Un dosage cellulaire sans l'aide Xenopus laevis Embryo Extraits d'étudier les mécanismes de règlement des tailles nucléaire

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des extraits d’ovules et d’embryons de xénope pour produire un test dans lequel les gros noyaux rétrécissent plus petits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la biologie des cellules nucléaires, telles que quels sont les mécanismes qui régulent la taille nucléaire ? Le principal avantage de cette technique est que la composition et les activités de l’extrait acellulaire de xénope sont facilement manipulées pour évaluer les faits sur la taille nucléaire.

Après avoir préparé des extraits d’ovules de xénope, des spermatozoïdes démembrés et des noyaux assemblés selon le protocole textuel, collectez des œufs fraîchement pondus en tenant des grenouilles au-dessus d’une boîte de Pétri réutilisable en verre. Favorisez la ponte en appliquant une légère pression sur le bas du dos près du cloaque. Placez le plat à environ 45 degrés pour permettre aux œufs de s’accumuler le long du bord du plat.

Ensuite, retirez l’excès de tampon et ajoutez suffisamment d’un tiers de X MMR pour couvrir à peine les œufs. À l’aide d’un pilon bien ajusté, faites macérer et homogénéiser 1/4 d’un testicule dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de solution saline de Barth modifiée à haute teneur en sel, ou MBS. Ajoutez ensuite les testicules macérés aux ovules et laissez la fécondation se produire à température ambiante pendant 15 minutes.

Après l’incubation, inondez les œufs avec un tiers de X ROR. Puis, cinq à dix minutes plus tard, confirmez la fécondation en vérifiant la contraction du pôle animal pigmenté foncé et en faisant pivoter les embryons avec leurs pôles d’animal vers le haut. À l’aide d’une pipette en plastique de gros calibre, retirez diligemment les ovules morts, lysés ou non fécondés, car ils provoqueront rapidement la mort des embryons voisins.

Entre une et 2,5 heures après la fécondation, les embryons de dégelée dans deux à trois pour cent de cystéine se sont dissous dans un tiers du MMR X, qui a été ajusté à pH 7,9. De la dégelée à la dégelée, les embryons occupent un volume relativement important. Effectuez deux modifications de la mémoire tampon pendant trois à quatre minutes chacune.

Ensuite, lavez soigneusement les embryons avec six à 10 brefs changements d’un tiers de X MMR pour éliminer toute trace de cystéine. Après la dégelée, les embryons s’entassent étroitement et occupent un volume relativement petit. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre de gros calibre, transférez des embryons sains et fécondés dans une boîte de Pétri contenant un tiers de X MMR frais.

Et à température ambiante, laissez-les se développer jusqu’au stade souhaité. Continuez à prélever les embryons morts ou lysés comme l’indique une absence de première division ou un aspect blanc et gonflé. Lorsque les embryons ont atteint les stades 11,5 à 12, transférez-les dans un tiers de MMR X frais complété par 0,5 millimolaire de cycloheximide et incubez les embryons à température ambiante pendant une heure pour les arrêter en fin d’interphase.

À l’aide d’une pipette en verre ou en plastique de gros calibre, transférez un minimum de 15 embryons arrêtés entre les phases dans un tube de microcentrifugation. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse d’œuf, ou ELB, complété par un microlitre de stock LPC aux embryons. Retournez doucement le tube pour laver les embryons.

Laissez ensuite les embryons tomber au fond du tube. Avant de retirer le tampon, répétez le lavage deux fois de plus. Remettez les embryons en suspension dans 500 microlitres d’ELB, plus 0,5 microlitre de stock LPC, 5 microlitres de cycloheximide 19,7 millimolaires et 5 microlitres de cytochalasine D de 35,5 millimolaires pour inhiber la polymérisation de l’actine.

Centrifugez les échantillons dans une centrifugeuse de table à 200 fois G pendant une minute, puis retirez l’excès de tampon et utilisez un pilon pour écraser soigneusement les embryons. Placez les échantillons broyés dans un rotor à godets oscillants et centrifugez-les à 10 000 fois G et 16 degrés Celsius pendant 10 minutes. Avec une pointe de pipette de 200 microlitres, percez la couche lipidique par le haut et, à l’aide d’une pointe de pipette propre, retirez la couche cytoplasmique centrale de couleur ambrée dans un tube de taille appropriée.

Complétez l’extrait d’embryon avec les réactifs suivants. Ensuite, retournez doucement le tube pour mélanger. Ensuite, après avoir visualisé les noyaux embryonnaires endogènes dans l’extrait en préparant une courge selon le protocole de texte, retirez les noyaux de l’extrait en ajoutant d’abord un volume égal d’ELB contenant les réactifs énumérés ici.

Retournez doucement le tube pour mélanger. Centrifugez l’échantillon dans un rotor à godets oscillants à 17 000 fois G à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, récupérez le surnageant, en prenant soin d’éviter tout lipide restant en haut, et laissez les noyaux granulés en bas intacts.

Préparez une courge comme décrit dans le protocole textuel pour vous assurer que la plupart des noyaux ont été retirés. Ensuite, utilisez l’extrait frais, ou aliquote de l’échantillon, et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Isolez les noyaux assemblés dans l’extrait d’œuf en diluant 25 à 150 microlitres de noyaux préassemblés dans un millilitre d’ELB dans un tube de 1,5 millilitre.

Centrifugeuse à 1600 fois G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Retirez ensuite le tampon en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajoutez à la pastille un volume d’extrait d’embryon égal au volume d’origine d’extrait d’ovule, et tapotez doucement le tube pour briser la pastille et remettre les noyaux en suspension.

Incuber à température ambiante pendant 90 minutes, en tapotant doucement le tube pour mélanger toutes les 15 à 30 minutes. Après l’incubation, tapotez le tube pour remettre les noyaux en suspension juste avant d’ajouter 500 microlitres d’ELB avec 15 % de glycérol et 2,6 % de paraformaldéhyde. Retournez immédiatement le tube et placez-le sur un rotateur à température ambiante pendant 15 minutes.

Préparez des tubes à visser en équipant des tubes en verre à fond rond de 15 millilitres d’inserts en plastique à fond rond. Ajoutez 5 millilitres de tampon de coussin nucléaire, puis déposez une lamelle circulaire de 12 millimètres dans le tube, en vous assurant qu’elle repose à plat sur l’insert en plastique. À l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, superposez délicatement la solution de noyaux fixes sur le coussin nucléaire.

Centrifugez-le dans un rotor à godets oscillants à 1 000 fois G et 16 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, utilisez un aspirateur pour retirer tout le tampon et maintenez l’insert en plastique sur le dessus du tube. Puis, à l’aide d’une paire de pinces fines, retirez la lamelle en prenant soin de noter le côté de la lamelle sur lequel les noyaux ont été tournés.

L’hôte fixe la lamelle dans du méthanol froid pendant cinq minutes à température ambiante. Transférez la lamelle, côté noyau vers le haut, sur une feuille de film de paraffine plastique tapissant une grande boîte de Pétri en plastique. Placez ensuite des lingettes humides et jetables sur le côté du plat pour éviter la déshydratation.

Avec 500 microlitres de PBS NP40, réhydratez les noyaux sur la lamelle pendant cinq à 10 secondes et aspirez. Ensuite, superposez soigneusement 75 microlitres de PBS 3 % BSA sur la lamelle et laissez-la bloquer à température ambiante pendant une heure, soit quatre degrés Celsius pendant la nuit. Retirer le tampon bloquant et incuber avec l’anticorps primaire dilué dans du PBS 3 % BSA.

Ensuite, lavez les échantillons avec cinq changements immédiats de PBS NP40. Répétez ces étapes d’incubation et de lavage avec des anticorps secondaires. Incuber avec 10 microgrammes par millilitre de Hoechst dilaté dans du PBS 3 % BSA pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez cinq fois avec du PBS NP40 et retirez tout l’excès de tampon. Enfin, montez la lamelle sur une glissière avec cinq microlitres de support de montage anti-décoloration. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle et imagez immédiatement à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou conservez-le à 40 degrés Celsius pour une imagerie ultérieure.

Cette figure montre l’assemblage des noyaux d’extrait d’ovule. 30 à 45 minutes après le début de la réaction, les minces noyaux de spermatozoïdes en forme de S devraient commencer à s’épaissir en masses de chromatine en forme de limace. Après l’assemblage nucléaire, la forme nucléaire devrait devenir plus arrondie et le volume nucléaire devrait augmenter à mesure que l’enveloppe nucléaire se dilate et que des protéines nucléaires sont importées.

Comme le montre ici, une courge colorée à Hoechst d’une petite partie aliquote de l’extrait d’embryon présente de nombreux noyaux colorés, ce qui indique que la préparation de l’extrait a réussi. Après l’élimination des noyaux par centrifugation, par rapport à la première courge, très peu de noyaux devraient rester dans l’extrait, comme révélé dans ce panel, garantissant que les noyaux endogènes n’interfèrent pas avec l’analyse en aval. Si les noyaux sont encore présents, un second cycle de centrifugation est nécessaire.

Dans cet essai de rétrécissement nucléaire, les noyaux d’extrait d’œuf remis en suspension dans un extrait d’embryon à un stade avancé deviennent plus petits avec succès au fil du temps. Cependant, ce n’est pas le cas des noyaux incubés avec de l’extrait d’embryon inactivé par la chaleur. Il est important de répéter l’expérience plusieurs fois pour tenir compte de la variabilité inhérente du test.

Une fois maîtrisé, l’ensemble du protocole peut être réalisé en deux jours, le test de rétrécissement nucléaire lui-même prenant environ quatre heures. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier la qualité des ovules et des embryons tout au long de l’ensemble et d’être très prudent pour éviter les couches de granules et de lipides lors de la collecte de l’extrait cytoplasmique après centrifugation. Les résultats obtenus en suivant cette procédure doivent être validés.

Par exemple, ma micro-injection d’embryons ou ma transfection de culture cellulaire. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour explorer la régulation de la taille d’autres organites. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire nucléaire pour explorer les mécanismes de régulation de la taille nucléaire et le rôle fonctionnel de la taille nucléaire dans le développement et la cancérogenèse.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler et d’isoler les noyaux d’extrait d’œuf de xénope, de générer des embryons de xénope et de l’extrait d’embryon, d’effectuer le test de rétrécissement nucléaire et de visualiser les résultats.