Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

L’objectif global de cette méthode est de générer des embryons de poisson-zèbre parabiotique, qui peuvent être utilisés pour étudier les fonctions intrinsèques des cellules par rapport aux fonctions extrinsèques des cellules pour les gènes candidats d’intérêt. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’autonomie cellulaire. Par exemple, dans le système hématopoïétique, les défauts vitaux dans la migration des CSH sont intrinsèques aux CSH ou au microenvironnement de niche.

Le principal avantage de ce protocole est une meilleure capacité à générer avec succès des embryons de poisson-zèbre parabiotique. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car les embryons en développement sont extrêmement fragiles et facilement endommagés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de couture chirurgicale peuvent être difficiles à apprendre car elles nécessitent un haut degré d’exactitude et de précision.

Ici, nous fournissons des instructions étape par étape pour générer des embryons de poisson-zèbre parabiotique par fusion chirurgicale de blastules en développement. Cette méthode démontre comment augmenter l’efficacité des fusions parabiotiques et améliorer la survie des embryons siamois. Après avoir préparé les réactifs et les outils conformément au protocole textuel, préparez deux à trois pipettes Pasteur modifiées en chauffant brièvement l’extrémité de la pipette sur un bec Bunsen.

Ensuite, à l’aide d’une grande pince, pendant qu’il est encore chaud, pliez l’extrémité de la pipette d’environ 45 degrés. Pour vous assurer qu’il n’y a pas d’arêtes vives qui pourraient endommager les embryons, maintenez l’extrémité de la pipette au-dessus d’un bec Bunsen pendant une à deux secondes. À l’aide d’ADN plasmatique, d’ARNm ou de morpholino, micro-injectez des embryons dans l’heure qui suit le prélèvement et laissez-les se développer jusqu’au stade de 256 cellules.

Au fur et à mesure que les embryons approchent du stade de 256 cellules, transférez chaque patrimoine génétique dans des boîtes séparées enrobées d’agarose, des béchers en verre sans rayures ou des boîtes de Pétri. Après avoir déchiffonné les embryons conformément au protocole de texte, décongelez la méthylcellulose préalablement préparée et utilisez une centrifugeuse de table à vitesse maximale pour granuler les cristaux non dissous, ce qui endommagera les embryons ou rompra les jaunes. Pendant ce temps, à l’aide d’un marqueur, marquez 12 à 15 points prédéterminés sur la face inférieure d’une boîte de Pétri enrobée d’agarose de 100 millilitres.

Ensuite, après centrifugation, en utilisant la fraction supérieure claire de la méthylcellulose, transférez une goutte à 1,5 centimètre dans les points marqués de la boîte de Pétri. Ensuite, préparez une aliquote de 40 millilitres de sonnerie à haute teneur en calcium, ou solution HCR par plat enrobé d’agarose juste préparé. À chaque aliquote, ajoutez les antibiotiques indiqués ici.

Lorsque vous êtes prêt à effectuer des fusions de blastula, utilisez les aliquotes de HCR avec des antibiotiques pour remplir soigneusement chaque plat contenant les gouttelettes de méthylcellulose, en prenant soin de ne pas perturber les gouttelettes. Fixez une pipette Pasteur en verre modifiée préparée plus tôt à une pompe à pipette de 10 millilitres. Ensuite, sous un stéréoscope, prélevez un embryon déchorionné de chaque fond.

Avant de distribuer les deux embryons, utilisez la pipette Pasteur pour faire une petite dépression au milieu de la goutte de méthylcellulose. Ensuite, déposez les deux embryons dans la dépression. Maintenant, à l’aide d’une aiguille à taquiner avec une pointe de chargement de gel à l’extrémité, utilisez de légers mouvements de balayage sans toucher directement les embryons pour repositionner soigneusement les embryons dans la méthylcellulose, de sorte que leurs pôles animaux se touchent directement.

L’orientation correcte des embryons en développement dicte la façon dont les embryons vont fusionner et se développer. Pour les fusions en tête-à-tête, assurez-vous que chaque fusion est alignée au niveau de leurs pôles d’animaux. Laissez les embryons reposer pendant cinq minutes pour que la méthylcellulose s’installe autour d’eux.

Pendant ce temps, chargez la paire suivante dans une autre goutte. Pour effectuer la chirurgie, à l’aide de l’aiguille de verre, enroulez soigneusement chaque embryon à son point de contact. Ensuite, avec un léger mouvement de couture, tirez les cellules du premier embryon vers le deuxième embryon et vice-versa.

À la fin du mouvement, maintenez l’aiguille en place pendant deux à trois secondes avant de la retirer très lentement. La précision de l’aiguille de verre est essentielle pour s’assurer que les embryons sont correctement cousus ensemble. Il faut veiller à ne pas endommager les sacs vitellins tout en maintenant une connexion suffisante pour une fusion réussie.

Laissez les embryons reposer pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, cousez des paires supplémentaires d’embryons. Après l’incubation, évaluez si les embryons sont restés attachés et répétez l’étape de blessure si nécessaire.

Incuber les embryons dans le même plat et le même milieu à 28,5 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, les embryons seront sortis de la méthylcellulose principalement dissoute. Retirez tous les embryons qui n’ont pas fusionné avec succès.

Ensuite, décantez le milieu et utilisez 25 millilitres d’E3 pour le remplacer. Pour acquérir des images des embryons fusionnés, préparez de l’agarose à 0,8 % à bas point de fusion. Alors qu’il est encore chaud, aliquote 1 millilitre d’agarose dans des tubes microfuges de 1,5 millilitre placés dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius.

Anesthésiez les embryons parabiotiques en ajoutant un millilitre de quatre milligrammes par millilitre de tricaïne pH 7,0 aux 25 millilitres de milieu E3 contenant les embryons. Tournez doucement le plat pour que les embryons s’accumulent au milieu. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique à pointe large, aspirez les embryons dans le moins de liquide possible.

Ensuite, tournez la pipette à la verticale et faites rebondir doucement les embryons pour qu’ils se déposent tout au fond de la pipette. Ensuite, transférez les embryons dans une aliquote de 1 millilitre d’agarose à bas point de fusion en touchant légèrement la pointe de la pipette sur la surface de l’agarose. Éliminez tout excès de liquide de la pipette et utilisez la pipette pour mélanger délicatement les embryons dans l’agarose.

Ensuite, à l’aide de la pipette, transférez l’agarose et les embryons dans le puits d’une plaque à six puits à fond de verre. Sous un stéréomicroscope, à l’aide d’une pointe de chargement de gel fixée à l’extrémité d’une aiguille de taquinage, positionner les embryons près du verre de protection et dans l’orientation souhaitée pour l’imagerie. Une fois que l’agarose a pris et qu’un milieu contenant de la tricaïne a été ajouté aux puits, utilisez un microscope confocal à balayage laser à épifluorescence à champ large inversé ou un microscope confocal à disque rotatif pour acquérir des images.

Pour un champ de vision de l’embryon entier, utilisez un objectif 4X. Utilisez un objectif 20X pour imager un tissu spécifique. Traitez les images selon le protocole texte.

Comme on le voit ici, après avoir orienté deux blastules avec leurs pôles d’animaux face à face, les embryons ont été soigneusement blessés à leur point de contact. Un degré plus élevé de blessure augmentait la probabilité que les embryons maintiennent une connexion qui a abouti à une fusion réussie sans défauts morphologiques supplémentaires ni retard de développement. Comme le montre cette figure, en orientant les deux blastula avec leurs pôles d’animaux directement alignés, des fusions fiables de tête à tête ou de sac vitellin à sac vitellin ont été générées avec une circulation partagée.

Dans la plupart des cas, les embryons avaient deux cœurs pompant une circulation commune partagée. Pour confirmer que les embryons partageaient bien leur circulation, des embryons transgéniques fusionnés qui avaient des érythrocytes positifs à la GFP ont été fusionnés à des embryons qui avaient des cellules endothéliales vasculaires mCherry-positives. Comme on le voit dans ce film, 48 heures après la fécondation, des érythrocytes positifs à la GFP ont été observés circulant dans l’embryon du partenaire Flik 1 HRAS mCherry.

Enfin, pour étudier le contrôle temporel de l’expression génique, l’un des deux embryons a été injecté avec une construction d’ADN hsp70 EGFP. Après un bref choc thermique de 30 minutes à 37 degrés Celsius, un signal GFP clair a été établi dans l’un des embryons et, dans certains cas, des cellules positives à la GFP ont circulé dans l’embryon du partenaire non injecté. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être prudent lorsque vous cousez les deux blastules ensemble et de revoir les fusions si la chirurgie n’a pas réussi à la première tentative. À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que l’imagerie de cellules vivantes peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme si les CSH de type sauvage peuvent fonctionner normalement dans une niche mutante ou, à l’inverse, si les CSH mutantes peuvent fonctionner dans une niche de type sauvage. Cette technique fournit une méthode puissante aux chercheurs dans le domaine de l’hématologie pour étudier la régulation du développement du sang chez le poisson zèbre.

N’oubliez pas que les tricaïnces peuvent être dangereuses et que des précautions telles que le port d’une tenue de sécurité appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Après avoir regardé cette vidéo et suivi nos techniques recommandées, nous espérons que vous serez en mesure de générer de meilleurs embryons de poisson-zèbre biotique avec plus de succès.