Name: Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Découvrez comment générer et distinguer des macrophages alvéolaires et des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris avec GM-CSF. Cette méthode permet d'obtenir suffisamment de cellules pour étudier leurs fonctions immunitaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (Grant MOP-119503) et les sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG) du Canada. Le CRSNG appuie également bourses d&#39;été à YD et AA YD est pris en charge par l&#39;Université de la Colombie-Britannique (UBC) avec une bourse de recherche de 4 ans, AA est pris en charge par les IRSC à l&#39;attribution d&#39;une maîtrise de l&#39;étudiant diplômé (BESC-M). Nous remercions Calvin Roskelley d&#39;assistance avec le microscope utilisé pour générer les images de la figure 2. Nous reconnaissons également le soutien des UBC animaux et de débit Installations cytométrie.

Les souris ont été euthanasiés en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux pour la recherche animale éthique par des procédures approuvées par l&#39;Université de Columbia Animal Care Committee britannique. 1. L&#39;acquisition d&#39;une seule cellule de moelle osseuse Suspension de la souris et de Tibia Fémur <ol><li> Allumer une enceinte de sécurité biologique (BSC) 15 min avant le début de la procédure pour purger l&#39;air de l&#39;armoire et de permettre la stabilisation des flux d&#39;air, puis nettoyer / pulvérisation surface BSC avec 70% d&#39;éthanol. Gardez tout aussi stérile que possible pour l&#39;ensemble du protocole. Ne pas couper les os dans des conditions non stériles. </li><li> Préparer des outils de dissection par trempage dans 70% d&#39;éthanol (1 paire de ciseaux de dissection, 2 paires de pinces), solution saline équilibrée de Hank avec 5% de sérum de veau foetal (HBSS-FCS), boîtes de Petri stériles (100 mm x 15 mm), 1 seringues ml, 26½ aiguilles de calibre, les tubes de prélèvement coniques (15 ml ou 50 ml), et des serviettes en papier dans le BSC. </li><li> Euthanasier la souris à l&#39;aideprotocoles approuvés par le comité d&#39;éthique de la recherche sur les animaux de l&#39;institution. Apportez dans le BSC, placer sur le dessus d&#39;une ou deux serviettes en papier et vaporiser la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Dans le BSC, ouvrir une boîte de Pétri stérile aseptique, aliquote de 10 ml de HBSS-FCS à la base et 1 - 2 ml au couvercle. </li><li> Placez la souris sur le ventre avec le dos tourné vers le haut et soulever la peau autour des sections thoraciques avec les doigts de la main non dominante. Utilisez les ciseaux pour faire une incision où la peau est soulevée. </li><li> Tenez aux deux extrémités de la coupe, une extrémité de chaque main et soigneusement séparer la peau autour de la souris de l&#39;arrière vers l&#39;estomac, continuez à tirer jusqu&#39;à ce que deux extrémités de l&#39;incision se rencontrent à l&#39;estomac. </li><li> Retournez la souris pour l&#39;estomac vers le haut, et d&#39;une main tirer la moitié inférieure de la peau vers le bas vers la jambe, gardez tirant la peau jusqu&#39;à ce que les jambes sont exposés. </li><li> Tenez le pied de la souris vers le haut et couper les tendons d&#39;Achille au-dessus de l&#39;articulation de la cheville etles ligaments qui relient les muscles à pied à l&#39;extrémité inférieure du tibia avec des ciseaux. Cette desserre le pied des os de la jambe. </li><li> Tout en maintenant la jambe vers le haut par le pied, couper les muscles et les ligaments avec des ciseaux autour de l&#39;articulation du genou à l&#39;extrémité inférieure du fémur pour séparer les muscles de la cuisse de la jambe inférieure. Utilisez une pince pour tirer doucement les muscles desserrées loin de la fibula et les surfaces fémorales. Prenez soin de ne pas couper l&#39;artère fémorale pour éviter des saignements abondants. </li><li> Avec une main tenant sur pied, presse ciseaux bas ouverts à l&#39;extrémité supérieure du fémur à l&#39;articulation de la hanche, tourner la jambe et tirez doucement pour séparer le fémur de l&#39;articulation de la hanche tout en utilisant les ciseaux pour faire la coupe finale à la libre la jambe du corps. </li><li> A partir de ce moment-là, seulement maintenir le tissu avec des pinces stériles. Accrochez-vous à la jambe à une extrémité et retirer le pied sur l&#39;autre. NOTE: Ce ne devrait pas exiger beaucoup de force, que les ligaments de connexion sont coupés à l&#39; étape1.9. Alternativement, couper le tibia juste au-dessus de la cheville où l&#39;os est fusionné. </li><li> Maintenir la jambe de l&#39;extrémité distale du fémur, avec un ensemble de pince et l&#39;extrémité proximale du tibia et du péroné avec l&#39;autre, plier soigneusement le tibia et le péroné dans le sens opposé de l&#39;articulation du genou pour les séparer du fémur et de la rotule. </li><li> Utilisez une pince pour tirer vers le bas les ligaments et les muscles restants encore attachés aux os de la jambe. Ici, retirer le péroné avec les tissus conjonctifs avec une pince comme il est trop petit pour être rincée pour les cellules de la moelle osseuse. Placez le tibia nettoyé sur la boîte de Pétri inversé couvercle. </li><li> Maintenir l&#39;extrémité inférieure du fémur avec un ensemble de pinces et de la rotule à une autre, plier la rotule et les tissus environnants dans le sens opposé de l&#39;articulation pour le retrait. Ensuite, nettoyer les tissus conjonctifs restants du fémur; les retirer avec une pince, et placez-le sur le plat inversé Petri couvercle. Jeter la rotule. </li><li> Répétez 1.7- 1.13 avec l&#39;autre jambe si nécessaire. Transférer les os à 1,6 ml microtubes contenant 1 ml stérile HBSS-FCS pour le transport si nécessaire. </li><li> Placez les os sur la boîte de Pétri couvercle inversé, avec 1 - 2 ml de HBSS-FCS, utiliser des pinces pour nettoyer les tissus résiduels encore attaché au tibia et du fémur, puis transférer les os à la base de boîte de Pétri contenant 10 ml de HBSS FCS. Vous pouvez également nettoyer les os et retirer le tissu musculaire joint à l&#39;aide d&#39;un tissu imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Couper chacun des os dans la moitié avec des ciseaux. protéger partiellement la boîte de Pétri avec un couvercle stérile pendant la coupe pour assurer les os restent dans le plat. Alternativement, couper l&#39;extrémité de chaque os pour permettre le rinçage à l&#39;étape suivante. </li><li> Fixer le 26½ aiguille G à la seringue de 1 ml, et établit 1 ml de HBSS-FCS de la boîte de Pétri. Insérer la pointe de l&#39;aiguille dans l&#39;extrémité d&#39;un morceau d&#39;os et de débusquer les cellules de moelle osseuse (tissu rouge doux à l&#39;intérieur des os). Insérez l&#39;aiguille dans la têtede l&#39;os et l&#39;extrémité ouverte, jusqu&#39;à ce que toute la moelle de couleur rouge est éliminée. Observer les os comme de couleur blanche. </li><li> Passez les grumeaux visibles de la moelle osseuse à travers la seringue plusieurs fois pour former une suspension cellulaire unique. </li><li> Jeter les os rougies. Utilisez 10 ml pipette pour mélanger la suspension cellulaire bien et transférer dans le tube de collecte. Rincer la boîte de Petri, une fois avec 5 ml de HBSS-FCS pour recueillir les cellules résiduelles dans la boîte. Placez les cellules sur la glace. NOTE: La suspension de cellules de moelle osseuse est encore viable si elle est conservée pour les 2 - 3 heures à 4 ° C. </li></ol> 2. Dépôt et culture des cellules de moelle osseuse (BMC) <ol><li> Préparer les réactifs et les fournitures suivantes. <ol><li> Préparer un tampon de lyse rouge globule (RBC) en faisant 0,84% de chlorure d&#39;ammonium dans une solution finale de 2 mM de Tris, pH 7,2, puis stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 micron. </li><li> Préparer des milieux BMC en ajoutant 10% de FCS, 20 mM d&#39;HEPES, 1 x acides aminés non essentiels, 55 &amp; #181; M 2-mercaptoéthanol, 50 U / ml de pénicilline et de la streptomycine, du pyruvate de sodium 1 mM et 2 mM de L-glutamine en milieu RPMI 1640. </li><li> Obtenir disponibles dans le commerce GM-CSF recombinant ou en utilisant le GM-CSF contenant du surnageant de cellules de myélome Ag8.653 transfectées avec le gène du GM-CSF 20. Déterminer la concentration de GM-CSF dans le surnageant par ELISA et ajouter l&#39;équivalent de 20 ng / ml pour les médias BMC. </li></ol></li><li> Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 314 g pendant 5 min. Le culot est rouge, en raison de globules rouges. Dans le BSC, aspirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en verre stérile attaché à vide d&#39;aspiration, desserrer le culot en tapotant, puis ajouter 10 ml de tampon de lyse RBC. Vortex pour remettre en suspension les cellules et incuber dans un tampon de lyse des globules rouges à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 10 ml de HBSS-FCS puis tourner les cellules à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. Observer le culot cellulaire que la couleur blanche. Resuspendre les cellules dans le volume désiré des médias BMC. </li><li> Comptez le resucellules spended utilisant un hémocytomètre après coloration des cellules mortes avec 0,4% de bleu trypan. NOTE: Si la moelle osseuse d&#39;une jambe (tibia simple et fémur) est utilisé, remettre en suspension dans 5 ml de milieu BMC, prendre 10 pi de suspension cellulaire et le diluer avec 70 ul de 0,4% trypan bleu, bien mélanger et transférer 10 pi de la dilution 8/1 de la cellule à la chambre d&#39;hémocytomètre. Compter les cellules viables dans quatre quadrants: la moyenne des quatre chefs d&#39; accusation de quadrant x facteur de dilution x 10 4 = nombre de cellules par ml. Un fémur et un tibia d&#39;une jambe généralement donné environ 2-4 x 10 7 cellules après lyse RBC. </li><li> Estimer le nombre de 10 ml plats de cultures de moelle osseuse nécessaires pour des expériences en aval sur la base du nombre de cellules totales nécessaires pour les expériences à la fin de la culture. NOTE: Chaque plat nécessite 2 x 10 6 cellules de moelle osseuse à l&#39; ensemencement initial et les rendements 5 - 10 x 10 6 cellules au jour 7. <ol><li> Aliquot le nombre total de cellules pour le placage dans un nouveau tube, centrifuger à 314 xg pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à 4 x 10 6 cellules / ml dans les médias BMC. </li></ol></li><li> Préparer une nouvelle stérile 100 mm x 15 mm boîte de Pétri avec 9,5 ml de milieu BMC contenant 200 ng de GM-CSF (recombinant ou de GM-CSF contenant surnageant). Ajouter 500 ul de 4 x 10 6 cellules cellules de moelle osseuse / ml au centre de la boîte de Petri pour la concentration finale de 2 x 10 5 cellules / ml dans 10 ml. NOTE: Il est important d&#39;utiliser une boîte de Pétri stérile et non une boîte de culture de tissu. En outre, lors de l&#39;ajout des cellules, assurer les cellules restent concentrées au centre et de minimiser les perturbations pour les plats après le semis et lors des changements de médias. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Ceci est le jour 0 dans la culture. </li><li> Le jour 3, ajouter 10 ml de milieu frais BMC contenant 200 ng de GM-CSF à chaque plat de cellules. Prenez soin de minimiser la perturbation of les cellules concentrées en suspension. Le volume total de la culture cellulaire est maintenant 20 ml. </li><li> Observer les cellules au microscope optique à grossissement 100X. Observer de nombreuses cellules non-adhérentes (ronds) et quelques cellules adhérentes (plat). Les cellules en groupes de trois ou quatre pétales ressemblant d&#39;une fleur peut être vu, ce qui indique la prolifération. </li><li> Le jour 6 effectuer un changement de la moitié des médias. Retirez délicatement 10 ml de milieu dans un tube conique de 50 ml stérile, centrifuger à 314 xg pendant 5 min, aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu frais BMC contenant 20 ng / ml de GM-CSF, doucement vortex et ajouter à la boîte de culture cellulaire d&#39;origine pour un volume total de 20 ml. Observer les cellules au microscope. NOTE: Jour 7 culture doit être à 70% ou plus en confluence avec des cellules plates adhérentes et des nuages ​​denses de cellules non adhérentes rondes. </li></ol> 3. Collecte et préparation BMDC et BMDMs pour cytométrie de flux <ol> &lt;li&gt; Gardez tous les tampons à 4 ° C. </li><li> Récolter les cellules du jour 7 au jour 10. Pour récolter les cellules, premier transfert 10 ml du surnageant de culture à un tube conique de collecte de 50 ml, puis inclinez le plat verticalement d&#39;environ 30 degrés et laver le plat par pipetage les 10 ml restants la culture de la partie supérieure de la coupelle. Répéter ce lavage 5 fois, chaque fois tourner le plat d&#39;un tiers. </li><li> Transférer les 10 ml restants de cellules dans le même tube collecteur et jeter la plaque et les cellules adhérentes. REMARQUE: Les lavages seront éliminer les cellules non-adhérentes et faiblement adhérentes; les cellules adhérentes plates sont résistantes aux lavages. En règle générale, entre 5 - 10 x 10 6 cellules non adhérentes sont attendus d&#39;une plaque à 7 jours et 2 - 5 x 10 6 cellules au jour 10, bien que Lutz et al. rapporté 10 x 10 6 cellules au jour 10. Les cellules adhérentes ne sont normalement pas prises. Cependant, si ces cellules doivent être comparées aux cellules non-adhérentes, Ils peuvent être éliminés de la manière suivante. Ajouter 5 ml d&#39;EDTA 0,7 dans 1 x PBS, pH 7,4 à la boîte après que les cellules non adhérentes sont enlevées, incuber à 37 ° C pendant 5 min, la pipette vers le haut et vers le bas pour éliminer les cellules adhérentes et recueillir dans un tube séparé. </li><li> Isoler les cellules recueillies à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 5 ml de milieu BMC stérile à 4 ° C, vortex doucement pour mélanger, et compter en utilisant du bleu trypan et hémocytomètre. NOTE: Chaque plat donnera 5 - 10 x 10 6 cellules non adhérentes d&#39;une culture 7 jours. A partir de maintenant, effectuer toutes les étapes à 4 ° C. </li><li> Pour l&#39; analyse cytométrique d&#39;écoulement, le transfert de 2 x 10 5 cellules pour chaque échantillon dans 5 ml polystyrène tubes à fond rond, ajouter 300 ul de tampon FACS à 4 ° C (1x solution saline tamponnée phosphate, 2 mM d&#39; EDTA et 2% de sérum albumine bovine) à chaque échantillon. </li><li> Spin cellules vers le bas à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. Observer un blanc, pastille opaque visible aufond du tube. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ul de récepteur Fc non marqué Ab pour bloquer la liaison au récepteur Fc (1/10 Utiliser le surnageant de 2.4G2 produisant lignée cellulaire de myélome) et incuber pendant 20 min à 4 ° C. Puis ajouter 300 pi de tampon FACS à chaque échantillon, doucement vortex puis tourner les cellules vers le bas à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 pi de CD11c-PeCy7 à 0,2 pg / ml, Bleu Gr1-Pacifique à 0,25 pg / ml, MHCII-APC à 0,05 pg / ml, et FL-HA à environ 2 pg / ml pour identifier les macrophages et les PED. NOTE: FL-HA a été préparé dans la maison à l&#39; aide de fluorescéine et de sel de sodium de l&#39; acide hyaluronique de crête de coq comme décrit précédemment 21. </li><li> Incuber pendant 20 min à 4 ° C pour permettre la liaison à la surface cellulaire. Ajouter 300 pi de tampon FACS à chaque échantillon, doucement vortex, puis tourner les cellules vers le bas à 314 xg pendant 5 minutes à 4 ° C et aspirer le surnageant . REMARQUE: Si bioanticorps tinylated sont utilisés dans 3,8, répéter 3,8 à 9 avec fluorescent-streptavidine. </li><li> Laver les cellules avec un autre 300 pi de tampon FACS, doucement vortex pour mélanger et centrifuger les cellules à 314 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon FACS contenant 0,1 à 0,2 pg par ml d&#39;iodure de propidium ou du DAPI pour marquer les cellules non viables. Les cellules sont maintenant prêtes pour l&#39; analyse cytométrique d&#39;écoulement 22. REMARQUE: Voir les résultats et la figure 3 pour plus de détails sur les populations et comment les cellules ont été bloqués. </li></ol>

<ol><li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+lineage+phenotypes+and+osteoclastogenesis--complexity+in+the+control+by+GM-CSF+and%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and.</a> Bone. 40 (2), 323-336 (2007).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand-generated+murine+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cells+differ+in+their+capacity+to+prime+naive+CD8+T+cells+and+to+generate+memory+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo.</a> J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+culture+method+starting+with+early+growth+factors+permits+enhanced+production+of+functional+dendritic+cells+from+murine+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes.</a> J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).</li>
<li>Brasel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+synergizes+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+granulocyte+colony-stimulating+factor+to+mobilize+hematopoietic+progenitor+cells+into+the+peripheral+blood+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice.</a> Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).</li>
<li>Segura, E., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+dendritic+cells+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory dendritic cells in mice and humans.</a> Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).</li>
<li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+innate+immune+receptor+Dectin-1+upon+formation+of+a+%27phagocytic+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse.</a> Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).</li>
<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+of+cellular+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation.</a> Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).</li>
<li>Vander Lugt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+dendritic+cells+for+enhanced+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation.</a> Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).</li>
<li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+alveolar+macrophage+differentiation+and+innate+immunity+in+the+lung+through+PU.1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1.</a> Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+Macrophage-CSF+Dependent+Macrophage+Responses+by+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models.</a> J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Poon, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+Binding+Identifies+a+Functionally+Distinct+Alveolar+Macrophage-like+Population+in+Bone+Marrow-Derived+Dendritic+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures.</a> J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li>
<li>Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cells+solicit+their+own+help+from+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">cells solicit their own help from T cells.</a> J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).</li>
<li>de Belder, A. N., Wik, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+properties+of+fluorescein-labelled+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate.</a> Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).</li>
<li>Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+ligand+activation+of+murine+bone+marrow-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells.</a> Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).</li>
<li>Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells%3A+%27Exhausted%27+or+Alert+and+Waiting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li>
<li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li>
<li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li>
<li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.

Dans ce manuscrit, nous fournissons un procédé pour générer les macrophages et les DC GM-CSF provenant d&#39;une culture de moelle osseuse de souris unique qui est adapté de Lutz et coll. 6. Expression MHCII et FL-HA distingue les CD immatures et les macrophages de liaison dans cette culture (voir la figure 3C), qui a été difficile. Ceci, combiné avec un autre rapport de Helft et al. 19, montre l&#39; hétérogénéité au sein de GM-CSF cultures BMDC induits qui étaie...

Plusieurs méthodes de culture in vitro ont été décrits pour générer des macrophages d&#39;os dérivées de la moelle (BMDMs) et les CD dérivées de la moelle osseuse (BMDC) en utilisant un ou une combinaison de facteurs de croissance. BMDMs peut être produite en cultivant des cellules de moelle osseuse en utilisant soit le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) ou le GM-CSF 1,2. Pour BMDCs, l&#39;addition d&#39; un ligand de FLT3 dans la culture de moelle osseuse donne lieu à des DC plasmacytoïdes classiques et non-adhérentes (CD11c haut / MHCII haut et CD11c lo, B220 + , respectivement) après 9 jours de culture , 3,4. En revanche, les cellules non adhérentes générées après 7 à 10 jours de culture avec GM-CSF seul 5,6, GM-CSF et l&#39; IL-4 7, ou le GM-CSF et FLT3 ligand 8,9 génèrent BMDCs ressemblant davantage les PED inflammatoires (CD11c haute, MHCII haute CD11b +) 10. Bien que ces cultures in vitro sont utilisées pour générer des macrophages ouDC, il est difficile de savoir si chaque culture donne lieu à des populations pures. Par exemple, bien que les cellules adhérentes dans les cultures GM-CSF sont décrits comme les macrophages 5, les cellules non-adhérentes de la même culture sont utilisés comme DC 6,11-13, avec la présomption qu&#39;ils sont homogènes et toute variabilité observée est en raison de différents stades de développement 14,15. En outre, des études ont montré GM-CSF d&#39;être un facteur de croissance essentiel pour le développement des macrophages alvéolaires in vivo 16,17, et peuvent être utilisés in vitro pour générer alvéolaires comme les macrophages 16,17,18. Autre que l&#39;adhésion, les procédures de génération des macrophages et des pays en développement à partir de cultures de moelle osseuse GM-CSF traités sont très similaires suggérant l&#39;hétérogénéité peuvent exister au sein des cultures de moelle osseuse GM-CSF. Cela semble bien être le cas que deux documents font état de la présence de BMDMs dans la fraction non adhérente des cultures BMDC. Dans un papier, ils identified une population de cellules que CD11c +, CD11b +, MHCII mi, MerTK + et CD115 +, qui exprimait une signature d&#39;expression génique qui ressemblait plus étroitement les macrophages alvéolaires et avait une capacité réduite à activer les cellules T 19. Le second papier utilisé MHCII et FL-HA pour identifier une population de type macrophage alvéolaire (CD11c +, MHCII mid / low, FL-HA élevé) qui était distincte de immature (CD11c +, MHCII mi, FL-HA bas) et mature DC (CD11c +, MHCII haute), à la fois phénotypiquement et fonctionnellement 18. Ces documents illustrent les deux que les cultures GM-CSF BMDC sont hétérogènes, contenant à la fois des macrophages et des populations DC indiquant que les soins doivent être prises lors de l&#39;interprétation des données à partir de cultures BMDC. Ce protocole décrit comment isoler la moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse dans la culture de GM-CSF, et d&#39;identifier les alvéoles macrophagepopulation à partir des CD immatures et matures dans la culture de la moelle osseuse par cytométrie en flux en utilisant la liaison et l&#39;expression MHCII FL-HA. Cette procédure est basée sur la procédure établie de Lutz et al 6 et est capable de générer. 5 - 10 x 10 6 cellules non adhérentes au jour 7 de la culture de 10 ml. La culture est utilisable de jours 7 à 10 et on obtient une population hétérogène de macrophages, DCs immatures et matures, ainsi que des progéniteurs au jour 7. Ceci permet d&#39; obtenir une méthode simple pour isoler et cultiver in vitro des macrophages alvéolaires analogues dans de grandes quantités.

<table><tbody><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD&nbsp ;</td>Microscope inversé automatisé <td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>Centrifugeuse DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 26 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube conique&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>357070</td>*Tubes Eppendorf <td>de marque Falcon</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tubes en polystyrène à fond rond</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Outils de dissection</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>*Divers&nbsp ;</td><td>*Ciseaux de dissection, pince Dumont et pince standard&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hémocytomètre&nbsp ;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 100 mm x 15 mm Boîte de Pétri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon marque</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank’s</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineacide éthananesulfonique</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Crête de coq Hyaluronate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Utilisé pour fabriquer de l’acide hyaluronique fluorescéiné</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>Sans pyruvate de sodium, sans glutamine. Supports chauds à 37&nbsp ; &#176 ; C avant utilisation.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>5271-10&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Récepteur anti-Fc (non marqué), Supernageant de culture tissulaire</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Clone : 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clone : N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clone : RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clone : M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinylé Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>IgG polyclonale de chèvre</td></tr><tr><td>Streptavidine PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

génération et identification de gm-csf dérivé alvéolaires comme macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages et les cellules dendritiques (CD) sont des cellules immunitaires innées présentes dans les tissus et les organes lymphoïdes qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes. Cependant, ils sont difficiles à isoler en nombre suffisant pour les étudier en détail, par conséquent, des modèles in vitro ont été développés. Dans les cultures in vitro de macrophages dérivés de la moelle osseuse et les cellules dendritiques sont des méthodes précieuses et bien établies pour les études immunologiques. Ici, un procédé de mise en culture et identifier à la fois les DC et les macrophages à partir d&#39;une seule culture de cellules de moelle osseuse de souris en utilisant la première facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages de cytokines (GM-CSF) est décrit. Ce protocole est basé sur la procédure établie d&#39; abord développé par Lutz et al. en 1999 pour les PED dérivées de la moelle osseuse. La culture est hétérogène, et MHCII et hyaluronane fluorescéine (FL-HA) sont utilisés pour distinguer les macrophages de CD immatures et matures. Ces GM-CSF dérivé macrophages proVidé une source pratique d&#39;in vitro des macrophages dérivés qui ressemblent étroitement à des macrophages alvéolaires dans les deux phénotype et la fonction.

Un organigramme résumant les principales étapes de ce procédé est représenté sur la figure 1. La densité et la morphologie de la culture de moelle osseuse à différents moments de la culture sont représentés sur la figure 2. Au jour 1, les cellules sont petites et rares , mais par jour 3, il y a plus de cellules, certains sont plus grandes et que quelques-uns ont commencé à adhérer. Par jour 6 il y a une adhérence définitive et la fraction non adhérente <...

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

L'objectif général de cette procédure est de générer et de distinguer des macrophages de type alvéolaire des cellules dendritiques dans des cultures in vitro de cellules de moelle osseuse murine enrichies en GM-CSF. Cette méthode in vitro peut aider à répondre à des questions clés concernant la fonction des cellules dendritiques ou des macrophages. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'obtenir un nombre suffisant de cellules et qu'elle permet de distinguer les cellules dendritiques des macrophages de type alvéolaire.Les implications de cette technique pourraient s'étendre au traitement de la protéinose pulmonaire, car elle facilite l'obtention de macrophages de type alvéolaire, pouvant être utilisés pour traiter cette maladie. En général, les personnes novices dans cette méthode devront s'exercer à isoler les os nettoyés et à rincer la moelle osseuse. Une démonstration visuelle de cette méthode est utile, car toutes les techniques utilisées ne sont pas facilement comprises par des instructions écrites uniquement.15 minutes avant de commencer la dissection, allumez une hotte de sécurité biologique afin d'épurer l'air de la hotte et de stabiliser le flux d'air, puis nettoyez la surface de la hotte avec de l'éthanol à 70 %. Lorsque la hotte est prête, placez une souris sur une ou deux feuilles de papier absorbant en position ventrale et vaporisez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, à l'aide de la main non dominante, soulevez la peau autour de la région thoracique et utilisez des ciseaux pour pratiquer une incision.En tenant fermement les deux extrémités de l'incision, tirez délicatement jusqu'à ce que les deux bouts de l'incision se rejoignent au niveau de l'estomac. Placez ensuite la souris en position supine et utilisez une main pour tirer la moitié inférieure de la peau vers le bas jusqu'à ce que les pattes soient exposées. En tenant le pied, sectionnez les tendons d'Achille au-dessus de l'articulation de la cheville ainsi que les ligaments reliant les muscles au pied à l'extrémité inférieure du tibia, afin de détacher le pied des os de la jambe.En maintenant la patte surélevée, retirer les muscles et les ligaments autour de l'articulation du genou à l'extrémité inférieure du fémur afin de détacher les muscles de la cuisse de la jambe inférieure. À l’aide de pinces, tirer délicatement les muscles desserrés des surfaces fibulaire et fémorale. Ensuite, en maintenant les ciseaux en position ouverte contre l’articulation de la hanche, faire pivoter la patte et tirer doucement sur le fémur pour séparer l’os de la patte de l’articulation de la hanche tout en sectionnant la patte du corps.Tenant maintenant la patte à l'extrémité de la hanche avec une pince stérile, utilisez une autre pince pour détacher le pied de l'extrémité de la cheville. Ensuite, en tenant l'extrémité distale du fémur avec une pince et l'extrémité proximale du tibia et du péroné avec une autre, pliez soigneusement le tibia et le péroné dans la direction opposée de l'articulation du genou afin de séparer la jambe inférieure du fémur et de la rotule. Utilisez la pince pour retirer les ligaments, muscles et le péroné restants des os de la jambe inférieure, puis placez le tibia nettoyé sur le couvercle renversé d'une boîte de Pétri contenant un à deux millilitres de HBSS/FCS.En tenant l'extrémité inférieure du fémur avec une pince et la rotule avec une autre, plier le genou et les tissus environnants dans la direction opposée afin de retirer l'articulation. Ensuite, retirer tous les tissus conjonctifs restants du fémur et placer l'os sur le couvercle de la boîte de Pétri retourné. Lorsque tous les os ont été prélevés, utiliser des pinces pour nettoyer tout tissu résiduel encore attaché aux os et immerger les os dans 10 millilitres de HBSS/FCS au fond de la boîte de Pétri.En maintenant la boîte partiellement protégée avec un couvercle stérile, couper chaque os nettoyé en deux à l’aide de ciseaux. Puis utiliser une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26,5 pour rincer l’extrémité de chaque morceau d’os avec un millilitre de HBSS/FCS provenant de la boîte, jusqu’à ce que toute la moelle rouge soit libérée. Faire passer tous les agrégats visibles de moelle osseuse plusieurs fois à travers la seringue afin d’obtenir une suspension monocellulaire, puis mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette de 10 millilitres.Transférez les cellules dans un tube de collecte et rincez la boîte de Pétri une fois avec cinq millilitres de HBSS/FCS pour récupérer les cellules résiduelles. Ensuite, rassemblez le lavage dans le tube de collecte et placez les cellules sur de la glace. Pour mettre en place une culture de cellules de moelle osseuse, centrifugez les cellules recueillies et aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile reliée à une aspiration sous vide.Relâchez le culot riche en globules rouges en tapotant. Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges et remettez les cellules en suspension par vortexage. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, arrêtez la lyse en ajoutant 10 millilitres de HBSS/FCS, puis centrifugez les cellules et remettez le culot en suspension dans le milieu pour cellules de la moelle osseuse.Compter le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan et transférer les cellules nécessaires dans un nouveau tube contenant du milieu pour cellules de moelle osseuse. Ensuite, recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre le culot à une dilution de quatre millions de cellules par millilitre dans du milieu pour cellules de moelle osseuse contenant 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF. Puis, ajouter 9,5 millilitres de milieu pour cellules de moelle osseuse supplémenté avec 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF dans une boîte de Petri bactérienne stérile par culture, et ajouter 500 microlitres de cellules au centre de chaque boîte.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2. Au jour trois, ajouter 10 millilitres de milieu frais pour moelle osseuse supplémenté avec 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF à chaque culture, en prenant soin de minimiser toute perturbation des cellules. Au jour six, transférer soigneusement 10 millilitres de surnageant de culture cellulaire dans un tube conique stérile de 50 millilitres.Centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu frais pour cellules de moelle osseuse, contenant 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF. Ensuite, vortexer doucement la suspension cellulaire et replacer les cellules dans la boîte de culture. Au jour un, les cellules de la moelle osseuse sont petites et peu nombreuses, mais au jour trois, elles ont augmenté en nombre et en taille, et certaines ont commencé à adhérer.Vers le sixième jour, le nombre de cellules est plus élevé et l'on observe des fractions adhérentes et non adhérentes. La culture peut être récoltée du septième au dixième jour et triée selon la taille et les cellules vivantes, une plus forte proportion de cellules positives pour CD11c étant obtenue à partir des cultures du dixième jour. Au septième jour, la fraction non adhérente recueillie est fortement enrichie en cellules présentant une morphologie dendritique.Les populations positives pour CD11c et négatives pour GR1, récoltées aux jours sept et dix, peuvent être divisées en trois populations principales. Les macrophages, les cellules dendritiques immatures et les cellules dendritiques matures selon l'expression de MHCII et la liaison de FL-HA. Curieusement, MerTK, bien qu'elle soit considérée comme un marqueur des macrophages, présente une expression forte à la fois sur les populations de macrophages et de cellules dendritiques immatures, récoltées aux jours sept et dix, avec un faible niveau d'expression observé sur les cellules dendritiques matures.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des techniques stériles tout au long de la collecte de la moelle osseuse et de la culture cellulaire. Après cette procédure, les cellules peuvent également être triées pour examiner séparément les populations cellulaires, ou être stimulées par des agents inflammatoires puis analysées quant à leur production de cytokines par coloration intracellulaire et cytométrie en flux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les cellules de la moelle osseuse et les cultiver en présence de GM-CSF afin de générer à la fois des cellules dendritiques et des macrophages de type alvéolaire.

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Cette vidéo décrit un protocole pour la génération de cellules dendritiques - des cellules présentatrices d’antigènes clés qui activent les cellules T - à partir de la moelle osseuse d’une souris adulte.

Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

L'article décrit une adaptation facile...

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L'explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l'interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l'attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.

Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Dans cet article, nous fournissons qu'un protocole détaillé pour l’expression des protéines de fusion fluorescent murin de moelle osseuse provenant des macrophages et les cellules dendritiques. La méthode est basée sur la transduction de la moelle osseuse progéniteurs avec constructions retroviral suivies de différenciation en macrophages et dendritiques des cellules in vitro.

Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.

Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Découvrez comment générer et distinguer des macrophages alvéolaires et des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris avec GM-CSF. Cette méthode permet d'obtenir suffisamment de cellules pour étudier leurs fonctions immunitaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris (Vidéo) | JoVE Journal

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Explorer plus de vidéos