Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

L'objectif général de cette méthode est de générer des embryons de poisson-zèbre parabiotiques, qui peuvent être utilisés pour étudier les fonctions intrinsèques aux cellules par rapport aux fonctions extrinsèques aux cellules pour des gènes candidats d'intérêt. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'autonomie cellulaire. Par exemple, dans le système hématopoïétique, les défauts vitaux de la migration des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont-ils intrinsèques aux CSH ou à l'environnement niche microenvironnemental ?

Le principal avantage de ce protocole réside dans une capacité améliorée de générer avec succès des embryons de poisson zèbre parabiotiques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car les embryons en développement sont extrêmement fragiles et peuvent facilement être endommagés. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, puisque les étapes de suture chirurgicale peuvent être difficiles à apprendre, nécessitant un haut degré de précision et d'exactitude.

Ici, nous fournissons des instructions étape par étape pour générer des embryons de poisson zèbre parabiotiques par fusion chirurgicale de blastulas en développement. Cette méthode montre comment augmenter l'efficacité des fusions parabiotiques et améliorer la survie des embryons conjoints. Après avoir préparé les réactifs et les outils conformément au protocole écrit, préparez deux à trois pipettes Pasteur modifiées en chauffant brièvement l'extrémité de la pipette au-dessus d'un bec Bunsen.

Ensuite, à l’aide de grosses pinces, plier l’extrémité de la pipette d’environ 45 degrés pendant qu’elle est encore chaude. Pour s’assurer qu’il n’y ait pas d’arêtes vives pouvant endommager les embryons, maintenir l’extrémité de la pipette au-dessus d’un bec Bunsen pendant une à deux secondes. À l’aide d’ADN plasmatique, d’ARNm ou de morpholino, micro-injecter les embryons dans l’heure suivant leur collecte, puis les laisser se développer jusqu’au stade 256 cellules.

Lorsque les embryons atteignent le stade proche de 256 cellules, transférez chaque lignée génétique dans des boîtes de Pétri ou des béchers en verre sans rayures recouverts d'agarose, séparément. Après avoir déchorioné les embryons conformément au protocole décrit, décongelez la méthylcellulose préparée au préalable et utilisez une centrifugeuse de table à vitesse maximale pour former un culot des cristaux non dissous, qui pourraient endommager les embryons ou rompre les vitellus. Pendant ce temps, à l’aide d’un marqueur, indiquez de 12 à 15 emplacements prédéterminés sur la face inférieure d’une boîte de Pétri de 100 millilitres recouverte d’agarose.

Ensuite, après centrifugation, en utilisant la fraction supérieure claire de la méthylcellulose, transférez des gouttes d'un à 1,5 centimètre dans les emplacements marqués de la boîte de Pétri. Préparez ensuite un aliquot de 40 millilitres de solution de Ringer riche en calcium, ou solution HCR, par boîte recouverte d'agarose préparée précédemment. À chaque aliquot, ajoutez les antibiotiques indiqués ici.

Lorsque vous êtes prêt à effectuer les fusions de blastula, utilisez les aliquotes de HCR avec des antibiotiques pour remplir soigneusement chaque boîtier contenant les gouttelettes de méthylcellulose, en prenant soin de ne pas perturber les gouttelettes. Fixez une pipette Pasteur en verre modifiée, préparée précédemment, à une pompe à pipette de 10 millilitres. Ensuite, sous un stéréomicroscope, récupérez un embryon déchorioné de chaque lignée génétique.

Avant de distribuer les deux embryons, utilisez la pipette Pasteur pour créer une petite dépression au centre de la goutte de méthylcellulose. Ensuite, déposez les deux embryons dans la dépression. Maintenant, à l’aide d’une aiguille de dissociation munie d’une pointe de chargement de gel, effectuez de légers mouvements de balayage sans toucher directement les embryons afin de repositionner soigneusement ces derniers dans la méthylcellulose, de manière à ce que leurs pôles animaux soient en contact direct l’un avec l’autre.

L'orientation adéquate des embryons en développement détermine la manière dont ils fusionneront et se développeront. Pour les fusions tête-bêche, veillez à ce que chaque fusion soit alignée au niveau de leurs pôles animaux. Laissez les embryons reposer pendant cinq minutes afin que la méthylcellulose se dépose autour d'eux.

Pendant ce temps, chargez la paire suivante dans une autre goutte. Pour réaliser la chirurgie, utilisez l'outil d'aiguille en verre afin de blesser délicatement chaque embryon au niveau de leur point de contact. Ensuite, à l'aide d'un mouvement de couture doux, tirez les cellules du premier embryon vers le second, puis ramenez-les à nouveau dans le premier.

À la fin du mouvement, maintenir l’aiguille en place pendant deux à trois secondes avant de la retirer très lentement. La précision dans l’utilisation de l’aiguille en verre est essentielle pour garantir que les embryons soient correctement suturés. Il faut faire attention à ne pas endommager les sacs vitellins tout en conservant une connexion suffisante pour une fusion réussie.

Laisser les embryons reposer 10 à 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, assembler d'autres paires d'embryons. Après l'incubation, vérifier si les embryons sont restés attachés et répéter l'étape de blessure si nécessaire.

Incuber les embryons dans la même boîte et le même milieu à 28,5 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, les embryons se seront extraits de la méthylcellulose, qui sera en grande partie dissoute. Retirer les embryons qui ne se sont pas correctement fusionnés.

Ensuite, décantez le milieu et utilisez 25 millilitres d'E3 pour le remplacer. Pour obtenir des images des embryons fusionnés, préparez de l'agarose à bas point de fusion à 0,8 %. Tandis qu'elle est encore chaude, répartissez 1 millilitre d'agarose en aliquotes dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre placés dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius.

Anesthésiez les embryons parabiotiques en ajoutant un millilitre de tricaïne à quatre milligrammes par millilitre, pH 7,0, au milieu E3 de 25 millilitres contenant les embryons. Faites tourner doucement la boîte afin que les embryons s'accumulent au centre. Ensuite, à l’aide d’une pipette plastique de transfert à embout large, aspirez les embryons avec le moins de liquide possible.

Ensuite, placez la pipette à la verticale et faites doucement rebondir les embryons afin qu'ils s'accumulent tout au fond de la pipette. Puis, transférez les embryons dans un aliquot de 1 millilitre d'agarose à bas point de fusion en effleurant légèrement la surface de l'agarose avec la pointe de la pipette. Éliminez tout excès de liquide présent dans la pipette, puis utilisez la pipette pour mélanger délicatement les embryons dans l'agarose.

Ensuite, à l’aide de la pipette, transférer l’agarose et les embryons dans la cavité d’une plaque à six puits avec fond en verre. Sous un stéréomicroscope, utiliser une pointe de chargement de gel fixée à l’extrémité d’une aiguille de dissection pour positionner les embryons près du verre de couverture et dans l’orientation souhaitée pour l’imagerie. Une fois que l’agarose a durci et que le milieu contenant la tricaine a été ajouté dans les puits, utiliser un microscope confocal à balayage laser à épifluorescence grand champ inversé, ou un microscope confocal à disque tournant, pour acquérir les images.

Pour un champ de vision d'embryon entier, utilisez un objectif 4X. Utilisez un objectif 20X pour imager un tissu spécifique. Traitez les images conformément au protocole écrit.

Comme illustré ici, après avoir orienté deux blastules avec leurs pôles animaux face à face, les embryons ont été soigneusement blessés au point de contact. Un degré plus élevé de lésion augmentait la probabilité que les embryons conservent une connexion menant à une fusion réussie, sans défauts morphologiques supplémentaires ni développement retardé. Comme le montre cette figure, en orientant les deux blastules de manière à ce que leurs pôles animaux soient parfaitement alignés, des fusions fiables tête contre tête ou sac vitellin contre sac vitellin ont été obtenues, avec une circulation partagée.

Dans la plupart des cas, les embryons présentaient deux cœurs pompant une circulation commune. Afin de confirmer que les embryons partageaient effectivement leur circulation, des embryons transgéniques ayant des érythrocytes positifs pour la GFP ont été fusionnés avec des embryons possédant des cellules endothéliales vasculaires positives pour le mCherry. Comme on peut le voir dans ce film, 48 heures après la fécondation, des érythrocytes positifs pour la GFP ont été observés en circulation à travers l'embryon partenaire Flik 1 HRAS mCherry.

Enfin, afin d'étudier le contrôle temporel de l'expression génique, l'un des deux embryons a été injecté avec un ADN construct hsp70 EGFP. Après un bref choc thermique de 30 minutes à 37 degrés Celsius, un signal GFP net a été observé dans l'un des embryons, et dans certains cas, des cellules positives pour la GFP ont été vues circuler dans l'embryon partenaire non injecté. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire preuve de prudence lors de la suture des deux blastulas, et de réitérer les fusions si la chirurgie n’a pas réussi du premier coup. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'imagerie de cellules vivantes, peuvent être utilisées pour répondre à d'autres questions, par exemple si les CSH de type sauvage peuvent fonctionner normalement dans un compartiment mutant, ou inversement, si les CSH mutantes peuvent fonctionner dans un compartiment de type sauvage. Cette technique offre une méthode puissante aux chercheurs du domaine de l'hématologie pour étudier la régulation du développement sanguin chez le poisson-zèbre.

N'oubliez pas que la tricaine peut être dangereuse et que des précautions, telles que le port d'une tenue de sécurité appropriée, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure. Après avoir visionné cette vidéo et suivi nos techniques recommandées, nous espérons que vous serez en mesure de produire des embryons de zebrafish biotiques de meilleure qualité avec un taux de réussite accru.