Génération d'un humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches

L'objectif général de cette procédure chirurgicale de greffe de cellules souches est de générer un nouveau modèle de souris chimérique dotée d'une fonction hépatique humaine, en utilisant des cellules progénitrices hépatiques immatures humaines capables de prolifération, de maturation et de différenciation afin d'acquérir le métabolisme des médicaments. Cette méthode constitue un outil puissant pour créer un microenvironnement permettant la progénèse des cellules souches hépatiques du donneur humain, leur expansion, leur différenciation et la reconstitution du foie lésé de la souris receveuse. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les cellules proliférées peuvent mûrir et que le foie se repeuple presque entièrement.

Pour commencer, préparez une solution mère de toxine diphtérique ou DT à un milligramme par millilitre en ajoutant un millilitre de solution phénolée de chlorure de sodium à 0,85 % à un milligramme de DT. Effectuez une injection intrapéritonéale de DT en maintenant une souris scid albtrek en décubitus dorsal et, en dessous du creux du genou, à gauche ou à droite de la ligne médiane, insérez l'aiguille à un angle de 45 degrés par rapport au corps. À l’aide d’une seringue à insuline, injectez 100 microlitres de DT fraîchement préparé à une concentration de 0,3 microgramme par millilitre par souris de 20 grammes. Soixante-douze heures après l’injection de DT, placez la souris dans un dispositif de contention et réchauffez la queue dans un bain d’eau à 30 degrés Celsius pendant environ 10 minutes afin de dilater les vaisseaux sanguins.

Ensuite, à deux centimètres de l'extrémité de la queue, utilisez une lame de scalpel bien aiguisée pour faire une petite incision d'un millimètre de profondeur dans la queue et recueillez le sang à l'aide d'un tube capillaire. Centrifugez le tube capillaire contenant le sang à 1500 × g pendant cinq minutes et récupérez le sérum en séparant le surnageant du culot cellulaire. Pipetez 50 microlitres d'une dilution au 1/20 du sérum sur des lames GOT ASTP3.

Ensuite, à l’aide d’un analyseur automatique multifonctionnel à chimie sèche, mesurez l’absorbance du produit réactionnel à 650 nanomètres selon le protocole du fabricant. À l’aide d’un trieur cellulaire, isolez les cellules souches hépatiques humaines à partir de cellules hépatiques fœtales primaires humaines en utilisant les antigènes cellulaires CDCP1, CD90 et CD66 afin d’obtenir une sous-population positive pour CDCP1, positive pour CD90 et négative pour CD66. Ensemencez les cellules dans des boîtes de culture codées au collagène IV et incubez à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, lavez-les une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite de la trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez à température ambiante. Lorsque les cellules apparaissent flottantes ou circulant librement au microscope, arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant huit millilitres de DMEM/F12 contenant 10 % de SBF.

Avec une pipette sérologique de 10 millilitres, suspendre lentement les cellules avant de les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 100 ×g et à 4 °C pendant cinq minutes. À l'aide de 10 millilitres de DMEM/F12 contenant 10 % de SBF, resuspendre soigneusement le culot cellulaire et utiliser un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules.

Diviser les cellules en aliquotes de un fois 10 à la puissance six cellules par 50 microlitres de PBS pour chaque souris, et conserver sur glace jusqu'à la transplantation. Après avoir anesthésié une souris selon le protocole indiqué, vérifier l'absence de réflexe en pinçant légèrement la plante du pied arrière. Ensuite, appliquer un onguent vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse.

Avec des tondeuses électriques, raser la zone chirurgicale puis appliquer de l'éthanol à 70 % et de la povidone-iodée pour désinfecter. Réaliser une incision cutanée d'un centimètre de long dans le flanc gauche, juste en dessous de la limite costale des côtes. Ensuite, pratiquer une incision dans la paroi abdominale gauche, suivie d'une incision dans le péritoine.

Ensuite, exposez soigneusement la rate. Puis, sous un angle de cinq degrés, insérez une seringue micro-injectable de 100 microlitres équipée d'une aiguille de 32 gauge d'un demi-pouce à une profondeur correspondant à la moitié de l'épaisseur de la rate et injectez directement, d'une extrémité à l'autre de l'organe, une quantité de un fois dix puissance six cellules souches hépatiques humaines dans 50 microlitres de PBS, puis retirez l'aiguille. Pour éviter toute fuite des cellules après l'injection, appliquez doucement un doigt pour exercer une pression pendant deux minutes.

Remettre la rate dans le corps de la souris et utiliser un point de suture continu normal pour la musculature et la peau afin de refermer la cavité. Transférer immédiatement la souris sur le côté dans une cage préchauffée à 37 degrés Celsius. Éviter tout contact entre la litière de la cage et le site chirurgical, et surveiller l'animal conformément au protocole décrit dans le texte.

Quatre à six semaines après la transplantation, après avoir euthanasié la souris conformément au protocole décrit, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité abdominale en coupant simultanément la peau et l'aponévrose. En utilisant les ciseaux comme écarteur, disséquez le tissu conjonctif situé au-dessus du péritoine le long de la ligne blanche afin d'ouvrir la cavité péritonéale. À l’aide d’une pince, soulevez le sternum.

Ensuite, percer le diaphragme et inciser de chaque côté du sternum jusqu'au squelette cervical. Sectionner la veine cave du côté thoracique du foie et tirer l'œsophage à travers le foie en direction antérieure. Retirer le diaphragme puis, en l'utilisant comme poignée, commencer à extraire le foie de la cavité abdominale.

La veine cave inférieure maintiendra le foie en place. Par conséquent, coupez la veine cave inférieure en prenant soin de ne pas libérer prématurément la surrénale droite. Séparez les lobes du foie les uns des autres au niveau des jonctions et incluez-les dans du OCT selon le protocole du fabricant.

Congelez l'OCT contenant le tissu hépatique dans les grilles métalliques du cryostat. À l'aide du cryostat, découpez des sections d'échantillon de cinq micromètres d'épaisseur à moins 18 degrés Celsius et montez-les sur des lames de microscope à température ambiante. Conservez le stock à moins 80 degrés Celsius.

Enfin, préparez les lames pour la coloration H&E selon les procédures précédemment décrites et pour le ELISA selon le protocole indiqué dans le texte. Comme le montrent ces coupes colorées à l'H&E, les souris traitées au DT présentaient une architecture hépatique désorganisée et une correction de la congestion accompagnée d'une augmentation de l'activité sérique de l'AST. Six semaines après la transplantation, les cellules dérivées de cellules souches hépatiques humaines ont reconstitué la structure du foie en remplaçant les hépatocytes résidents de la souris.

Macroscopiquement, quatre jours après la transplantation, de petits groupements hépatiques humains uniformément répartis autour du foie ont été détectés. À 45 jours, ces groupements s'étaient multipliés pour former de grandes agrégats. Comme on le voit ici, la présence d'hépatocytes humains dans les foies de souris a été confirmée pour la première fois six semaines après la transplantation par marquage aux anticorps dirigés contre les noyaux humains et la cytokeratine 8/18.

Les hépatocytes humains positifs pour l'ALB et négatifs pour la CK19 ressemblaient à des hépatocytes fonctionnels, tandis que les cellules doublement positives pour l'ALB et la CK19 humaines présentaient une capacité bipotente à se différencier en hépatocytes et en cholangiocytes. La présence de multiples agrégats arrondis entourant les lobes hépatiques, possédant des noyaux humains bien visibles et exprimant CK8/18, a été détectée, démontrant ainsi la capacité de formation de colonies des cellules souches hépatiques humaines dans les foies humanisés. Enfin, le taux de repopulation a atteint jusqu'à 90 % un mois après la transplantation, et la sécrétion d'albumine humaine a été détectée dans les foies de souris repopulés.

Une fois maîtrisée, la transplantation chirurgicale de cellules peut être réalisée en 10 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les lésions hépatiques doivent être limitées au foie souple. En cas de fuite cellulaire, la transplantation de cellules doit être évitée.

Associée à cette procédure, d'autres méthodes telles que la transfection génique pour la reprogrammation directe in vivo avec des cellules humaines peuvent être réalisées afin d'étudier la convergence des cellules humaines avec notre modèle actuel. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hépatologie pour explorer le métabolisme humain des médicaments, les interactions médicamenteuses, la toxicité hépatique et le virus de l'hépatite dans un modèle de foie humanisé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et d'expander la cellule souche hépatique, d'induire une lésion hépatique, et de transplanter une cellule via la rate afin de générer un modèle de souris chimérique dotée d'une fonction hépatique humaine.

N'oubliez pas que la toxine diphtérique peut être contrôlée et qu'il est important de prendre des précautions telles que l'éviction de la nécrose du cœur et du foie lors de la réalisation de cette procédure.