Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

L’objectif global de cette procédure est de générer et de distinguer des macrophages de type alvéolaire des cellules dendritiques dans des cultures de cellules de moelle osseuse murine in vitro complétées par du GM-CSF. Cette méthode in vitro peut aider à répondre à des questions clés concernant la fonction des cellules dendritiques ou des macrophages. Le principal avantage de la technique est qu’elle peut générer un nombre suffisant de cellules et qu’elle peut faire la distinction entre les cellules dendritiques et les macrophages de type alvéolaire.

Les implications de cette technique peuvent s’étendre au traitement de la protéinose pulmonaire car elle facilite l’acquisition de macrophages de type alvéolaire, qui peuvent être utilisés pour traiter cette maladie. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront besoin de s’entraîner à isoler les os nettoyés et à rincer la moelle osseuse. La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car toutes les techniques utilisées ne sont pas aussi faciles à comprendre par des instructions écrites seules.

15 minutes avant de commencer la dissection, allumez une enceinte de sécurité biologique pour purger l’air de l’armoire et stabiliser le flux d’air, et nettoyez la surface de l’armoire avec de l’éthanol à 70 %. Lorsque l’armoire est prête, placez une souris sur une à deux serviettes en papier en position couchée et vaporisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, avec la main non dominante, soulevez la peau autour de la région thoracique et utilisez des ciseaux pour faire une incision.

En saisissant les deux extrémités de l’incision, tirez doucement jusqu’à ce que les deux extrémités de l’incision se rejoignent au niveau de l’estomac. Placez ensuite la souris en position couchée et utilisez une main pour tirer la moitié inférieure de la peau vers le bas jusqu’à ce que les jambes soient exposées. En tenant le pied, coupez les tendons d’Achille au-dessus de l’articulation de la cheville et les ligaments reliant les muscles au pied à l’extrémité inférieure du tibia pour desserrer le pied des os de la jambe.

En gardant la jambe surélevée, retirez les muscles et les ligaments autour de l’articulation du genou à l’extrémité inférieure du fémur pour renforcer les muscles de la cuisse de la partie inférieure de la jambe. À l’aide d’une pince, tirez doucement les muscles relâchés loin des surfaces fibulaire et fémorale. Ensuite, en appuyant sur les ciseaux en position ouverte au niveau de l’articulation de la hanche, faites pivoter la jambe et tirez doucement sur le fémur pour séparer l’os de la jambe de l’articulation de la hanche tout en coupant la jambe du corps.

En tenant maintenant la jambe à l’extrémité de la hanche avec une pince stérile, utilisez une autre pince pour retirer le pied de l’extrémité de la cheville. Ensuite, en tenant l’extrémité distale du fémur avec une pince et l’extrémité proximale du tibia et du péroné avec une autre, pliez soigneusement le tibia et le péroné dans la direction opposée de l’articulation du genou pour séparer la jambe inférieure du fémur et de la rotule. À l’aide de la pince, retirez les ligaments, les muscles et le péroné restants des os de la jambe inférieure et placez le tibia nettoyé sur un couvercle de boîte de Pétri inversé, contenant un à deux millilitres de HBSS/FCS.

En tenant l’extrémité inférieure du fémur avec une paire de pinces et la rotule avec une autre, pliez le genou et les tissus environnants dans la direction opposée pour retirer l’articulation. Retirez ensuite tous les tissus conjonctifs restants du fémur et placez l’os sur le couvercle de la boîte de Pétri inversée. Lorsque tous les os ont été prélevés, utilisez une pince pour nettoyer tout tissu résiduel encore attaché aux os et immergez les os dans 10 millilitres de HBSS/FCS à la base de la boîte de Pétri.

En gardant le plat partiellement protégé par un couvercle stérile, coupez chacun des os nettoyés en deux avec des ciseaux. Ensuite, utilisez une seringue d’un millilitre, équipée d’une aiguille de calibre 26,5, pour rincer un millilitre de HBSS/FCS de la boîte jusqu’à l’extrémité de chaque morceau d’os jusqu’à ce que toute la moelle rouge ait été libérée. Passez plusieurs fois les amas visibles de moelle osseuse dans la seringue pour former une suspension unicellulaire, puis mélangez soigneusement avec une pipette de 10 millilitres.

Transférez les cellules dans un tube de collecte et rincez une fois la boîte de Pétri avec cinq millilitres de HBSS/FCS pour recueillir les cellules résiduelles. Ensuite, mettez le linge en pool dans le tube de prélèvement et placez les cellules sur de la glace. Pour mettre en place une culture cellulaire de moelle osseuse, centrifugez les cellules collectées et aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile fixée à l’aspiration sous vide.

Détachez la pastille riche en globules rouges en tapotant dessus. Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges et remettez les cellules en suspension avec vortex. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, arrêtez la lyse avec 10 millilitres de HBSS/FCS et faites tourner les cellules, en remettant la pastille en suspension dans un milieu cellulaire de moelle osseuse.

Comptez le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trypan et transférez les cellules nécessaires dans un nouveau tube avec un milieu cellulaire de moelle osseuse. Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille à une dilution de quatre millions de cellules par millilitre dans un milieu cellulaire de moelle osseuse avec 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF. Ensuite, ajoutez 9,5 millilitres de milieu cellulaire de moelle osseuse complété par 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF dans une boîte de Pétri bactérienne stérile par culture et ajoutez 500 microlitres de cellules au centre de chaque boîte.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le troisième jour, ajoutez 10 millilitres de moelle osseuse fraîche complétée par 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF à chaque culture, en prenant soin de minimiser les perturbations des cellules. Le sixième jour, transférez soigneusement 10 millilitres de surnageant de culture cellulaire dans un tube conique stérile de 50 millilitres.

Centrifugez les cellules et remettez en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu cellulaire de moelle osseuse frais, contenant 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF. Ensuite, tourbillonnez doucement la suspension cellulaire et renvoyez les cellules dans la boîte de culture. Le premier jour, les cellules de la moelle osseuse sont petites et clairsemées, mais le troisième jour, le nombre et la taille des cellules ont augmenté, et certaines ont commencé à adhérer.

Au sixième jour, il y a plus de cellules et des fractions adhérentes et non adhérentes sont observées. La culture peut être récoltée du septième au dixième jour et contrôlée par taille et par cellules vivantes, avec un pourcentage plus élevé de cellules CD11c positives obtenues à partir des cultures du jour 10. Au septième jour, la fraction non adhérente collectée est considérablement enrichie pour les cellules à morphologie dendritique.

Les populations CD11c positives et GR1 négatives, récoltées les jours sept et 10, peuvent être divisées en trois populations principales. Macrophages, cellules dendritiques immatures et cellules dendritiques matures par expression MHCII et liaison FL-HA. Il est intéressant de noter que MerTK, bien que considéré comme un marqueur de macrophage, présente une expression robuste sur les populations de macrophages et de cellules dendritiques immatures, récoltées aux jours sept et dix, avec un faible niveau d’expression observé sur les cellules dendritiques matures.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des techniques stériles tout au long du prélèvement de moelle osseuse et de la culture cellulaire. À la suite de cette procédure, les cellules peuvent également être triées pour examiner les populations cellulaires séparément, ou elles peuvent être stimulées par des agents inflammatoires et ensuite analysées pour leur production de cytokines par coloration intracellulaire et cytométrie en flux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules de la moelle osseuse et de les cultiver dans du GM-CSF pour générer à la fois des cellules dendritiques et des macrophages de type alvéolaire.