils de masse dans les relations phyloproteomic significatives et reproductibles appelés phyloproteomics basés spectrométrie de masse (MSPP) sur un C. ssp jejuni. collection isolat jejuni 13. MSPP peut être utilisé d&#39;une spectrométrie de masse équivalente à des techniques de typage à base de séquences d&#39;ADN comme le typage de séquence multilocus (MLST). Espèces de Campylobacter sont la principale cause de gastro - entérite bactérienne dans le monde entier 14, 15. En conséquence de sequela post-infectieuse campylobactériose, à savoir, le syndrome de Guillain - Barré, l&#39; arthrite réactive et la maladie inflammatoire de l&#39; intestin peut se produire 16. Les principales sources d&#39;infection sontla viande de bétail contaminé du poulet, de la dinde, du porc, des bovins, des moutons et des canards, le lait et l&#39; eau de surface 15, 17. Par conséquent, les études de surveillance épidémiologique régulière dans le contexte de la sécurité alimentaire sont nécessaires. MLST est le «gold standard» dans le typage moléculaire pour les espèces de Campylobacter 18. Parce que le Sanger séquençage méthode MLST base est un travail intensif, de temps et relativement coûteux, MLST typage est limitée à relativement petites cohortes isolées. Par conséquent, il existe un besoin de méthodes de typage moins coûteux et plus rapide. Ce besoin pourrait être satisfaite par des méthodes de spectrométrie de masse comme MSPP. Cet article présente un protocole détaillé pour MSPP-typage en utilisant une collection de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolats et la comparaison de son potentiel avec MLST.

<table><tbody><tr><td>acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Système Autoflex III TOF/TOF 200</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>GT02554 G201</td><td>Spectromètre de masse</td></tr><tr><td>norme d’essai bactérien BTS</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>263564</td><td>Progiciel</td></tr><tr><td>Étalon de test bactérien Bruker IVD</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>8290190</td><td>5 tubes</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique collection coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349 ; IMVS 1141 ; NCTC 11951 ; souche 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique coordination de la collecte de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350 ; CCUG 18265 ; Kasper 71 ; LMG 8219 ; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp ;</td><td>Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, Belgique</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Base de gélose Columbia&nbsp ;</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Boussole pour FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>251419</td><td>Progiciel</td></tr><tr><td>de sang de mouton défibriné&nbsp ;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Allemagne</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td></td><td>éthanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>02854 Acide</td> formique Fluka <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matrice HCCA</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Tissu en papier Kimwipes</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>259935</td><td>Progiciel</td></tr><tr><td>Mât Cryobank flacons</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Allemagne</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 cible en acier poli</td><td>Bruker Daltonics, Brême, Allemagne</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>insuline humaine recombinante</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>eau, biologie moléculaire</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

typage de<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; les isolats utilisant phyloproteomics basés sur la spectrométrie de masse (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offre la possibilité de différencier certaines bactéries non seulement au niveau des espèces et sous-espèces, mais même au-dessous, au niveau de la souche. isoformes alléliques des ions de biomarqueurs détectables se traduisent par des changements de masse spécifiques isolés. phyloproteomics basée sur la spectrométrie de masse (MSPP) est une nouvelle technique qui combine les spectrométriques de masse détectables masses de biomarqueurs dans un système qui permet la déduction des relations phyloproteomic de isoler des changements de masse spécifiques par rapport à un génome séquencé souche de référence. Les séquences d&#39;acides aminés déduites sont ensuite utilisées pour calculer dendrogrammes à base de RRMS. Nous décrivons ici le flux de travail de MSPP en tapant un ssp Campylobacter jejuni. Doylei collection isolat de sept souches. Les sept souches étaient d&#39;origine humaine et multilocus sequence typing (MLST) ont démontré leur diversité génétique. MSPP-typage a donné lieu à sept types de séquence MSPP différents, reflétant suffisamment leur phyrelations logenetic. C. jejuni ssp doylei régime MSPP comprend 14 ions de biomarqueurs différents, la plupart du temps des protéines ribosomiques dans la gamme de masse de 2 à 11 kDa.. MSPP peut en principe, être adapté à d&#39;autres plates-formes de spectrométrie de masse avec une gamme étendue de masse. Par conséquent, cette technique a le potentiel de devenir un outil utile pour le typage microbien de niveau de la souche.

Auparavant, nous avons réussi à établir un régime MSPP pour C. ssp jejuni. jejuni 13. Ici, nous avons cherché à étendre la méthode à la fratrie sous - espèce C. ssp jejuni. doylei. Dans ce cadre spécifique, sept C. ssp jejuni. doylei isolats ont été acquis de la collection belge de micro - organismes / Laboratoire de microbiologie UGent BCCM / LMG Gand, Belgique. Les sept souches utilisées pour le...

Mass phyloproteomics la spectrométrie (MSPP) a été utilisé pour taper une collection de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolats au niveau de la souche par rapport à multilocus sequence typing (MLST).

typage de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Les isolats utilisant PhyloProteomics basés sur la spectrométrie de masse (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

L'objectif général de cette procédure de spectrométrie de masse, appelée MSPP ou Phyloprotéomique basée sur la spectrométrie de masse, est de sous-typiser les bactéries au niveau de la souche. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans les domaines de la microbiologie, de l'épidémiologie et de l'hygiène. Par exemple, elle peut être utilisée pour analyser des situations de flambée épidémique en visualisant les liens phyloprotéomiques.Par rapport à d'autres méthodes de typage, le MSPP est peu coûteux par échantillon et très rapide. Les infections nosocomiales constituent un problème d'importance croissante, et nous espérons que notre schéma de MSPP pourra être étendu au typage épidémiologique d'autres bactéries, voire de champignons. Notre schéma de MSPP permet de comprendre les liens de parenté entre souches ; ainsi, pour prédire des phénotypes pertinents, tels que la résistance aux médicaments ou même la virulence, il est pertinent de l'appliquer lorsque ces phénotypes sont corrélés à des génotypes spécifiques.Pour commencer cette procédure, préparez deux tubes de solution matricielle en dissolvant 2,5 milligrammes de HCCA dans 250 microlitres d'un mélange de solvant organique, un isonitrile à 50 %. Ajoutez de l'insuline humaine recombinante comme étalon interne à l'un d'eux, puis 47,5 % d'eau doublement distillée et 2,5 % d'acide trifluoroacétique. Ensuite, déposez une quantité de la taille d'une tête d'épingle d'une colonie de la souche de référence directement sur une plaque cible MALDI.Pour la détermination de la masse exacte du pic d'étalonnage, déposez un microlitre d'étalon témoin sur un autre emplacement. Recouvrez chaque point de bactéries et d'étalon avec 1 microlitre de solution matricielle dopée au HCCA et laissez cristalliser à température ambiante. Pour chaque souche à analyser, répétez la préparation du prélèvement.Recouvrir chaque spot avec 1 microlitre de solution matricielle HCCA dopée et laisser cristalliser à température ambiante. Alternativement, les protéines peuvent être extraites à partir de cellules difficiles à lysater. Pour cela, récolter environ 5 colonies à partir d'une culture sur boîte de Petri contenant de l'agar à l'aide d'une boucle d'inoculation.Les suspendre dans 300 microlitres d'eau doublement distillée dans un tube réaction de 1,5 millilitre, puis les mélanger soigneusement par des pipetages répétés jusqu'à ce que les colonies bactériennes soient complètement en suspension. Ajouter ensuite 900 microlitres d'éthanol absolu et mélanger. Centrifuger l'échantillon à 13 000 g pendant 1 minute.Après avoir séché le culot, le resuspendre en pipettant de haut en bas dans 50 microlitres d'acide formique à 70 %. Ensuite, ajouter 50 microlitres d'acétonitrile et mélanger. Éliminer les débris par centrifugation à 13 000 g pendant 2 minutes.Lorsque terminé, transférez 1 microlitre du surnageant sur une position d'échantillon d'une plaque cible MALDI. Après avoir laissé l'échantillon sécher, recouvrez chaque point avec un microlitre de solution matricielle HCCA et laissez cristalliser à température ambiante. À ce stade, effectuez l'analyse MALDI-TOF en acquérant 600 spectres en pas de 100 tirs pour chaque point.Tout d'abord, cliquez sur l'onglet d'exécution automatique dans le logiciel de configuration du spectromètre de masse. Ouvrez la méthode en cliquant sur le bouton de méthode avec le bouton gauche de la souris et en sélectionnant la méthode dans le menu déroulant. Ensuite, cliquez avec le bouton gauche sur le bouton d'édition pour ouvrir l'éditeur de méthode d'exécution automatique.Sous l'onglet accumulation, réglez la valeur de prise satisfaisante à 100 et la valeur d'addition à 600. Pour chaque spectre, sélectionnez le pic de calibrage dans la liste, cliquez sur « attribuer automatiquement » puis appuyez sur « OK ». Après avoir obtenu les spectres de masse de chaque point, déterminez expérimentalement la masse exacte du pic de calibration en ouvrant un spectre à l’aide du navigateur de spectres et en localisant le pic à la masse attendue, en comparaison avec un spectre sans calibrant. Vérifiez que le pic de calibrage n’est pas masqué par un autre biomarqueur de l’organisme d’intérêt.À partir des données de séquençage génomique de la souche de référence, calculez la masse moléculaire monoisotopique théorique de chacune des protéines codées en traduisant la séquence d'ADN en la séquence d'acides aminés correspondante. Téléversez le fichier ou copiez-collez cette séquence protéique dans la zone de saisie du panneau de ressources bioinformatiques approprié, puis calculez le point isoélectrique théorique et la masse moléculaire. Copiez les résultats dans un tableur comportant une colonne contenant l'identifiant du gène et une autre colonne contenant la masse moléculaire.Triez les lignes par masse moléculaire calculée afin de faciliter la recherche des masses. Insérez une colonne supplémentaire dans le tableau pour la masse moléculaire de la forme démathianinée, en soustrayant 135 daltons de la masse moléculaire monoisotopique. Attribuez chaque masse de biomarqueur majeure mesurée aux masses calculées à partir de la souche de référence, en recherchant la masse mesurée dans le tableau génomique.Dans une autre feuille de calcul, enregistrez la masse et l'identifiant de chaque ion biomarqueur. Étalonnez maintenant les spectres de masse obtenus à partir des isolats collectés, comme cela a été fait pour la souche de référence. Pour un isolat par ligne, identifiez les biomarqueurs variants dans les spectres de masse, notez la masse mesurée pour chaque biomarqueur et l'isoforme prédite dans les colonnes respectives.Le spectre de masse MALDI-TOF de C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 contient 14 ions biomarqueurs chargés simplement qui ont pu être identifiés par comparaison des masses moléculaires calculées avec le spectre de référence. Au sein de la collection, des isoformes variables ont été détectées pour L32 sans méthionine, L33 et la protéine hypothétique codée par gil152939117, S20 M et S15 M. Les masses restantes attribuées aux ions biomarqueurs étaient invariables dans les isolats testés. La substitution d'acide aminé correspondant au décalage de masse a été identifiée par amplification PCR et séquençage de Sanger du gène particulier en utilisant les amorces énumérées ici.Les séquences d'acides aminés de tous les ions biomarqueurs inclus dans le schéma MSPP, ainsi que les isoformes alléliques détectées, sont indiquées ici. Le dendrogramme UPGMA basé sur le MLST, construit à partir des isolats examinés de la sous-espèce C jejuni doylei, montre que chaque isolat appartient à un type de séquence MLST différent. La souche LMG7790 présente la distance phylogénétique la plus longue.Comme observé avec l'analyse MLST, l'isolat LMG7790 présente la plus grande distance phylogénomique dans l'analyse MSPP des isolats examinés de la sous-espèce C jejuni doylei. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se souvenir de la toxicité de certaines substances utilisées pendant l'expérience.Par exemple, l'acétonitrile peut provoquer une irritation cutanée. De plus, outre la MSPP, d'autres méthodes comme le séquençage de l'ADN peuvent être réalisées pour analyser d'autres paramètres, tels que la présence de gènes de résistance. Le développement de cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la photogénie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension du fonctionnement du MSPP et de la manière dont il peut être appliqué à des questions spécifiques. N’oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes dangereux peut être extrêmement risqué, et que des précautions telles que l’utilisation d’équipements de laboratoire de niveau S2 doivent toujours être prises.

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Découvrez le typage par phylo-protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MSPP) pour Campylobacter jejuni ssp. doylei. Cette méthode rapide et économique permet d'analyser la parenté des souches bactériennes.

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