Un dosage cellulaire sans l'aide

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des extraits d'œufs et d'embryons de Xenopus pour mettre au point un test dans lequel de gros noyaux réduisent la taille de noyaux plus petits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire nucléaire, comme quelles sont les mécanismes régulant la taille du noyau ? Le principal avantage de cette technique est que la composition et les activités de l'extrait acellulaire de Xenopus peuvent être facilement modifiées afin d'évaluer les facteurs influant sur la taille nucléaire.

Après avoir préparé les extraits d'ovocytes de Xenopus, les spermatozoïdes démembranés et les noyaux assemblés selon le protocole décrit, recueillez les œufs fraîchement pondus en tenant des grenouilles au-dessus d'une boîte de Pétri en verre réutilisable. Stimulez la ponte en exerçant une pression douce sur la partie inférieure du dos, près de la cloaque. Inclinez la boîte d'environ 45 degrés afin de permettre aux œufs de s'accumuler le long du bord de la boîte.

Ensuite, retirez l'excès de tampon et ajoutez suffisamment de MMR à un tiers pour recouvrir à peine les œufs. À l’aide d’un piston bien ajusté, macérez et homogénéisez un quart d’un testicule dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de solution saline de Barth modifiée à haute teneur en sel, ou MBS. Ajoutez ensuite le testicule macéré aux œufs et laissez la fécondation se produire à température ambiante pendant 15 minutes.

Après l'incubation, inonder les œufs avec un tiers de X MMR. Puis, cinq à dix minutes plus tard, confirmer la fécondation en vérifiant le rétrécissement du pôle animal pigmenté foncé et la rotation des embryons avec leurs pôles animaux orientés vers le haut. À l’aide d’une pipette en plastique à large orifice, retirer soigneusement les œufs morts, lysés, non fécondés ou non clivés, car ils induiront rapidement la mort des embryons voisins.

Entre une heure et deux heures et demie après la fécondation, débarrassez les embryons de leur gelée dans une solution de cystéine à deux à trois pour cent dissoute dans du MMR à un tiers de concentration, ajustée à un pH de 7,9. Avant le débarras de la gelée, les embryons occupent un volume relativement important. Effectuez deux changements de tampon pendant trois à quatre minutes chacun.

Ensuite, laver soigneusement les embryons avec six à dix changements rapides de MMR à un tiers pour éliminer toutes les traces de cystéine. Après le décollement de la membrane, les embryons s'agglomèrent fortement et occupent un volume relativement restreint. Puis, à l’aide d’une pipette en verre à large orifice, transférer les embryons sains et fécondés dans une boîte de Pétri contenant du MMR à un tiers fraîchement préparé.

Et à température ambiante, laissez-les se développer jusqu'au stade souhaité. Continuez à éliminer les embryons morts ou lysés, indiqués par l'absence de première division ou par un aspect blanc et gonflé. Lorsque les embryons ont atteint le stade 11,5 à 12, transférez-les dans du MMR frais à un tiers de concentration, supplémenté en cycloheximide à 0,5 millimolaire, puis incubez les embryons à température ambiante pendant une heure afin de les arrêter en fin d'interphase.

À l’aide d’une pipette en verre ou en plastique à large orifice, transférez au moins 15 embryons arrêtés en interphase dans un tube de microcentrifugation. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse d’œufs, ou ELB, supplémenté d’un microlitre de solution mère de LPC aux embryons. Retournez doucement le tube pour laver les embryons.

Ensuite, laissez les embryons tomber au fond du tube. Avant d'éliminer le tampon, répétez le lavage deux fois supplémentaires. Remettez les embryons en suspension dans 500 microliters de ELB, additionnés de 0,5 microliters de solution mère de LPC, 5 microliters de cycloheximide à 19,7 millimolaire et 5 microliters de cytochalasine D à 35,5 millimolaire afin d'inhiber la polymérisation de l'actine.

Centrifuger les échantillons dans une centrifugeuse de table à 200 × g pendant une minute, puis éliminer le tampon excédentaire et utiliser un pilon pour broyer complètement les embryons. Placer les échantillons broyés dans un rotor à godets oscillants et centrifuger à 10 000 × g et à 16 °C pendant 10 minutes. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, percer la couche lipidique par le haut, puis, en utilisant une pointe de pipette propre, prélever la couche cytoplasmique de couleur ambrée située au milieu et la transférer dans un tube de taille appropriée.

Supplémenter l'extrait embryonnaire avec les réactifs suivants. Ensuite, retourner doucement le tube pour mélanger. Puis, après avoir visualisé les noyaux embryonnaires endogènes dans l'extrait en préparant une squash selon le protocole décrit dans le texte, éliminer les noyaux de l'extrait en ajoutant d'abord un volume égal de ELB contenant les réactifs énumérés ici.

Retournez doucement le tube pour mélanger. Centrifugez l'échantillon dans un rotor à godets oscillants à 17 000 ×g à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, récupérez le surnageant en prenant soin d'éviter tout résidu lipidique restant en surface, et laissez intact le culot de noyaux au fond.

Préparez une purée comme décrit dans le protocole du texte afin de garantir que la majorité des noyaux aient été éliminés. Utilisez ensuite l'extrait frais ou répartissez l'échantillon en aliquotes, puis conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Isolez les noyaux assemblés dans l'extrait d'œuf en diluant de 25 à 150 microlitres de noyaux préalablement assemblés dans un millilitre de tampon ELB dans un tube de 1,5 millilitre.

Centrifuger à 1600 ×g et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, retirer le tampon en prenant soin de ne pas perturber le culot. Ajouter au culot un volume d'extrait d'embryon équivalent au volume initial de l'extrait d'œuf, puis taper doucement sur le tube pour disperser le culot et remettre en suspension les noyaux.

Incuber à température ambiante pendant 90 minutes, en tapotant doucement le tube pour mélanger toutes les 15 à 30 minutes. Après l'incubation, tapoter le tube pour resuspendre les noyaux juste avant d'ajouter 500 microlitres de ELB contenant 15 % de glycérol et 2,6 % de paraformaldéhyde. Retourner immédiatement le tube, puis le placer sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 15 minutes.

Préparez les tubes de centrifugation en équipant des tubes en verre ronds de 15 millilitres avec des inserts plastiques à fond rond. Ajoutez 5 millilitres de tampon de coussin nucléaire, puis déposez délicatement une lame couvre-objet circulaire de 12 millimètres dans le tube, en veillant à ce qu'elle repose à plat sur l'insert plastique. À l’aide d’une pipette à embout large, superposez délicatement la solution de noyaux fixés sur le coussin nucléaire.

Centrifuger dans un rotor à godets oscillants à 1 000 ×g et à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, utiliser un aspirateur pour éliminer tout le tampon et maintenir l'insert en plastique en haut du tube. Puis, à l’aide d’une pince fine, retirer la lame couvre-objet, en prenant soin de noter le côté de la lame sur lequel les noyaux ont été centrifugés.

Fixer la lame à couvrir dans du méthanol froid pendant cinq minutes à température ambiante. Transférer la lame, côté noyaux vers le haut, sur une feuille de film plastique en paraffine recouvrant un grand plat en plastique. Placer ensuite des lingettes jetables humides le long des bords du plat pour éviter la déshydratation.

Avec 500 microlitres de PBS NP40, réhydratez les noyaux sur le lamelle pendant cinq à dix secondes et aspirez. Ensuite, superposez délicatement 75 microlitres de PBS 3 % BSA sur le lamelle et laissez bloquer à température ambiante pendant une heure ou à 4 degrés Celsius toute la nuit. Retirez le tampon de blocage et incubez avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS 3 % BSA.

Ensuite, lavez les échantillons avec cinq changements immédiats de PBS NP40. Répétez ces étapes d'incubation et de lavage avec les anticorps secondaires. Incubez avec 10 microgrammes par millilitre de Hoechst dilué dans du PBS contenant 3 % de BSA pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez cinq fois avec du PBS NP40 et éliminez tout excès de tampon. Enfin, montez la lame couvre-objet sur une lame porte-objet à l’aide de cinq microlitres de milieu de montage anti-fade. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller la lame couvre-objet et observez immédiatement au microscope à épifluorescence ou conservez à 40 degrés Celsius pour une observation ultérieure.

Cette figure montre l'assemblage des noyaux à partir d'extrait d'œuf. Entre 30 et 45 minutes après l'initiation de la réaction, les noyaux de spermatozoïdes fins et en forme de S doivent commencer à s'épaissir pour former des masses de chromatine en forme de limace. Après l'assemblage nucléaire, la forme du noyau devrait devenir plus arrondie et le volume nucléaire devrait augmenter à mesure que l'enveloppe nucléaire s'étend et que les protéines nucléaires sont importées.

Comme illustré ici, un écrasement coloré au Hoechst d'un petit aliquot de l'extrait d'embryon montre de nombreux noyaux colorés, indiquant que la préparation de l'extrait a été réussie. Après l'élimination des noyaux par centrifugation, par rapport au premier écrasement, très peu de noyaux devraient rester dans l'extrait, comme le révèle ce panneau, garantissant ainsi que les noyaux endogènes n'interfèrent pas avec les analyses ultérieures. Si des noyaux sont encore présents, une deuxième centrifugation est nécessaire.

Dans ce test de rétrécissement nucléaire, les noyaux provenant d'extrait d'œuf et remis en suspension dans un extrait d'embryon en stade tardif deviennent progressivement plus petits au fil du temps. En revanche, les noyaux incubés avec un extrait d'embryon inactivé par la chaleur ne se rétrécissent pas. Il est important de répéter l'expérience plusieurs fois afin de tenir compte de la variabilité intrinsèque du test.

Une fois maîtrisé, l'ensemble du protocole peut être réalisé en deux jours, l'essai de rétrécissement nucléaire prenant environ quatre heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de penser à vérifier régulièrement la qualité des œufs et des embryons, et d'être très prudent pour éviter le culot et les couches lipidiques lors de la collecte de l'extrait cytoplasmique après centrifugation. Les résultats obtenus en suivant cette procédure doivent être validés.

Par exemple, mon micro-injection d'embryons ou la transfection en culture cellulaire. En outre, cette méthode pourrait être utilisée pour explorer la régulation de la taille d'autres organites. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire nucléaire pour étudier les mécanismes régulateurs de la taille du noyau et le rôle fonctionnel de la taille nucléaire dans le développement et la carcinogenèse.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment assembler et isoler les noyaux à partir d'extrait d'œufs de Xenopus, générer des embryons de Xenopus et leur extrait, réaliser le test de rétrécissement nucléaire et visualiser les résultats.