Name: Génération dun humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez la génération d'un foie humanisé chez la souris par transplantation de cellules souches hépatiques humaines immatures. Cette méthode permet d'étudier le métabolisme des médicaments et les maladies hépatiques.

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Nous tenons à remercier le Projet de génétique des mammifères, Institut métropolitain des sciences médicales de Tokyo, pour avoir fourni les souris. Nous remercions également S. Aoyama et Y. Adachi de l’Institut de recherche sur l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’excrétion ADME, Sekisui Medical Company Ltd., Japon, ainsi que K. Kozakai et Y. Yamada pour leur aide dans l’analyse LC-MS/MS. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT) du Japon à Y-W.Z. (18591421, 20591531 et 23591872) ; par le projet novateur et entrepreneurial du Jiangsu pour l’introduction de talents de haut niveau et le projet de planification scientifique et technologique du Jiangsu (BE2015669) ; et par des subventions à H.T. pour la promotion stratégique de la recherche et du développement innovants (S-innovation, 62890004) de l’Agence japonaise pour la science et la technologie.

Toutes les procédures expérimentales animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices de protection des animaux de l&#39;Université de Yokohama City. 1. Génération du modèle hépatique aiguë blessures souris <ol><li> Ajouter 1 ml de solution phéniqué 0,85% NaCl (0,6 g de phénol dans 100 ml d&#39;une solution de NaCl à 0,85%) à 1 mg de la toxine diphtérique (DT) pour faire un / ml DT solution mère 1 mg. Remarque: DT à une concentration de 1 mg / ml peut être stocké pendant environ 2 ans à 3 ° C à 8 ° C. </li><li> Série diluer la solution 1 mg / ml de bouillon DT à 0,3 pg / ml de DT dans phéniqué une solution de NaCl à 0,85% et de préparer une aliquote de la solution DT / ml 0,3 pg comme solution de travail. Remarque: Cette solution de travail doit être fraîchement préparée. </li><li> Pour effectuer des expériences en utilisant une dose sublétale (~ 50% de létalité), administrer les souris 8 semaines, âgé d&#39;une dose / kg de 1,5 ug de DT. <ol><li> Effectuer une injection intrapéritonéale de DT en maintenant la souris en décubitus dorsal et insérez le needle ci-dessous le pli des genoux, à gauche ou à droite de la ligne médiane. Éviter la ligne médiane pour empêcher la pénétration de la vessie. Angle l&#39;aiguille à environ 45 ° par rapport au corps. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une seringue à insuline, l&#39;injection des souris avec 100 pi de fraîchement préparée de 0,3 pg / ml DT par 20 g de poids de souris. Par exemple, une souris de 18 g doit recevoir 90 ul de la solution DT / ml 0,3 ug. </li></ol></li><li> À post-injection de DT de 48 heures, un prélèvement de sang de la veine caudale en plaçant la souris dans un dispositif de retenue et en chauffant la queue de la souris dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant environ 10 minutes pour dilater les vaisseaux sanguins. Ensuite, faire un 1 mm nick dans la queue 2 cm de la pointe avec une lame de scalpel et de recueillir le sang avec un tube microcapillaire. <ol><li> Centrifuger le tube microcapillaire contenant le sang à 1500 g pendant 5 min et recueillir le sérum en séparant le surnageant et culot cellulaire. </li></ol></li><li> Pipette 50 ul de 01h20 sérum de souris diluée sur GOT / AST-PIII glisse. Mesurer l&#39;absorbance du produit de réaction (colorant bleu) à 650 nm en utilisant un analyseur automatique de chimie sèche multi-usages selon le protocole du fabricant. NOTE: La température lue de l&#39;aspartate aminotransférase (AST) / activité transaminase glutamique oxaloacétique (GOT) est affiché automatiquement. 2 jours après l&#39;injection DT, environ 60% des souris présentait des valeurs AST entre 12.000 - 16.000 UI / L et ont été considérés comme souffrant de lésions hépatiques aiguës. Ces souris ont été transférées dans une nouvelle cage et utilisés comme receveurs de greffes de cellules. </li></ol> 2. Préparation des hépatiques humains Cellules souches <ol><li> Isoler les cellules souches hépatiques humaines à partir de cellules hépatiques primaires humaines foetales avec un trieur de cellules en utilisant les antigènes cellulaires CDCP1, CD90 et CD66 pour obtenir une sous-population CDCP1 + CD90 + CD66-, puis ensemencer la population de cellules isolées sur des boîtes de culture de collagène IV-enrobés, comme indiqué précédemment 15. Utiliser des cellules primaires fœtales hépatiques humains d&#39;un embryonâge entre les semaines 14 et 18. </li><li> Recueillir les cellules souches hépatiques humaines cultivées à 80% - 90% de confluence sur des boîtes de culture de 100 mm, aspirer le milieu de culture, laver les cellules avec 10 ml de PBS, puis retirez le PBS. Trypsiniser les cellules avec une solution de trypsine / EDTA 2 ml 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Note: Les cellules à plus de 90% de la confluence ne conviennent pas pour une transplantation de cellules depuis la différenciation cellulaire peut influencer leur capacité proliférative chez la souris. </li><li> Surveiller l&#39;état de dispersion des cellules sous un microscope. Lorsque les cellules semblent flotter librement ou coulant, arrêter la digestion enzymatique par addition de 8 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS. </li><li> Les cellules en suspension lentement à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique de 10 ml et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 100 xg et 4 ° C. </li><li> remise en suspension avec précaution le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope. </li><li>Diviser les cellules dans 1,0 x 10 6 cellules par 50 pi de PBS aliquotes pour chaque souris individuelle et de stocker sur la glace jusqu&#39;à la transplantation. </li></ol> 3. intraspléniques transplantation d&#39;hépatiques humains Cellules souches <ol><li> Placez une cage propre sur un 37 ° C coussin chauffant électrique. </li><li> Anesthésier la souris à l&#39;aide d&#39;isoflurane inhalation (1 - 1,5% (volume / volume) dans 2 litres d&#39;oxygène par minute) en le plaçant au-dessous de la buse. Vous pouvez également utiliser des tubes contenant de la gaze imbibée d&#39;isoflurane. <ol><li> Assurez-vous que la souris est anesthésiée par pincement légèrement la patte arrière. Si un réflexe est déclenchée, placez la souris en arrière dans la chambre. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. </li></ol></li><li> Raser le site chirurgical en utilisant une tondeuse électrique et d&#39;appliquer 70% (volume / volume) d&#39;éthanol et de povidone-iode à stériliser. Ensuite, faire une 1 cm incision cutanée dans le flanc gauche juste au-dessous de la frontière costal des côtes, suivie par une incisionla paroi abdominale, ainsi que le péritoine. </li><li> exposer soigneusement la rate. Utiliser une seringue de microinjection à 100 ul avec une aiguille 32 G 02/01 pouces pour injecter directement 1,0 x 10 6 cellules souches hépatiques humaines dans 50 ul de PBS dans la rate de chaque souris. Inclinez l&#39;aiguille à un angle de 5 ° pour l&#39;injection. <ol><li> Faire en sorte que la profondeur d&#39;injection est inférieure à la moitié de l&#39;épaisseur de la rate. L&#39;aiguille doit entrer dans la rate à une extrémité (la tête) et déposer les cellules à l&#39;autre extrémité (la queue). </li></ol></li><li> Pour éviter les fuites des cellules après l&#39;injection, appliquer doucement la pression avec un doigt pendant 2 minutes puis retirer l&#39;aiguille. </li><li> Placez la rate dans le corps de la souris et fermer la cavité avec une suture de fonctionnement normal pour la musculature et de la peau. </li><li> Transférer les souris dans une cage préchauffé à 37 ° C immédiatement après la transplantation. Pour assurer la souris est capable de respirer confortablement, placez la souris sur le côté dans la cage, unannuler le contact entre le lit de la cage et le site de l&#39;intervention chirurgicale. </li><li> Surveiller les souris jusqu&#39;à ce que l&#39;anesthésie se dissipe pour assurer les sutures restent fermées et les souris retour à des conditions de chirurgie pré. </li><li> Veiller à la souris sont fournis avec de l&#39;eau potable normale et de la nourriture. Au bout de 1 h, le retour de la cage dans la chambre de souris du centre de l&#39;animal et de suivre les souris quotidiennement. </li></ol> 4. Détection de transplanté hépatique humaine souches hépatocytes cellulaires dérivées dans le foie de souris Remarque: Pour les procédures suivantes, euthanasier tous les animaux à l&#39;aide d&#39;une surdose de kétamine et de xylazine suivie par dislocation cervicale. <ol><li> A 4 - 6 semaines après la transplantation, euthanasier les souris et ouvrir la cavité abdominale en coupant simultanément le derme et le fascia en utilisant des ciseaux chirurgicaux. </li><li> Disséquer le tissu conjonctif au-dessus du péritoine, en utilisant les ciseaux comme un épandeur, et couper le péritoine le long de la ligne blanche pour ouvrir le péritonéalecavité. </li><li> Soulevez le sternum avec une pince, percer le diaphragme, et couper à travers chaque côté du sternum à travers la ceinture cervicale. </li><li> Sectionner la veine cave inférieure sur la face dorsale du foie et de tirer l&#39;oesophage par le foie dans la direction antérieure. Retirer le diaphragme afin d&#39;éliminer le foie. Remarque: Veillez à garder les pointes des ciseaux étaient à la hausse afin d&#39;éviter tout dommage aux organes thoraciques dessous. Le thymus a une tendance à se cramponner de temps en temps à la face dorsale du sternum et ceci doit être soigneusement évité. </li><li> Utiliser le diaphragme comme une poignée, commencer à tirer le foie hors de la cavité abdominale. La veine cave intérieure tiendra le foie en place. Couper la veine cave intérieure; veillez à ne pas libérer prématurément le droit surrénale. Remarque: Les souris ont un foie à quatre lobes constitué d&#39;un lobe médian, lobe gauche, lobe droit et le lobe caudé. La vésicule biliaire est suspendue dans la petite bifurcationle lobe médian. </li><li> Séparer les lobes de l&#39;autre au niveau des jonctions et les incorporer dans la température optimale de coupe (OCT) Composé selon le protocole du fabricant. Congeler les PTOM contenant le tissu hépatique dans les grilles métalliques sur le cryostat. </li><li> Couper des échantillons de sections 5 um d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un cryostat à -18 ° C et les monter sur des lames de microscope RT. Conserver le stock à -80 ° C. Préparer les lames de l&#39; hématoxyline et de l&#39; éosine (H &amp; E) et coloration par immunofluorescence selon des procédés rapportés précédemment 16. </li></ol> 5. Détection de Human Albumine Sécrétion et calcul du taux chimériques <ol><li> Pour mesurer la reconstitution du foie humain, effectuer l&#39;albumine humaine ELISA en utilisant du sérum et un kit ELISA humain d&#39;albumine selon les instructions du fabricant. </li><li> Calculer le taux chimérique du foie humanisé par analyse en temps réel PCR des niveaux d&#39;expression dans l&#39;ensemble-humanisé foie. Déterminer l&#39;ex relatifpressure ratio de niveau d&#39;actine humain spécifique à l&#39;humain-souris de croix actine (rapport 1) et le rapport de l&#39;actine de la souris spécifique à l&#39;humain-souris de croix actine (rapport de 2). Le taux chimérique est calculé comme le rapport 1 / (rapport 1 + rapport 2). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.

Des études récentes ont montré que le foie de souris peut être repeuplée avec des hépatocytes humains, y compris les hépatocytes adultes et des cellules souches hépatiques proliferatives 17. Ces foies repeuplés ont été utilisés comme modèles expérimentaux précliniques pour les tests de métabolisme des médicaments et de la découverte et le développement 18 médicaments; en outre, ils ont fourni un environnement in vivo pour la maturation et la différenciation cellulaire 19. L&#39;...

Les souris sont couramment utilisées pour les tests pharmaceutiques car la recherche biomédicale chez l’homme est limitée1 ; cependant, ces modèles ne sont pas toujours utiles car ils peuvent simuler de manière inexacte les effets observés chez l’homme. La plupart des médicaments actuellement utilisés à des fins médicales sont métabolisés principalement dans le foie. Cependant, le même médicament peut être métabolisé en différents métabolites dans le foie de souris et d’homme en raison de différences inter-espèces. Ainsi, il est souvent difficile de déterminer au cours du développement si un médicament potentiel présente des risques pour des applications cliniques2,3. 
Pour résoudre ce problème, des foies de souris « humanisés » ont été développés en cultivant des cellules hépatiques humaines à l’intérieur de souris4 à 6 ; ces modèles présentent des réponses médicamenteuses similaires à celles observées dans le foie humain. Les principaux modèles de souris actuellement utilisés pour la génération humanisée du foie comprennent les souris4,7 activateurs d’uroplasminogène (uPA+/+), les souris 6 de l’hydrolase de fumarylacétoacétate (Fah−/−) et les souris thymidine kinase (TK-NOG) récemment signalées. 
Cependant, des rapports antérieurs ont montré que les cellules immatures humaines transplantées ou les cellules souches sont moins compétitives que les hépatocytes humains adultes dans les foies de souris Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. De plus, les souris Fah−/− n’offrent un avantage de croissance que pour les hépatocytes différenciés et non pour les cellules progénitrices hépatiques immatures11. La transplantation en laboratoire de cellules souches hépatiques humaines (HpSC) chez des souris TK-NOG n’a pas abouti. Par conséquent, il n’existe actuellement aucun modèle murin utile pour la greffe efficace de cellules hépatiques humaines immatures. 
Ainsi, nous avons développé un nouveau modèle de souris Alb-TRECK/SCID qui pourrait être efficacement repeuplé avec des hépatocytes humains immatures. Ce modèle de souris transgénique exprime les récepteurs humains du facteur de croissance de type EGF (HB-EGF) liés à l’héparine sous le contrôle d’un promoteur d’albumine spécifique aux cellules hépatiques. Suite à l’administration de toxine diphtérique (DT), ces souris développent une hépatite fulminante due à l’ablation conditionnelle des hépatocytes, permettant la résidence et la prolifération des cellules du donneur12. Bien que des hépatocytes de souris aient été transplantés avec succès chez des souris Alb-TRECK/SCID dans des études antérieures13,14, la génération d’un foie humanisé à l’aide de souris Alb-TRECK/SCID n’a pas encore été rapportée. 
Dans cette étude, des foies humanisés ont été générés chez des souris Alb-TRECK/SCID par transplantation de HpSCs. Ce foie humanisé fournit un environnement in vivo pour la différenciation universelle des cellules souches et la capacité de prédire les modèles de métabolisme des médicaments humains et les interactions médicamenteuses.

<table><tbody><tr><td>Albumine humaine</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Souris</td></tr><tr><td>Humaine CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Souris</td></tr><tr><td>Noyaux humains</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Souris</td></tr><tr><td>Humaine CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Cochon d’Inde</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Souris</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>559869</td><td>Souris</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>551479</td><td>souris</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Toxine diphtérique</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA d’albumine humaine</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Seringue (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G 1/2" aiguille</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound (118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules à grande vitesse MoFlo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d&#39;un humanisée foie de souris utilisation hépatique humaine cellules souches

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Un nouveau modèle animal impliquant des souris chimères avec des foies humanisés établis par transplantation d’hépatocytes humains a été développé. Ces souris, chez lesquelles le foie a été repeuplé avec des hépatocytes humains fonctionnels, pourraient servir d’outil utile pour étudier la biologie des cellules hépatiques humaines, le métabolisme des médicaments et d’autres applications précliniques. L’un des facteurs clés nécessaires à la réussite de la transplantation d’hépatocytes humains chez la souris est l’élimination des hépatocytes endogènes afin d’empêcher la compétition avec les cellules humaines et de fournir un espace et un microenvironnement appropriés pour favoriser l’expansion et la différenciation des cellules de donneurs humains. À ce jour, deux principaux modèles de souris ayant subi des lésions hépatiques utilisant l’hydrolase de fumarylacétoacétate (Fah) et l’activateur de l’uroplasminogène (uPA) ont été établis. Cependant, les souris Fah sont principalement utilisées avec des hépatocytes matures et l’application du modèle uPA est limitée par une reproduction réduite. Pour surmonter ces limitations, des souris TRECK (TRECK)/SCID ont été utilisées pour la différenciation in vivo d’hépatocytes humains immatures et la génération hépatique humanisée. Les cellules souches hépatiques humaines (HpSC) ont repeuplé avec succès le foie de souris Alb-TRECK/SCID qui avaient développé une insuffisance hépatique fulminante mortelle après un traitement à la toxine diphtérique (DT). Ce modèle de foie humanisé chez la souris Alb-TRECK/SCID aura des applications fonctionnelles dans des études impliquant le métabolisme des médicaments et les interactions médicamenteuses et favorisera d’autres études in vivo et in vitro.

Alb-Treck / SCID hépatocytes de souris expriment le récepteur DT gène humain HB-EGF sous le contrôle d&#39;un promoteur de l&#39; albumine et présentent des effets cytotoxiques après l&#39; administration de DT 12. Pour évaluer les effets du traitement DT sur les lésions du foie, des doses DT de 1,5 ug / kg ont été injectées dans des souris SCID 8 semaines vieux Alb-Treck / et les changements pathologiques dans l&#39;h après administration du foie 48 DT ont été histologiquemen...

Ici, nous présentons un nouveau modèle de foie de souris humanisé généré chez des souris TRECK)/SCID après la transplantation de cellules hépatiques humaines immatures et expansibles.

Génération d&#39;un humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

L'objectif général de cette procédure chirurgicale de greffe de cellules souches est de générer un nouveau modèle de souris chimérique dotée d'une fonction hépatique humaine, en utilisant des cellules progénitrices hépatiques immatures humaines capables de prolifération, de maturation et de différenciation afin d'acquérir le métabolisme des médicaments. Cette méthode constitue un outil puissant pour créer un microenvironnement permettant la progénèse des cellules souches hépatiques du donneur humain, leur expansion, leur différenciation et la reconstitution du foie lésé de la souris receveuse. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les cellules proliférées peuvent mûrir et que le foie se repeuple presque entièrement.Pour commencer, préparez une solution mère de toxine diphtérique ou DT à un milligramme par millilitre en ajoutant un millilitre de solution phénolée de chlorure de sodium à 0,85 % à un milligramme de DT. Effectuez une injection intrapéritonéale de DT en maintenant une souris scid albtrek en décubitus dorsal et, en dessous du creux du genou, à gauche ou à droite de la ligne médiane, insérez l'aiguille à un angle de 45 degrés par rapport au corps. À l’aide d’une seringue à insuline, injectez 100 microlitres de DT fraîchement préparé à une concentration de 0,3 microgramme par millilitre par souris de 20 grammes. Soixante-douze heures après l’injection de DT, placez la souris dans un dispositif de contention et réchauffez la queue dans un bain d’eau à 30 degrés Celsius pendant environ 10 minutes afin de dilater les vaisseaux sanguins.Ensuite, à deux centimètres de l'extrémité de la queue, utilisez une lame de scalpel bien aiguisée pour faire une petite incision d'un millimètre de profondeur dans la queue et recueillez le sang à l'aide d'un tube capillaire. Centrifugez le tube capillaire contenant le sang à 1500 × g pendant cinq minutes et récupérez le sérum en séparant le surnageant du culot cellulaire. Pipetez 50 microlitres d'une dilution au 1/20 du sérum sur des lames GOT ASTP3.Ensuite, à l’aide d’un analyseur automatique multifonctionnel à chimie sèche, mesurez l’absorbance du produit réactionnel à 650 nanomètres selon le protocole du fabricant. À l’aide d’un trieur cellulaire, isolez les cellules souches hépatiques humaines à partir de cellules hépatiques fœtales primaires humaines en utilisant les antigènes cellulaires CDCP1, CD90 et CD66 afin d’obtenir une sous-population positive pour CDCP1, positive pour CD90 et négative pour CD66. Ensemencez les cellules dans des boîtes de culture codées au collagène IV et incubez à 37 degrés Celsius.Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, lavez-les une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite de la trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez à température ambiante. Lorsque les cellules apparaissent flottantes ou circulant librement au microscope, arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant huit millilitres de DMEM/F12 contenant 10 % de SBF.Avec une pipette sérologique de 10 millilitres, suspendre lentement les cellules avant de les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 100 ×g et à 4 °C pendant cinq minutes. À l'aide de 10 millilitres de DMEM/F12 contenant 10 % de SBF, resuspendre soigneusement le culot cellulaire et utiliser un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules.Diviser les cellules en aliquotes de un fois 10 à la puissance six cellules par 50 microlitres de PBS pour chaque souris, et conserver sur glace jusqu'à la transplantation. Après avoir anesthésié une souris selon le protocole indiqué, vérifier l'absence de réflexe en pinçant légèrement la plante du pied arrière. Ensuite, appliquer un onguent vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse.Avec des tondeuses électriques, raser la zone chirurgicale puis appliquer de l'éthanol à 70 % et de la povidone-iodée pour désinfecter. Réaliser une incision cutanée d'un centimètre de long dans le flanc gauche, juste en dessous de la limite costale des côtes. Ensuite, pratiquer une incision dans la paroi abdominale gauche, suivie d'une incision dans le péritoine.Ensuite, exposez soigneusement la rate. Puis, sous un angle de cinq degrés, insérez une seringue micro-injectable de 100 microlitres équipée d'une aiguille de 32 gauge d'un demi-pouce à une profondeur correspondant à la moitié de l'épaisseur de la rate et injectez directement, d'une extrémité à l'autre de l'organe, une quantité de un fois dix puissance six cellules souches hépatiques humaines dans 50 microlitres de PBS, puis retirez l'aiguille. Pour éviter toute fuite des cellules après l'injection, appliquez doucement un doigt pour exercer une pression pendant deux minutes.Remettre la rate dans le corps de la souris et utiliser un point de suture continu normal pour la musculature et la peau afin de refermer la cavité. Transférer immédiatement la souris sur le côté dans une cage préchauffée à 37 degrés Celsius. Éviter tout contact entre la litière de la cage et le site chirurgical, et surveiller l'animal conformément au protocole décrit dans le texte.Quatre à six semaines après la transplantation, après avoir euthanasié la souris conformément au protocole décrit, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité abdominale en coupant simultanément la peau et l'aponévrose. En utilisant les ciseaux comme écarteur, disséquez le tissu conjonctif situé au-dessus du péritoine le long de la ligne blanche afin d'ouvrir la cavité péritonéale. À l’aide d’une pince, soulevez le sternum.Ensuite, percer le diaphragme et inciser de chaque côté du sternum jusqu'au squelette cervical. Sectionner la veine cave du côté thoracique du foie et tirer l'œsophage à travers le foie en direction antérieure. Retirer le diaphragme puis, en l'utilisant comme poignée, commencer à extraire le foie de la cavité abdominale.La veine cave inférieure maintiendra le foie en place. Par conséquent, coupez la veine cave inférieure en prenant soin de ne pas libérer prématurément la surrénale droite. Séparez les lobes du foie les uns des autres au niveau des jonctions et incluez-les dans du OCT selon le protocole du fabricant.Congelez l'OCT contenant le tissu hépatique dans les grilles métalliques du cryostat. À l'aide du cryostat, découpez des sections d'échantillon de cinq micromètres d'épaisseur à moins 18 degrés Celsius et montez-les sur des lames de microscope à température ambiante. Conservez le stock à moins 80 degrés Celsius.Enfin, préparez les lames pour la coloration H&E selon les procédures précédemment décrites et pour le ELISA selon le protocole indiqué dans le texte. Comme le montrent ces coupes colorées à l'H&E, les souris traitées au DT présentaient une architecture hépatique désorganisée et une correction de la congestion accompagnée d'une augmentation de l'activité sérique de l'AST. Six semaines après la transplantation, les cellules dérivées de cellules souches hépatiques humaines ont reconstitué la structure du foie en remplaçant les hépatocytes résidents de la souris.Macroscopiquement, quatre jours après la transplantation, de petits groupements hépatiques humains uniformément répartis autour du foie ont été détectés. À 45 jours, ces groupements s'étaient multipliés pour former de grandes agrégats. Comme on le voit ici, la présence d'hépatocytes humains dans les foies de souris a été confirmée pour la première fois six semaines après la transplantation par marquage aux anticorps dirigés contre les noyaux humains et la cytokeratine 8/18.Les hépatocytes humains positifs pour l'ALB et négatifs pour la CK19 ressemblaient à des hépatocytes fonctionnels, tandis que les cellules doublement positives pour l'ALB et la CK19 humaines présentaient une capacité bipotente à se différencier en hépatocytes et en cholangiocytes. La présence de multiples agrégats arrondis entourant les lobes hépatiques, possédant des noyaux humains bien visibles et exprimant CK8/18, a été détectée, démontrant ainsi la capacité de formation de colonies des cellules souches hépatiques humaines dans les foies humanisés. Enfin, le taux de repopulation a atteint jusqu'à 90 % un mois après la transplantation, et la sécrétion d'albumine humaine a été détectée dans les foies de souris repopulés.Une fois maîtrisée, la transplantation chirurgicale de cellules peut être réalisée en 10 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les lésions hépatiques doivent être limitées au foie souple. En cas de fuite cellulaire, la transplantation de cellules doit être évitée.Associée à cette procédure, d'autres méthodes telles que la transfection génique pour la reprogrammation directe in vivo avec des cellules humaines peuvent être réalisées afin d'étudier la convergence des cellules humaines avec notre modèle actuel. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hépatologie pour explorer le métabolisme humain des médicaments, les interactions médicamenteuses, la toxicité hépatique et le virus de l'hépatite dans un modèle de foie humanisé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et d'expander la cellule souche hépatique, d'induire une lésion hépatique, et de transplanter une cellule via la rate afin de générer un modèle de souris chimérique dotée d'une fonction hépatique humaine.N'oubliez pas que la toxine diphtérique peut être contrôlée et qu'il est important de prendre des précautions telles que l'éviction de la nécrose du cœur et du foie lors de la réalisation de cette procédure.

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