Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

L'objectif général de cette procédure est de générer et de distinguer des macrophages de type alvéolaire des cellules dendritiques dans des cultures in vitro de cellules de moelle osseuse murine enrichies en GM-CSF. Cette méthode in vitro peut aider à répondre à des questions clés concernant la fonction des cellules dendritiques ou des macrophages. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'obtenir un nombre suffisant de cellules et qu'elle permet de distinguer les cellules dendritiques des macrophages de type alvéolaire.

Les implications de cette technique pourraient s'étendre au traitement de la protéinose pulmonaire, car elle facilite l'obtention de macrophages de type alvéolaire, pouvant être utilisés pour traiter cette maladie. En général, les personnes novices dans cette méthode devront s'exercer à isoler les os nettoyés et à rincer la moelle osseuse. Une démonstration visuelle de cette méthode est utile, car toutes les techniques utilisées ne sont pas facilement comprises par des instructions écrites uniquement.

15 minutes avant de commencer la dissection, allumez une hotte de sécurité biologique afin d'épurer l'air de la hotte et de stabiliser le flux d'air, puis nettoyez la surface de la hotte avec de l'éthanol à 70 %. Lorsque la hotte est prête, placez une souris sur une ou deux feuilles de papier absorbant en position ventrale et vaporisez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, à l'aide de la main non dominante, soulevez la peau autour de la région thoracique et utilisez des ciseaux pour pratiquer une incision.

En tenant fermement les deux extrémités de l'incision, tirez délicatement jusqu'à ce que les deux bouts de l'incision se rejoignent au niveau de l'estomac. Placez ensuite la souris en position supine et utilisez une main pour tirer la moitié inférieure de la peau vers le bas jusqu'à ce que les pattes soient exposées. En tenant le pied, sectionnez les tendons d'Achille au-dessus de l'articulation de la cheville ainsi que les ligaments reliant les muscles au pied à l'extrémité inférieure du tibia, afin de détacher le pied des os de la jambe.

En maintenant la patte surélevée, retirer les muscles et les ligaments autour de l'articulation du genou à l'extrémité inférieure du fémur afin de détacher les muscles de la cuisse de la jambe inférieure. À l’aide de pinces, tirer délicatement les muscles desserrés des surfaces fibulaire et fémorale. Ensuite, en maintenant les ciseaux en position ouverte contre l’articulation de la hanche, faire pivoter la patte et tirer doucement sur le fémur pour séparer l’os de la patte de l’articulation de la hanche tout en sectionnant la patte du corps.

Tenant maintenant la patte à l'extrémité de la hanche avec une pince stérile, utilisez une autre pince pour détacher le pied de l'extrémité de la cheville. Ensuite, en tenant l'extrémité distale du fémur avec une pince et l'extrémité proximale du tibia et du péroné avec une autre, pliez soigneusement le tibia et le péroné dans la direction opposée de l'articulation du genou afin de séparer la jambe inférieure du fémur et de la rotule. Utilisez la pince pour retirer les ligaments, muscles et le péroné restants des os de la jambe inférieure, puis placez le tibia nettoyé sur le couvercle renversé d'une boîte de Pétri contenant un à deux millilitres de HBSS/FCS.

En tenant l'extrémité inférieure du fémur avec une pince et la rotule avec une autre, plier le genou et les tissus environnants dans la direction opposée afin de retirer l'articulation. Ensuite, retirer tous les tissus conjonctifs restants du fémur et placer l'os sur le couvercle de la boîte de Pétri retourné. Lorsque tous les os ont été prélevés, utiliser des pinces pour nettoyer tout tissu résiduel encore attaché aux os et immerger les os dans 10 millilitres de HBSS/FCS au fond de la boîte de Pétri.

En maintenant la boîte partiellement protégée avec un couvercle stérile, couper chaque os nettoyé en deux à l’aide de ciseaux. Puis utiliser une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26,5 pour rincer l’extrémité de chaque morceau d’os avec un millilitre de HBSS/FCS provenant de la boîte, jusqu’à ce que toute la moelle rouge soit libérée. Faire passer tous les agrégats visibles de moelle osseuse plusieurs fois à travers la seringue afin d’obtenir une suspension monocellulaire, puis mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette de 10 millilitres.

Transférez les cellules dans un tube de collecte et rincez la boîte de Pétri une fois avec cinq millilitres de HBSS/FCS pour récupérer les cellules résiduelles. Ensuite, rassemblez le lavage dans le tube de collecte et placez les cellules sur de la glace. Pour mettre en place une culture de cellules de moelle osseuse, centrifugez les cellules recueillies et aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile reliée à une aspiration sous vide.

Relâchez le culot riche en globules rouges en tapotant. Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges et remettez les cellules en suspension par vortexage. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, arrêtez la lyse en ajoutant 10 millilitres de HBSS/FCS, puis centrifugez les cellules et remettez le culot en suspension dans le milieu pour cellules de la moelle osseuse.

Compter le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan et transférer les cellules nécessaires dans un nouveau tube contenant du milieu pour cellules de moelle osseuse. Ensuite, recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre le culot à une dilution de quatre millions de cellules par millilitre dans du milieu pour cellules de moelle osseuse contenant 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF. Puis, ajouter 9,5 millilitres de milieu pour cellules de moelle osseuse supplémenté avec 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF dans une boîte de Petri bactérienne stérile par culture, et ajouter 500 microlitres de cellules au centre de chaque boîte.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2. Au jour trois, ajouter 10 millilitres de milieu frais pour moelle osseuse supplémenté avec 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF à chaque culture, en prenant soin de minimiser toute perturbation des cellules. Au jour six, transférer soigneusement 10 millilitres de surnageant de culture cellulaire dans un tube conique stérile de 50 millilitres.

Centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu frais pour cellules de moelle osseuse, contenant 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF. Ensuite, vortexer doucement la suspension cellulaire et replacer les cellules dans la boîte de culture. Au jour un, les cellules de la moelle osseuse sont petites et peu nombreuses, mais au jour trois, elles ont augmenté en nombre et en taille, et certaines ont commencé à adhérer.

Vers le sixième jour, le nombre de cellules est plus élevé et l'on observe des fractions adhérentes et non adhérentes. La culture peut être récoltée du septième au dixième jour et triée selon la taille et les cellules vivantes, une plus forte proportion de cellules positives pour CD11c étant obtenue à partir des cultures du dixième jour. Au septième jour, la fraction non adhérente recueillie est fortement enrichie en cellules présentant une morphologie dendritique.

Les populations positives pour CD11c et négatives pour GR1, récoltées aux jours sept et dix, peuvent être divisées en trois populations principales. Les macrophages, les cellules dendritiques immatures et les cellules dendritiques matures selon l'expression de MHCII et la liaison de FL-HA. Curieusement, MerTK, bien qu'elle soit considérée comme un marqueur des macrophages, présente une expression forte à la fois sur les populations de macrophages et de cellules dendritiques immatures, récoltées aux jours sept et dix, avec un faible niveau d'expression observé sur les cellules dendritiques matures.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des techniques stériles tout au long de la collecte de la moelle osseuse et de la culture cellulaire. Après cette procédure, les cellules peuvent également être triées pour examiner séparément les populations cellulaires, ou être stimulées par des agents inflammatoires puis analysées quant à leur production de cytokines par coloration intracellulaire et cytométrie en flux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les cellules de la moelle osseuse et les cultiver en présence de GM-CSF afin de générer à la fois des cellules dendritiques et des macrophages de type alvéolaire.