Méthodes de aiguë et subaiguë murin Ischémie membres postérieurs

L'objectif général de ce protocole est de modéliser la maladie artérielle périphérique humaine par la pose de fils de suture ou de constricteurs en ameroid sur l'artère fémorale de la souris afin d'induire respectivement une ischémie aiguë ou subaiguë du membre postérieur. La maladie artérielle périphérique constitue un problème clinique important, et ces techniques utilisant des modèles animaux ont été mises au point pour représenter de manière plus fidèle la maladie humaine. Le principal avantage de ces techniques réside dans la possibilité pour l'expérimentateur de contrôler la gravité et le moment de l'apparition de l'ischémie du membre.

Mike Padgett, un technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure. Un à deux jours avant la procédure, confirmez que la souris est complètement sédée en l'absence de réponse à une pincée du orteil, puis appliquez une pommade ophtalmique. Ensuite, utilisez un petit rasoir électrique pour raser les poils des deux membres postérieurs.

Lorsque tous les poils ont été coupés, appliquez une crème dépilatoire préalablement réchauffée. Après une minute, essuyez délicatement la crème avec un tampon de gaze humide. Ensuite, placez la souris dans une cage de récupération vide, tapissée de papier absorbant, jusqu'à ce qu'elle soit capable de maintenir une position sterno-abdominale.

Le jour de l'intervention chirurgicale, placer la souris complètement sédatée sous un microscope stéréo de dissection en position dorsale et fixer les deux pattes à l’aide de ruban chirurgical. Si un tapis chauffant avec régulation de température est utilisé, fixer la sonde de température et attacher celle-ci à la base de la plateforme chirurgicale à l’aide de ruban chirurgical. Ensuite, nettoyer le site chirurgical à l’aide de trois lingettes alternées de povidone-iodée et d’alcool, puis recouvrir l’animal d’un champ opératoire stérile comportant une ouverture au niveau du site d’incision.

À l’aide d’un scalpel, effectuez une incision initiale le long du centre de la face médiale de la cuisse, de genou vers l’abdomen. Utilisez ensuite des ciseaux fins pour allonger l’incision d’environ un centimètre. À l’aide de pinces, ouvrez l’incision afin d’exposer la membrane recouvrant le tissu adipeux inguinal.

Ensuite, utilisez des pinces fermées pour percer la membrane et pénétrer l'espace situé entre le tissu adipeux et l'abdomen. Relâchez doucement la pression exercée sur les pinces afin de séparer le tissu adipeux des muscles abdominaux, mettant ainsi à nu le cordon neurovasculaire. Il est essentiel d'identifier correctement les vaisseaux sanguins principaux et leurs branches avant la dissection du cordon neurovasculaire.

Les variations dans la position des rétrécisseurs ou des sites de ligature peuvent modifier considérablement la gravité de l'ischémie et entraîner une variabilité importante des résultats. Insérer un rétracteur dans l'incision et tirer les tissus abdominaux vers la tête de l'animal afin d'exposer le site proximal du rétrécisseur ameroid, situé juste au-dessus de l'artère fémorale circonflexe latérale. Puis insérer un rétracteur médial et un rétracteur latéral dans la partie distale de l'incision pour élargir le champ opératoire, en tirant le tissu adipeux inguinal vers le pied et à l'écart du site chirurgical.

Les branches proximales et superficielles caudales de l'artère fémorale devraient être facilement visibles. L'artère circonflexe fémorale latérale se situe à environ cinq millimètres en position proximale par rapport aux branches caudales et peut être masquée par la membrane. Faites maintenant glisser délicatement l'extrémité d'une pince sous la membrane qui relie les vaisseaux afin d'insérer la moitié de l'extrémité entre la veine et l'artère.

Ensuite, fermer la pince et déchirer délicatement la membrane. Lorsque toute la membrane a été retirée, insérer la pointe de la pince fermée entre la veine et l'artère, puis relâcher la pression sur la pince afin de créer un espace entre les vaisseaux. Pour une ischémie aiguë des membres, faire glisser la pointe de la pince sous l'artère fémorale afin d'isoler le vaisseau du cordon neurovasculaire.

Utilisez une deuxième paire de forceps angulés pour saisir le bord du constricteur, et guidez le constricteur sous l'artère fémorale. Ensuite, placez l'artère dans la fente du constricteur. Puis, positionnez le constricteur distal sur l'artère fémorale immédiatement en amont du point où l'artère se divise en artères poplitée et saphène, et insérez l'artère fémorale dans la fente du constricteur.

Pour une ischémie aiguë des membres, passer un fil de suture 7-0 sous l'artère à la même position que le constricteur proximal, puis ligaturer l'artère. Ensuite, placer une deuxième ligature à environ un millimètre en aval de la première, puis sectionner l'artère entre les deux ligatures à l'aide de ciseaux à ressort. Pour la section artérielle distale, placer les ligatures à environ un millimètre l'une de l'autre, juste en amont du point de bifurcation de l'artère fémorale en artères poplitée et saphène.

Ensuite, fermer l'incision par des points séparés de suture en fil vicryl 5-0 et déplacer la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius, placé sous un imageur laser doppler de perfusion. Allumer maintenant l'appareil et lancer le logiciel de capture d'image. Cliquer sur l'icône Nouvelle Image Unique pour ouvrir la fenêtre de configuration du scanner, puis régler la taille de numérisation sur grande et la vitesse de numérisation sur quatre millisecondes par pixel.

Modifier les valeurs X et Y dans le panneau des unités de zone de balayage selon les valeurs appropriées, puis cliquer sur l'onglet Vidéo et Distance, et positionner les deux membres postérieurs dans la zone de balayage. Cliquer sur Distance automatique, puis sur Suivant pour ouvrir la fenêtre Détails du sujet, et saisir les informations concernant le sujet. Cliquer sur Suivant pour passer à la fenêtre de balayage.

Ensuite, cliquez sur le bouton Démarrer la mesure pour ouvrir la boîte de dialogue Confirmer ou remplacer la distance de numérisation, puis cliquez sur OK pour commencer le processus de numérisation. Une fois le balayage terminé, déplacez la souris vers une cage de récupération vide et surveillez-la jusqu'à ce qu'elle soit complètement remise. Outre les variations inhérentes aux études animales, d'autres facteurs peuvent introduire une variabilité dans l'imagerie laser Doppler de la perfusion, notamment la température corporelle et la position de l'animal.

Le modèle d’ischémie des membres postérieurs subaiguë dépend de la qualité des rétrécisseurs en améride, dont la qualité peut varier considérablement au sein d’un même lot. Une imagerie laser-Doppler de la perfusion doit être réalisée immédiatement après l’intervention, pendant que l’animal est encore anesthésié, afin de démontrer les effets de la chirurgie et d’établir un niveau de référence postopératoire de la perfusion. Une perte complète de la perfusion des membres postérieurs doit être observée après l’induction d’une ischémie aiguë du membre, tandis qu’une diminution seulement légère de la perfusion est généralement observée après la pose du rétrécisseur en améride dans le modèle subaigu.

Ces procédures permettent d'explorer les effets de divers degrés d'ischémie sur le remodelage vasculaire et la régénération du muscle squelettique chez la souris, en tant que modèle de la maladie artérielle périphérique humaine. Une fois maîtrisées, ces procédures peuvent être réalisées en environ 15 minutes si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de ces interventions chirurgicales, il est important de se rappeler de surveiller continuellement la température corporelle et l'adéquation de l'anesthésie chez l'animal.

En ajustant la position des ligatures ou des constrictors, il est possible de modifier la gravité de la lésion ischémique, ce qui peut constituer une variable importante selon le fond génétique de l'animal ou la présence de facteurs de risque cardiovasculaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire une ischémie des membres postérieurs chez la souris, de manière aiguë ou subaiguë, et comment définir l'anatomie vasculaire afin d'assurer un résultat adéquat et une reproductibilité de la procédure.