Name: Un dosage cellulaire sans laide Xenopus laevis Embryo Extraits détudier les mécanismes de règlement des tailles nucléaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Découvrez un dosage cellulaire innovant pour étudier la régulation de la taille nucléaire en utilisant des extraits d'embryons de Xenopus laevis. Cette méthode permet de manipuler facilement la composition des extraits acellulaires.

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Les membres des laboratoires Levy et Gatlin ainsi que leurs collègues du Département de biologie moléculaire ont offert des conseils et des discussions utiles. Rebecca Heald a apporté son soutien aux premières étapes de l’élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par le NIH/NIGMS (R15GM106318) et l’American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

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<li>Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+mechanisms+and+functions+of+nuclear+size+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).</li>
<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+scaling+during+Xenopus+early+development+contributes+to+midblastula+transition+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing.</a> Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).</li>
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<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+size+regulation+in+model+systems+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).</li>
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<li>Cross, M. K., Powers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+about+cancer+from+frogs%3A+analysis+of+mitotic+spindles+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts.</a> Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).</li>
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<li>Goehring, N. W., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+growth+control+through+limiting+pools+of+cytoplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components.</a> Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).</li>
<li>Du Toit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%3A+Honey%2C+I+shrunk+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development: Honey, I shrunk the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633(2014).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Voici une nouvelle méthode pour étudier les mécanismes de régulation de la taille nucléaire au cours du développement de X. laevis . La progression du développement est associée à des changements spectaculaires dans la physiologie cellulaire, le métabolisme, les taux de division et la migration, ainsi qu’à des modifications de la taille des cellules et des structures intracellulaires. Ces processus variés sont complexes et essentiels, il est donc difficile d’étudier un seul de ces aspects du développement dans u...

Les tailles des organites cellulaires échelle , en général avec la taille de la cellule, ce qui a été peut - être mieux documenté pour la mise à l&#39; échelle de la taille nucléaire avec la taille des cellules 10/01. Cela est particulièrement vrai lors de l&#39; embryogenèse et la différenciation cellulaire, lorsque des réductions spectaculaires dans les deux cellules et la taille nucléaire sont souvent observées 11,12. En outre, la taille nucléaire modifié est un paramètre clé dans le diagnostic du cancer et le pronostic 13-17. Les mécanismes qui contribuent à la réglementation nucléaire de taille sont largement inconnus, en partie en raison de la complexité et de la nature essentielle de la structure et la fonction nucléaire. La méthode décrite ici a été développé comme un test in vitro pour la taille nucléaire mise à l&#39; échelle qui se prête à la manipulation biochimique et l&#39; élucidation des mécanismes de régulation nucléaire de taille. Xenopus laevis extrait d&#39;œuf est un système bien établi pour récapituler et étudier les processus cellulaires complexes in vitro </em&gt; Contexte. Ces extraits ont révélé de nouvelles informations fondamentales sur plusieurs processus cellulaires , y compris l&#39;assemblage et la fonction du fuseau mitotique, réticulum endoplasmique, et le noyau 18-22. Un des principaux avantages du système d&#39;extraction est que X. extraits d&#39;œufs de laevis représentent un cytoplasme presque pur , dont la composition peut être facilement modifié, par exemple par addition de protéines ou immunodéplétion recombinantes. Par ailleurs, on est en mesure de manipuler les processus essentiels en utilisant des traitements qui seraient autrement létale dans un contexte in vivo. Les modifications de la procédure d&#39;extrait d&#39;oeufs permettent d&#39;isoler des extraits de X. embryons laevis plutôt que des œufs, et ces extraits d&#39;embryons sont également prêtent à la manipulation biochimique 23. Pendant X. laevis développement, l&#39;embryon fécondé unicellulaire (~ 1 mm de diamètre) est soumis à une série de douze divisions cellulaires rapides (étapes 1-8) pour générer plusieurs milliers de 50 μm de diamètre et de plus petites cellules, atteignant un stade de développement appelé la transition midblastula (MBT) ou le stade 24 au 26 août. Le MBT est caractérisée par l&#39;apparition de la transcription zygotique, la migration cellulaire, des divisions cellulaires asynchrones, acquisition de phases d&#39;écart, et l&#39;établissement de tailles en régime permanent nucléaire plutôt que l&#39;expansion nucléaire continue comme dans l&#39;embryon pré-MBT. De l&#39; étape 4 à la gastrulation (étapes de 10,5 à 12), le volume des noyaux individuels diminue de plus de 10 fois 11. Ici, le but est d&#39;identifier les mécanismes responsables de ces réductions de la taille nucléaire au cours de la progression du développement. L&#39;approche consiste à assembler d&#39; abord les noyaux dans X. laevis extrait d&#39;oeufs et d&#39;isoler les noyaux du cytoplasme d&#39;oeuf / extrait. Ces noyaux sont ensuite remises en suspension dans le cytoplasme à partir d&#39;embryons à un stade avancé de gastrula. Après une période d&#39;incubation, les noyaux à partir de l&#39;extrait d&#39;œuf deviennent plus petits dans un extrait d&#39;embryon de fin de scène. Nous avons pensé que ce would être un test utile pour identifier les composants cytoplasmiques présents dans les embryons à un stade avancé de développement qui contribuent à la taille nucléaire mise à l&#39;échelle. L&#39; utilisation de ce test, couplé à la validation in vivo, nous avons démontré que la protéine kinase C (PKC) contribue à la réduction du développement de la taille nucléaire de X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Sondes moléculaires IgG anti-souris</td><td></td><td>Donkey A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP Sel disodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td> centrifuge <td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>chymostatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>créatine phosphate disodique</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasine D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>jetable lingettes (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Verre cristallisant plat (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimide H 33342 trichlorhydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - gonadotrophine chorionique humaine&nbsp ;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolécithine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline + Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>TUYAUX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Film de paraffine plastique (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Sérum de jument gestante Gonadotrophin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en verre à fond rond, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire (Alexa Fluor 568 âne anti-souris IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (support de montage anti-décoloration)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

un dosage cellulaire sans l&#39;aide<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embryo extraits d&#39;étudier les mécanismes de règlement des tailles nucléaire

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Une question fondamentale en biologie cellulaire est de savoir comment la taille des cellules et des organites sont réglementés. Il est depuis longtemps reconnu que la taille du noyau des échelles généralement à la taille de la cellule, notamment lors de l&#39;embryogenèse alors que des réductions spectaculaires dans les deux cellules et les tailles nucléaires se produisent. Mécanismes de régulation nucléaire de taille sont largement inconnus et peuvent être pertinents pour le cancer où la taille nucléaire modifié est un paramètre diagnostique et pronostique clé. In vivo approches pour identifier les régulateurs nucléaires de taille sont compliquées par la nature essentielle et complexe de la fonction nucléaire. L&#39;approche in vitro décrit ici pour étudier le contrôle nucléaire de taille profite des réductions de taille normale nucléaire qui se produisent au cours du développement de Xenopus laevis. Tout d&#39; abord, les noyaux sont assemblés en X. laevis extrait d&#39;oeufs. Ensuite, ces noyaux sont isolés et resuspendus dans le cytoplasme des embryons à un stade avancé. Au bout d&#39;un 30-90 min période d&#39;incubation, la surface nucléairediminue de 20-60%, en fournissant un essai utile pour identifier les composants cytoplasmiques présents dans les embryons à un stade avancé de développement qui contribuent à la taille nucléaire mise à l&#39;échelle. Un avantage majeur de cette approche est la facilité relative avec laquelle les extraits d&#39;ovules et d&#39;embryons peuvent être manipulés biochimiquement, permettant l&#39;identification de nouvelles protéines et des activités qui régulent la taille nucléaire. Comme pour toute approche in vitro, la validation des résultats dans un système in vivo est importante, et la micro - injection de X. embryons laevis est particulièrement approprié pour ces études.

Assemblée des Nuclei dans Extrait de Egg Les premières étapes de ce protocole sont de préparer X. extrait de laevis d&#39;oeuf (Protocole 1) et les noyaux de sperme demembranated (protocole n ° 2). Ces réactifs sont ensuite utilisés pour assembler des noyaux de novo (protocole n ° 3). La figure 1 montre des données représentatives. L&#39;addition de calcium entraîne ...

Les mécanismes de mise à l’échelle cellulaire et intracellulaire restent insaisissables. L’utilisation d’extraits d’embryons de xénope est devenue de plus en plus courante pour élucider les mécanismes de régulation de la taille des organites. Cette méthode décrit la préparation d’extraits d’embryons et un nouveau test de détartrage nucléaire permettant d’identifier les mécanismes de régulation de la taille nucléaire.

Un dosage cellulaire sans l&#39;aide<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extraits d&#39;étudier les mécanismes de règlement des tailles nucléaire

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des extraits d'œufs et d'embryons de Xenopus pour mettre au point un test dans lequel de gros noyaux réduisent la taille de noyaux plus petits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire nucléaire, comme quelles sont les mécanismes régulant la taille du noyau ? Le principal avantage de cette technique est que la composition et les activités de l'extrait acellulaire de Xenopus peuvent être facilement modifiées afin d'évaluer les facteurs influant sur la taille nucléaire.Après avoir préparé les extraits d'ovocytes de Xenopus, les spermatozoïdes démembranés et les noyaux assemblés selon le protocole décrit, recueillez les œufs fraîchement pondus en tenant des grenouilles au-dessus d'une boîte de Pétri en verre réutilisable. Stimulez la ponte en exerçant une pression douce sur la partie inférieure du dos, près de la cloaque. Inclinez la boîte d'environ 45 degrés afin de permettre aux œufs de s'accumuler le long du bord de la boîte.Ensuite, retirez l'excès de tampon et ajoutez suffisamment de MMR à un tiers pour recouvrir à peine les œufs. À l’aide d’un piston bien ajusté, macérez et homogénéisez un quart d’un testicule dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de solution saline de Barth modifiée à haute teneur en sel, ou MBS. Ajoutez ensuite le testicule macéré aux œufs et laissez la fécondation se produire à température ambiante pendant 15 minutes.Après l'incubation, inonder les œufs avec un tiers de X MMR. Puis, cinq à dix minutes plus tard, confirmer la fécondation en vérifiant le rétrécissement du pôle animal pigmenté foncé et la rotation des embryons avec leurs pôles animaux orientés vers le haut. À l’aide d’une pipette en plastique à large orifice, retirer soigneusement les œufs morts, lysés, non fécondés ou non clivés, car ils induiront rapidement la mort des embryons voisins.Entre une heure et deux heures et demie après la fécondation, débarrassez les embryons de leur gelée dans une solution de cystéine à deux à trois pour cent dissoute dans du MMR à un tiers de concentration, ajustée à un pH de 7,9. Avant le débarras de la gelée, les embryons occupent un volume relativement important. Effectuez deux changements de tampon pendant trois à quatre minutes chacun.Ensuite, laver soigneusement les embryons avec six à dix changements rapides de MMR à un tiers pour éliminer toutes les traces de cystéine. Après le décollement de la membrane, les embryons s'agglomèrent fortement et occupent un volume relativement restreint. Puis, à l’aide d’une pipette en verre à large orifice, transférer les embryons sains et fécondés dans une boîte de Pétri contenant du MMR à un tiers fraîchement préparé.Et à température ambiante, laissez-les se développer jusqu'au stade souhaité. Continuez à éliminer les embryons morts ou lysés, indiqués par l'absence de première division ou par un aspect blanc et gonflé. Lorsque les embryons ont atteint le stade 11,5 à 12, transférez-les dans du MMR frais à un tiers de concentration, supplémenté en cycloheximide à 0,5 millimolaire, puis incubez les embryons à température ambiante pendant une heure afin de les arrêter en fin d'interphase.À l’aide d’une pipette en verre ou en plastique à large orifice, transférez au moins 15 embryons arrêtés en interphase dans un tube de microcentrifugation. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse d’œufs, ou ELB, supplémenté d’un microlitre de solution mère de LPC aux embryons. Retournez doucement le tube pour laver les embryons.Ensuite, laissez les embryons tomber au fond du tube. Avant d'éliminer le tampon, répétez le lavage deux fois supplémentaires. Remettez les embryons en suspension dans 500 microliters de ELB, additionnés de 0,5 microliters de solution mère de LPC, 5 microliters de cycloheximide à 19,7 millimolaire et 5 microliters de cytochalasine D à 35,5 millimolaire afin d'inhiber la polymérisation de l'actine.Centrifuger les échantillons dans une centrifugeuse de table à 200 × g pendant une minute, puis éliminer le tampon excédentaire et utiliser un pilon pour broyer complètement les embryons. Placer les échantillons broyés dans un rotor à godets oscillants et centrifuger à 10 000 × g et à 16 °C pendant 10 minutes. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, percer la couche lipidique par le haut, puis, en utilisant une pointe de pipette propre, prélever la couche cytoplasmique de couleur ambrée située au milieu et la transférer dans un tube de taille appropriée.Supplémenter l'extrait embryonnaire avec les réactifs suivants. Ensuite, retourner doucement le tube pour mélanger. Puis, après avoir visualisé les noyaux embryonnaires endogènes dans l'extrait en préparant une squash selon le protocole décrit dans le texte, éliminer les noyaux de l'extrait en ajoutant d'abord un volume égal de ELB contenant les réactifs énumérés ici.Retournez doucement le tube pour mélanger. Centrifugez l'échantillon dans un rotor à godets oscillants à 17 000 ×g à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, récupérez le surnageant en prenant soin d'éviter tout résidu lipidique restant en surface, et laissez intact le culot de noyaux au fond.Préparez une purée comme décrit dans le protocole du texte afin de garantir que la majorité des noyaux aient été éliminés. Utilisez ensuite l'extrait frais ou répartissez l'échantillon en aliquotes, puis conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Isolez les noyaux assemblés dans l'extrait d'œuf en diluant de 25 à 150 microlitres de noyaux préalablement assemblés dans un millilitre de tampon ELB dans un tube de 1,5 millilitre.Centrifuger à 1600 ×g et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, retirer le tampon en prenant soin de ne pas perturber le culot. Ajouter au culot un volume d'extrait d'embryon équivalent au volume initial de l'extrait d'œuf, puis taper doucement sur le tube pour disperser le culot et remettre en suspension les noyaux.Incuber à température ambiante pendant 90 minutes, en tapotant doucement le tube pour mélanger toutes les 15 à 30 minutes. Après l'incubation, tapoter le tube pour resuspendre les noyaux juste avant d'ajouter 500 microlitres de ELB contenant 15 % de glycérol et 2,6 % de paraformaldéhyde. Retourner immédiatement le tube, puis le placer sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 15 minutes.Préparez les tubes de centrifugation en équipant des tubes en verre ronds de 15 millilitres avec des inserts plastiques à fond rond. Ajoutez 5 millilitres de tampon de coussin nucléaire, puis déposez délicatement une lame couvre-objet circulaire de 12 millimètres dans le tube, en veillant à ce qu'elle repose à plat sur l'insert plastique. À l’aide d’une pipette à embout large, superposez délicatement la solution de noyaux fixés sur le coussin nucléaire.Centrifuger dans un rotor à godets oscillants à 1 000 ×g et à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, utiliser un aspirateur pour éliminer tout le tampon et maintenir l'insert en plastique en haut du tube. Puis, à l’aide d’une pince fine, retirer la lame couvre-objet, en prenant soin de noter le côté de la lame sur lequel les noyaux ont été centrifugés.Fixer la lame à couvrir dans du méthanol froid pendant cinq minutes à température ambiante. Transférer la lame, côté noyaux vers le haut, sur une feuille de film plastique en paraffine recouvrant un grand plat en plastique. Placer ensuite des lingettes jetables humides le long des bords du plat pour éviter la déshydratation.Avec 500 microlitres de PBS NP40, réhydratez les noyaux sur le lamelle pendant cinq à dix secondes et aspirez. Ensuite, superposez délicatement 75 microlitres de PBS 3 % BSA sur le lamelle et laissez bloquer à température ambiante pendant une heure ou à 4 degrés Celsius toute la nuit. Retirez le tampon de blocage et incubez avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS 3 % BSA.Ensuite, lavez les échantillons avec cinq changements immédiats de PBS NP40. Répétez ces étapes d'incubation et de lavage avec les anticorps secondaires. Incubez avec 10 microgrammes par millilitre de Hoechst dilué dans du PBS contenant 3 % de BSA pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, lavez cinq fois avec du PBS NP40 et éliminez tout excès de tampon. Enfin, montez la lame couvre-objet sur une lame porte-objet à l’aide de cinq microlitres de milieu de montage anti-fade. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller la lame couvre-objet et observez immédiatement au microscope à épifluorescence ou conservez à 40 degrés Celsius pour une observation ultérieure.Cette figure montre l'assemblage des noyaux à partir d'extrait d'œuf. Entre 30 et 45 minutes après l'initiation de la réaction, les noyaux de spermatozoïdes fins et en forme de S doivent commencer à s'épaissir pour former des masses de chromatine en forme de limace. Après l'assemblage nucléaire, la forme du noyau devrait devenir plus arrondie et le volume nucléaire devrait augmenter à mesure que l'enveloppe nucléaire s'étend et que les protéines nucléaires sont importées.Comme illustré ici, un écrasement coloré au Hoechst d'un petit aliquot de l'extrait d'embryon montre de nombreux noyaux colorés, indiquant que la préparation de l'extrait a été réussie. Après l'élimination des noyaux par centrifugation, par rapport au premier écrasement, très peu de noyaux devraient rester dans l'extrait, comme le révèle ce panneau, garantissant ainsi que les noyaux endogènes n'interfèrent pas avec les analyses ultérieures. Si des noyaux sont encore présents, une deuxième centrifugation est nécessaire.Dans ce test de rétrécissement nucléaire, les noyaux provenant d'extrait d'œuf et remis en suspension dans un extrait d'embryon en stade tardif deviennent progressivement plus petits au fil du temps. En revanche, les noyaux incubés avec un extrait d'embryon inactivé par la chaleur ne se rétrécissent pas. Il est important de répéter l'expérience plusieurs fois afin de tenir compte de la variabilité intrinsèque du test.Une fois maîtrisé, l'ensemble du protocole peut être réalisé en deux jours, l'essai de rétrécissement nucléaire prenant environ quatre heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de penser à vérifier régulièrement la qualité des œufs et des embryons, et d'être très prudent pour éviter le culot et les couches lipidiques lors de la collecte de l'extrait cytoplasmique après centrifugation. Les résultats obtenus en suivant cette procédure doivent être validés.Par exemple, mon micro-injection d'embryons ou la transfection en culture cellulaire. En outre, cette méthode pourrait être utilisée pour explorer la régulation de la taille d'autres organites. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire nucléaire pour étudier les mécanismes régulateurs de la taille du noyau et le rôle fonctionnel de la taille nucléaire dans le développement et la carcinogenèse.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assembler et isoler les noyaux à partir d'extrait d'œufs de Xenopus, générer des embryons de Xenopus et leur extrait, réaliser le test de rétrécissement nucléaire et visualiser les résultats.

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Assemblage membrane nucléaire est une étape essentielle dans le cycle de division cellulaire, ce processus peut être reproduit dans le tube à essai en combinant la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus, le cytosol et des fractions membranaires de lumière. Remplissez noyaux sont formés, y compris les membranes nucléaires avec des complexes de pores, et ces noyaux reconstitués sont capables du processus normal de nucléaire.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la...

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Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d'obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.

Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

Les mécanismes moléculaires de la décondensation de la chromatine mitotique hautement compactée sont mal définis. Nous présentons un test acellulaire basé sur des amas de chromatine mitotique isolés de cellules HeLa et d’extrait d’œuf de Xenopus laevis qui reconstitue fidèlement le processus de décondensation in vitro.

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Les auteurs décrivent les étapes permettant d’échantillonnage rapide in situ d’une petite portion d’une cellule individuelle avec haute précision et une atteinte minimale à l’aide de base capillaire Microprélèvement, pour faciliter la caractérisation chimique d’une capture instantanée de l’activité métabolique dans embryons vivants à l’aide d’une cellule unique sur mesure électrophorèse capillaire et la plate-forme de la spectrométrie de masse.

Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

Nous présentons une méthode pour la production d’in vitro auto-entretenue oscillations mitotique au niveau unicellulaire en encapsulant les extraits d’oeufs de Xenopus laevis dans eau-dans-huile microémulsions.

Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus

Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Nous décrivons une méthode de constriction physique pour produire des mini-embryons à partir d’embryons à 1 cellule de Xenopus laevis .

Manipulation physique pour générer des embryons miniatures Xenopus

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules individuelles provenant des embryons précoces de Xenopus laevis et les trier par taille cellulaire.

Isolement des cellules uniques des embryons précoces de Xenopus et tri par taille

Découvrez un dosage cellulaire innovant pour étudier la régulation de la taille nucléaire en utilisant des extraits d'embryons de Xenopus laevis. Cette méthode permet de manipuler facilement la composition des extraits acellulaires.

Un dosage cellulaire sans l'aide

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