typage de Campylobacter jejuni Ssp. doylei Les isolats utilisant PhyloProteomics basés sur la spectrométrie de masse (MSPP)

L’objectif global de cette procédure de spectrométrie de masse, appelée MSPP ou PhyloProteomics basée sur la spectrométrie de masse, est de sous-typer les bactéries au niveau de la souche. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans les domaines de la microbiologie, de l’épidémiologie et de l’hygiène. Par exemple, il peut être utilisé pour analyser les situations d’épidémie en visualisant la parenté phylotomique.

Comparé à d’autres méthodes de typage, le MSPP est bon marché par échantillon et très rapide. Les infections nosocomiales sont un problème de plus en plus important, et nous espérons que notre programme MSPP pourra être étendu au typage épidémiologique d’autres bactéries, voire de champignons. Notre schéma MSPP donne un aperçu de la parenté des souches, donc pour la prédiction de phénotypes pertinents, tels que la résistance aux médicaments, ou même la virulence, il est logique de l’appliquer lorsque ces phénotypes sont en corrélation avec des génotypes spécifiques.

Pour commencer cette procédure, préparez deux tubes de solution matricielle en dissolvant 2,5 milligrammes de HCCA dans 250 microlitres d’un mélange de solvants organiques, un isonitrile à 50 %. Ajoutez de l’insuline humaine recombinante en tant que calibrage interne à l’un d’entre eux, puis 47,5 % d’eau distillée deux fois et 2,5 % d’acide trifluoroacétique. Ensuite, étalez une quantité de la taille d’une tête d’épingle d’une colonie de la souche de référence, directement sur une plaque cible maldi.

Pour déterminer la masse exacte du pic d’étalonnage, placez sur un microlitre d’étalon de test à un autre endroit. Superposez chaque tache de bactéries et d’étalon avec 1 microlitre de solution de matrice enrichie HCCA et laissez-les cristalliser à température ambiante. Pour chaque souche à analyser, répétez la préparation du frottis.

Superposez chaque tache avec 1 microlitre de solution de matrice HCCA enrichie et laissez cristalliser à température ambiante. Alternativement, les protéines peuvent être extraites de cellules difficiles à mentir. Pour cela, récoltez environ 5 colonies à partir d’une culture sur plaque de gélose avec une boucle d’inoculation.

Suspendez-les dans 300 microlitres d’eau double distillée dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, et mélangez-les soigneusement par pipetage répété jusqu’à ce que les colonies bactériennes soient complètement en suspension. Ajoutez ensuite 900 microlitres d’éthanol absolu et mélangez. Centrifuger l’échantillon à 13 000 g pendant 1 minute.

Après avoir séché la pastille, mettez-la en suspension en la pipetant de haut en bas dans 50 microlitres d’acide formique à 70 %. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’acéto-nitrile et mélangez. Retirez les débris par centrifugation à 13 000 g pendant 2 minutes.

Une fois terminé, transférez 1 microlitre du supernommé sur une position d’échantillon sur une plaque cible maldi. Après avoir laissé sécher l’échantillon, recouvrez chaque point d’un microlitre de solution de matrice HCCA et laissez cristalliser à température ambiante. À ce stade, effectuez une analyse MALDI-TOF en rassemblant 600 spectres en 100 étapes de prise de vue pour chaque point.

Tout d’abord, cliquez sur l’onglet d’exécution automatique dans le logiciel de configuration du spectromètre de masse. Ouvrez la méthode en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur le bouton de la méthode et en choisissant la méthode dans le menu déroulant. Ensuite, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le bouton d’édition pour ouvrir l’éditeur de méthode d’exécution automatique.

Sous l’onglet accumulation, réglez la valeur de tir satisfaisante sur 100 et la valeur de somme sur 600. Pour chaque spectre, choisissez le pic de l’étalon dans la liste, cliquez sur attribuer automatiquement' et appuyez sur OK’Après avoir obtenu les spectres de masse de chaque point, déterminez expérimentalement la masse exacte du pic d’étalonnage, en ouvrant un spectre avec le navigateur de spectre et en trouvant le pic à la masse attendue par rapport à un spectre sans étalon. Vérifiez que le pic du calibrant n’est pas masqué par un autre biomarqueur de l’organisme d’intérêt.

À partir des données de séquençage du génome de la souche de référence, calculez le poids moléculaire monoisotopique théorique de chacune des protéines codées en traduisant la séquence d’ADN en séquence d’acides aminés correspondante. Téléchargez le fichier ou copiez-collez cette séquence protéique dans la boîte de saisie du panneau de ressources bioinformatiques approprié, et calculez le point isoélectrique théorique et le poids moléculaire. Copiez les résultats dans une feuille de calcul avec une colonne contenant l’identificateur de gène et une autre colonne le poids moléculaire.

Triez les lignes par poids moléculaire calculé, pour faciliter la recherche des masses. Insérez une colonne supplémentaire dans la feuille de calcul pour la masse moléculaire de la forme démathianisée, en soustrayant 135 dautons de la masse moléculaire mono-isotopique. Attribuez chaque masse de biomarqueur majeur mesurée aux masses calculées à partir de la souche de référence, en recherchant la masse mesurée dans la table du génome.

Dans une autre feuille de calcul, notez la masse et l’identificateur de chaque ion biomarqueur. Étalonnez maintenant les spectres de masse obtenus à partir des isolats de collection comme cela a été fait pour la souche de référence. Pour un isolat par rangée, identifiez les biomarqueurs variants dans les spectres de masse, notez la masse mesurée pour chaque biomarqueur et l’isoforme prédite dans les colonnes respectives.

Le spectre de masse MALDI-TOF de la sous-espèce C-Jejuni doylei ATCC 49349 contient 14 ions biomarqueurs singulièrement chargés qui ont pu être identifiés en comparant les masses moléculaires calculées avec le spectre de référence. Au sein de la collection, diverses formes iso ont été détectées pour L32 sans méthionine, L33 et la protéine hypothétique codée par gil152939117, S20 M et S15 M. Les masses restantes attribuées aux ions biomarqueurs étaient invariables dans les isolats testés. La substitution d’acides aminés correspondant au changement de masse a été identifiée par amplification PCR et séquençage de Sanger du gène particulier à l’aide des amorces énumérées ici.

Les séquences d’acides aminés de tous les ions biomarqueurs inclus dans le schéma MSPP, ainsi que les isoformes aléliques détectées sont indiquées ici. Le dendrogramme UPGMA basé sur le MLST, construit à partir des isolats examinés de la sous-espèce C jejuni doylei, montre que chaque isolat appartient à un type de séquence MLST différent. Et la souche LMG7790 a la plus longue distance phylogénétique.

Comme on l’a vu avec MLST alaysis, l’isolat LMG7790 a la plus longue distance phyloprodéomique dans l’analyse MSPP des isolats examinés de la sous-espèce C. jejuni doylei. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée si elle est correctement exécutée. En suivant cette procédure, il est important de se rappeler la toxicité de certaines substances utilisées pendant l’expérience.

Par exemple, l’acéto-nitrile peut provoquer une irritation de la peau. De plus, d’autres méthodes, comme le séquençage de l’ADN, peuvent être utilisées pour analyser d’autres paramètres, comme la présence de gènes de résistance. Le développement de cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la photogénie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension du fonctionnement du MSPP et de la manière dont il peut être appliqué à des questions spécifiques. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes violents peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’équipement de laboratoire S2 doivent toujours être prises.