Name: Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez la transduction rétrovirale des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des souris rétrogéniques TCR. Cette méthode permet d'étudier la fonction in vivo de multiples récepteurs des cellules T en immunologie.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (5K22A1119151-01 et 1R56DK104903-01) à MLB, Programme du Centre de recherche du diabète (P30-de DK079638) au BCM Pilot / faisabilité, la FRDJ 1-FAC-2014-243-AN CSA, ADA 1-15-JF-07, AAI Carrières in Immunology Fellowship à MB, et Le Robert et la Fondation Janice McNair.

Déclaration d&#39; éthique: Tous les efforts sont faits pour maintenir inconfort ou de stress animal à un minimum lors de l&#39; irradiation et de la queue veine injections. Les souris sont utilisées comme source de cellules dans ces expériences; en tant que tel, il n&#39;y a pas de procédures ou manipulations en dehors de l&#39;euthanasie. Les souris seront euthanasiés par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale pour confirmer la mort. Cette procédure est conforme aux recommandations du Groupe d&#39;étude sur l&#39;euthanasie de l&#39;American Veterinary Medical Association. 1. Préparer rétrovirale Construct <ol><li> Sous-clone du récepteur des cellules T (TCR) chaînes alpha et bêta, séparés par un lieur 2A, dans un retroviral 11 vecteur à base de MSCV (exemple, pMIAII ou pMIGII) 11. NOTE: Le lieur 2A permet l&#39;expression stoechiométrique et concordant des alpha et bêta de TCR chaînes à partir d&#39;un cadre de lecture ouvert unique. Le vecteur comprend une cassette IRES fluorescent de protéines (ou ametrine GFP) qui est utilisé poursuivre les cellules transduites et l&#39;efficacité de transduction. Pour un protocole détaillé s&#39;il vous plaît voir Holst et al 11. </li><li> Isoler l&#39;ADN plasmidique à l&#39;aide obtenue dans le commerce kit de préparation de plasma ou un produit similaire. Utiliser une concentration de travail de 1 - 2 pg ul -1. </li></ol> 2. Génération de rétrovirales Producteur lignées cellulaires <ol><li> Utiliser un processus en deux étapes pour produire les lignées cellulaires productrices rétrovirales. NOTE: Pour un protocole détaillé, s&#39;il vous plaît voir Holst et al 11.. <ol><li> Générer retrovirus par transfection transitoire de cellules 293T avec trois plasmides (pVSVG, PEQ-pAM3 (-E) et vecteur d&#39;intérêt 11) et prendre le surnageant retroviral à partir des cellules 293T à la transduction de la lignée cellulaire productrice GP + E86 écotrope rétroviral. </li><li> Isoler le top 40% des cellules exprimant la production GP + E86 fluorescentes par FACS et propager les cellules productrices + E86-GP transdcuced comme source de virus. NOTE: La générationproducteurs à titre élevé de est essentielle pour la transduction efficace de cellules de moelle osseuse. Pour un protocole complet s&#39;il vous plaît voir Holst et al. 11 </li></ol></li></ol> 3. retrovirus transfert de cellules souches Gene (Jour -5) <ol><li> Dégeler et culture 0.5 -1.0 x 10 6 de chaque lignée cellulaire productrice GP + E86 dans DMEM complet à 10% (vol / vol) FBS pour permettre une croissance suffisante pour deux confluentes plaques de 150 mm par jour 0 de ce protocole. NOTE: Dégel 0,5 à 1,0 x 10 6 de chaque lignée cellulaire productrice GP + E86 dans une plaque de 10 cm permettra 30 - 50% de confluence au jour 5. Cela permet également de 5 jours de culture en vue d&#39;élargir le GP + E86 lignées cellulaires de production à deux confluentes plaques de 150 mm par jour 0. <ol><li> Culture de la lignée cellulaire productrice rétrovirale dans un milieu complet de culture de tissu contenant 5% de sérum de veau féta, et la ciprofloxacine (10 pg / ml) afin d&#39;éviter une contamination par des mycoplasmes. NOTE: Cesser l&#39;utilisation de la ciprofloxacine lorsque generating surnageant viral pour la transduction de la moelle osseuse. Évitez de trop-croissance de la lignée cellulaire productrice, car cela aura un impact négatif de la moelle osseuse efficacité de transduction. </li></ol></li></ol> 4. Les souris donneuses Inject avec 5-fluorouracile (5-FU) (Jour -3) <ol><li> Peser les souris donneur (5 - 12 semaines) pour déterminer la quantité de 5-FU nécessaire. En utilisant des souris de moins de 5 semaines de résultats d&#39;âge faible rendement de la moelle osseuse. Pour assurer l&#39;expression d&#39;un seul TCR, utiliser une souche de souris déficiente des lymphocytes T tels que SCID, RAG ou TCR alpha souris déficientes en tant que donneurs de moelle osseuse. </li><li> Travailler dans le tissu de la culture hotte, diluer le stock 5-FU avec du PBS stérile afin d&#39;obtenir une quantité suffisante de 10 mg ml -1 solution de travail de 5-FU pour fournir 0,15 mg 5-FU par gramme de poids corporel. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 37 G, intraperitoneale injectent 0,15 mg de 5-FU par gramme de poids corporel par souris donneuse. REMARQUE: Utilisez la souris 1 donneur par un destinataire pour démarrer et réglerle nombre de souris donneuses en fonction du rendement de la cellule. Une autre méthode pour le traitement 5-FU pour l&#39;enrichissement et l&#39; isolement de progéniteurs de moelle osseuse est la sélection négative de cellules positives de la lignée , comme décrit dans Viret et al. </li></ol> 5. Bone Marrow Procédure d&#39;extraction (jour 0) <ol><li> Obtenir des ciseaux de dissection et des pinces pour l&#39;isolement de l&#39;os. Préparer les supports (HBSS additionné de 5% de SVF (v / v)) pour recueillir des os dans un tube conique de 50 ml. Gardez 50 ml conique contenant des médias sur la glace. Euthanasier souris par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale pour confirmer la mort. Pincez patte pour assurer qu&#39;aucun réflexes sont détectés. </li><li> Stériliser le site chirurgical et des outils chirurgicaux avec l&#39;éthanol ou le méthanol. Retirez le fémur, le tibia, l&#39;humérus, et la ceinture pelvienne avec soin par la première découpe et sous la ceinture pelvienne. Coupez le long du fémur au tibia. Retirez tous les tissus environnants en utilisant des ciseaux et des pinces pour obtenir des os propres. Garderos hydratés dans HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. </li><li> Séparer les os en coupant au niveau des articulations, en veillant à couper les deux extrémités de chaque os. Insérer une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue de 10 ml contenant du HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. Appliquer une pression et rincer toute la moelle osseuse à travers une passoire de repos de 70 pm dans un 50 ml conique. </li><li> Périodiquement, pousser la moelle osseuse à travers le filtre de 70 um en utilisant le piston d&#39;une seringue de 1 ml ou 3 ml. Rincer le filtre avec du HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. Ceci assurera une suspension cellulaire unique qui est exempte de fragments osseux et des tissus. Gardez les cellules stériles en effectuant la procédure dans une hotte stérile. </li><li> cellules de moelle osseuse centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li></ol> 6. moelle osseuse Culture (jour 0) <ol><li> Décanter ou aspirer les médias et culot cellulaire de remettre en suspension dans 1 ml de tampon d&#39;ammonium à base de chlorure de lyse des globules rouges (ou équivalent RBC tampon de lyse) par 50 ml tube conique. Après 1 min d&#39;incubation à la chambrela température, la trempe le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 10 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter ou aspirer le surnageant et remettre en suspension la moelle osseuse dans 5 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS. Compter les cellules avec une chambre de comptage de Neubauer. NOTE: le rendement général devrait être d&#39; environ 5 à 10 x 10 6 cellules par souris; cependant, le rendement peut varier entre les différentes souches de souris. </li><li> Les cellules plaque de la moelle osseuse à une densité de 4 x 10 7 cellules par plaque de 150 mm dans 30 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS supplémenté avec de l&#39; IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml -1) et SCF (50 g ml -1). REMARQUE: Utilisez des cytokines fraîchement décongelé-aliquotées. Ne pas utiliser de cytokines qui ont été congelés et décongelés plus d&#39;une fois ou conservés à 4 ° C pendant plus de 2 semaines. </li><li> Incuber la moelle osseuse pendant une nuit (environ 24 heures) à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol><ol><li> La plaque 3 x 10 6 cellules productrices rétrovirales par plaque de 150 mm dans 18 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS. </li><li> Incuber des cellules productrices de retrovirus à 37 ° C pendant une nuit. Anticiper une plaque de 150 mm pour 15 millions de cellules de moelle osseuse (environ 2 - 3 des souris donateurs). </li></ol> 8. rétrovirale Surnageant (Jour 1) <ol><li> Le lendemain (environ 24 heures plus tard), récolter le surnageant retroviral à partir des plaques de producteurs (mis en place à l&#39;étape 7) en élaborant le surnageant retroviral directement sur la plaque de 150 mm avec une seringue de 10 ml et le filtre en utilisant un 0,45 filtre seringue -μm. </li><li> Replacez soigneusement le surnageant retroviral enlevé avec 18 ml de DMEM complet frais de 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Compléter le surnageant retroviral filtré avec de l&#39; IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) et de bromure d&#39; hexadiméthrine (polybrène) (6 &amp;# 956; g ml -1). REMARQUE: le bromure d&#39;hexadiméthrine devrait être fraîche tous les 2 mois pour éviter une baisse de l&#39;efficacité de la transduction rétrovirale. </li></ol> 9. Bone Marrow Harvest (Jour 1) <ol><li> Après avoir terminé l&#39;étape 8.3, récolter les cellules de la moelle osseuse de l&#39;étape 6.4 et transférer les médias contenant des cellules non-adhérentes dans des tubes de 50 ml stériles. </li><li> Laver les plaques vigoureusement avec 10 ml de PBS et de recueillir dans les 50 ml conique de l&#39;étape 9.1. Si nécessaire, répéter l&#39;étape de lavage. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, transvaser le surnageant, remettre les cellules dans un petit volume (1 - 3 ml) de DMEM complet 20% (vol / vol) de FBS, et compter. Anticiper 50-75% de récupération du jour 0. Resuspendre la moelle osseuse à 1 x 10 6 cellules par 1 ml du surnageant retroviral contenant des cytokines et le bromure de Hexadimethrine. </li></ol> 10. Bone Marrow transduction (Jour 1) <ol><li> Plaque rétroviral surnageant / os marrow mélange à un volume de 3 ml par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits. Envelopper les plaques dans une pellicule de plastique pour minimiser les échanges gazeux au cours de la centrifugation à l&#39;étape 10.2. </li><li> Faites tourner les plaques à six puits emballés à 1000 xg pendant 60 min à 37 ° C. </li><li> Après le spin est terminée, retirez la pellicule de plastique et placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C CO 2 pendant 24 heures. </li></ol> 11. rétrovirale Surnageant et transduction (Jour 2) <ol><li> Après 24 h, de recueillir surnageant viral frais à partir de la lignée cellulaire productrice virale. Filtrer le surnageant retroviral en utilisant une seringue de 10 ml et un filtre à seringue de 0,45 um. Compléter le surnageant filtré rétrovirale avec l&#39; IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml - 1) et du SCF (50 g ml - 1) et de bromure d&#39; hexadiméthrine (6 g ml -1). </li><li> Ensuite, retirez soigneusement avec une pipette ou aspirer les 2 premiers ml de milieu de chaque puits de la plaque de six puits contenant les cellules de la moelle osseuse. REMARQUE: Le travail avec soin de ne pas aspirer la moelle osseuse, ce qui est généralement concentrée dans le milieu du puits. En variante, le surnageant a été retiré peut être centrifugé pour récupérer toutes les cellules de la moelle osseuse perdus. </li><li> Pour chaque puits dans la moelle osseuse plaque de 6 puits ajouter 3 ml de surnageant contenant des cytokines virales fraîches et le bromure de Hexadimethrine. Envelopper les plaques en plastique, et répéter la transduction de spin à 1000 xg pendant 60 min à 37 ° C. Déballer les plaques et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant une nuit (environ 24 heures). </li></ol> 12. Ajout de frais supplémenté DMEM (Jour 3) <ol><li> Après 24 heures, retirer les 2 premiers ml de milieu de chaque puits de la plaque de six puits contenant les cellules de la moelle osseuse, comme dans l&#39;étape 11.2. Remplacer le support enlevé avec du DMEM frais à 20% (volume / volume) de FBS supplémenté avec des concentrations finales de l&#39; IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml - 1) et du SCF (50 g ml -1) . </li><li> Incuber la moelle osseuseles plaques à 37 ° C incubateur à CO2 pendant 24 h. </li></ol> 13. Récolte transduites moelle osseuse (Jour 4) <ol><li> Au bout de 24 h, recueillir les cellules de la moelle osseuse provenant des plaques à six puits. Laver les plaques vigoureusement avec du PBS pour éliminer toutes les cellules non-adhérentes. <ol><li> Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C, puis décanter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension la moelle osseuse dans un petit volume (1 ml) de PBS + 0,5% (volume / volume) de FBS inactivé à la chaleur. Gardez les cellules sur la glace. </li></ol></li><li> Prenez un échantillon de 10 pi de chaque état de la moelle osseuse et de compter les cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer. En supposant que 1 - 2 donateurs par bénéficiaire, le rendement sera suffisant pour transférer au moins 4 x 10 6 cellules par souris receveuse. Remettre en suspension la moelle osseuse dans un volume suffisant de PBS + 0,5% (volume / volume) de FBS inactivé à la chaleur à injecter 200 - 300 ul par souris. <ol><li> Injecter au moins 2 x 10 6 cellules avec une efficacité de transductionde 25% (peut injecter jusqu&#39;à 8 x10 6 cellules) par souris par voie intraveineuse. REMARQUE: On injecte régulièrement cinq souris receveuses par deux plaques de cellules de moelle osseuse à 6 puits. Si le rendement est nettement plus faible, plus les souris donneuses doivent être utilisées jusqu&#39;à ce que le nombre de moelle osseuse suffisante peut être obtenue. Afin de parvenir à une reconstitution optimale, au moins 5 x 10 5 transduction (fluorescente positive) doit être injecté dans chaque destinataire. </li></ol></li><li> Avec un micro - pipette, prélever un échantillon de 10 pi de chaque état ​​de la moelle osseuse et d&#39; analyser l&#39; efficacité de transduction par cytométrie de flux basé sur l&#39; expression du marqueur fluorescent (figure 1A) 11. NOTE: En règle générale, le pourcentage de cellules positives fluorescentes est comprise entre 25% et 70%, en fonction de la construction et le titre retroviral. Le nombre de cellules de moelle osseuse transduites nécessaires pour reconstituer une souris sublétales irradier peut varier en fonction de l&#39;efficacité de transduction. Plus le tranl&#39;efficacité sduction, les cellules de la moelle osseuse plus nécessaire et, inversement, plus l&#39;efficacité de transduction de la moelle osseuse, la diminution du nombre de cellules nécessaires pour la reconstitution. L&#39;efficacité de transduction inférieure à 25% est sous-optimale et peut conduire à une reconstitution insuffisante et la survie. Afin d&#39;assurer la récupération de la moelle osseuse optimale et l&#39;efficacité de la transduction, utiliser les médias et les cytokines de culture de tissus fraîchement préparés. Lors de l&#39; expression d&#39; un nouveau TCR utilisant le système retrogenic, la sélection de ce TCR in vivo est inconnu. En fonction de chaque individu TCR à affinité, la sélection du TCR dans le thymus et l&#39; expression périphérique de lymphocytes T variera 17. </li></ol> 14. Souris Irradiation, moelle osseuse Injection et des Soins <ol><li> Irradiation des souris le jour avant l&#39;injection de moelle osseuse (même jour que l&#39;étape 13). Utilisez les doses suivantes: C57BL / 6 souris (et d&#39; autres souches de type sauvage), 900 rads; Rag1 - / - souris, 500 rads, des souris SCID, 300 rads). <ol><li> souris Lieu bénéficiaires sur amoxicilline (50 mg / kg / jour) ou un autre traitement antibiotique de l&#39;eau avant l&#39;irradiation, et de garder des antibiotiques pour les deux premières semaines après l&#39;injection de moelle osseuse. NOTE: La dose d&#39;irradiation optimale peut être déterminée de manière empirique. </li></ol></li><li> Pour l&#39;injection, charger les cellules de l&#39;étape 13.1 dans une seringue de 1 ml en utilisant des aiguilles émoussées immédiatement avant injection, puis changer l&#39;aiguille de calibre 27 pour l&#39;injection, expulser l&#39;air pour éviter une embolie gazeuse. Des souris thermique sous une lampe chauffante et injecter 0,2 ml de moelle osseuse de souris par voie intraveineuse. REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sont assis dans la seringue pour toute longueur de temps ou les cellules se déposent. </li><li> Surveiller les souris chaque semaine pour veiller à ce qu&#39;ils restent en bonne santé. </li><li> Après 5 - 6 semaines saigner les souris pour vérifier la reconstitution sur la base de la GFP + / amétrine + et TCR co-expression (figure 1B) 11. </li></ol>

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<li>Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+models+to+study+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse models to study human diseases.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).</li>
<li>Chaplin, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+interleukin-12+as+a+self-processing+2A+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide.</a> J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).</li>
<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans le protocole, nous détaillons plusieurs étapes essentielles pour assurer la santé de la moelle osseuse optimale, l&#39;efficacité de la transduction et la reconstitution. Première étape critique est la génération et le bon entretien des cellules productrices virale GP + E86. Utiliser des lignées de cellules productrices de passages précoces et maintenir à 80% de confluence ou plus bas avant l&#39;utilisation. Lors de cellules productrices virale GP + E86 frais, assurer que les cellules 293T sont passage précoce et ...

Récepteur des cellules T (TCR) de répertoire humain et la souris a été estimée à 1 x 10 8 et 2 x 10 6 RLT uniques respectivement 1,2. Cette grande diversité permet aux cellules T de reconnaître une vaste gamme d&#39;épitopes d&#39;antigènes dérivés d&#39;auto-peptides, ainsi que des agents pathogènes présentés par le complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) sur les cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC). Les différences subtiles dans les interactions des RLT uniques avec des complexes peptide-CMH déterminent si une cellule T subira l&#39;apoptose, l&#39;anergie, l&#39;activation, la différenciation, la production de cytokine ou la cytotoxicité. Toutefois, en raison du grand répertoire de TCR, l&#39;analyse de la façon dont un TCR spécifique de répondre à un antigène particulier nécessite l&#39;utilisation de systèmes de TCR unique. Diverses souris transgéniques TCR ont été générés dans le but d&#39;étudier la fonction d&#39;un seul TCR dans un modèle in vivo 3-9. Cependant, il existe des réserves de TCR des souris transgéniques, y compris lale coût, la durée de temps pour générer une seule souris transgénique et le soi - disant effet fondateur d&#39;insertion du transgène aléatoire dans l&#39; ADN de la lignée germinale 10. Par conséquent, relativement peu de souris transgéniques TCR ont été générées pour tout antigène donné et les implications fonctionnelles de haute affinité et une faible TCR pour le même épitope sont rarement pris en compte. Pour répondre à la nécessité d&#39;une approche rapide à l&#39; écran et d&#39; étudier plusieurs TCR individuellement ou en combinaison, les souris retrogenic ( «rétro» de retrovirus et &#39;géniques&#39; de transgéniques) ont été utilisés comme une alternative à TCR des souris transgéniques 11-13. Le motif consensus 2A peptide trouvés dans plusieurs virus sont constitués par un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, dans laquelle le clivage se produit entre la glycine, de la figure 2A et la proline de la figure 2B de l&#39;activité hydrolase de cis, ce qui entraîne le saut du ribosome pendant la traduction 10,14-16. Pour un diagramme détaillé représentant la cleavage des différents peptides 2A (F2A, E2A, T2A et P2A) s&#39;il vous plaît se référer aux références 10 - 12. De cette manière, 2 cistrons (TCR alpha et TCR bêta) peuvent être liés résultant en traduction stoechiométrique dans un seul vecteur. En utilisant cette approche, nous sommes en mesure d&#39;exprimer et de comparer directement plusieurs TCR spécifiques de l&#39; antigène in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose + glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Modification de Dulbecco du milieu d’Eagle avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &#181 ; Filtre à seringue Thermo</td><td>Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrène</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Stérile Filtré en dH2O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracile (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire 150 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue culture plaque plate 6 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &#181 ; crépines à cellules en nylon Falcon</td><td></td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 Humain</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; </td><td></td>PHC0063</tr><tr><td>Facteur de cellules souches de souris</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>Tampon HANKS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml Seringue</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Aiguille de glissement de précision</td><td>BD</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>Aiguille de glissement de précision 30 g x 1/2 BD</td><td>305106</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules t receptor retrogenic souris

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

<classe p = jove_content'> la signalisation du récepteur des lymphocytes T (TCR) est essentielle dans le développement et la différenciation des lymphocytes T dans le thymus et la périphérie, respectivement. La vaste gamme de TCR rend difficile l’étude d’une réponse antigénique spécifique. Par conséquent, des souris transgéniques TCR ont été conçues pour étudier la sélection positive et négative dans le thymus ainsi que l’activation, la prolifération et la tolérance des lymphocytes T périphériques. Cependant, relativement peu de souris transgéniques TCR spécifiques à un antigène donné ont été générées. Ainsi, il n’y a pas eu d’études portant sur des TCR d’affinités variables pour le même peptide antigénique. La génération d’une nouvelle lignée transgénique TCR peut prendre six mois ou plus. De plus, tout rétrocroisement spécifique peut prendre six mois supplémentaires. Afin de permettre une génération et un criblage plus rapides de plusieurs TCR, un protocole de transduction rétrovirale de la moelle osseuse a été établi avec l’expression stœchiométrique des chaînes TCRα et TCRβ et la génération de souris rétrogéniques. Chaque souris rétrogénique est essentiellement une souris, ce qui annule pratiquement un effet fondateur, tandis que la durée de génération d’un TCR rétrogénique est réduite de six mois à environ six semaines. Nous présentons ici une alternative rapide et flexible aux souris transgéniques TCR qui peut être exprimée sur n’importe quel fond choisi avec n’importe quel TCR particulier.

Os efficacité de transduction de la moelle est vérifiée à l&#39; étape 13.3 du protocole avant la moelle osseuse est injecté dans la veine caudale iv Dans le représentant de la moelle osseuse transduction figure (figure 1A), environ 10 pi de l&#39;os récolté osseuse a été ajouté à 100 pi de PBS et analysés pour l&#39;expression amétrine. En général, le pourcentage de cellules positives fluorescentes est comprise entre 25% et 70%, en fonction de la construction et le titr...

Nous présentons un protocole rapide et flexible pour un système d’expression in vivo basé sur un seul récepteur de cellules T (TCR). Les vecteurs rétroviraux sont utilisés pour transduire les cellules progénitrices de la moelle osseuse afin d’étudier le développement des lymphocytes T et la fonction d’un seul TCR in vivo comme alternative aux souris transgéniques TCR.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

L'objectif de cette procédure est de générer des souris rétrogéniques afin de déterminer la fonction in vivo de plusieurs récepteurs des cellules T. Ceci est réalisé en utilisant un vecteur rétroviral qui code pour les chaînes alpha et bêta du récepteur des cellules T, reliées par un motif consensus de peptide 2A. Cette méthode peut effectivement aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, car en criblant plusieurs TCR spécifiques de plusieurs antigènes, il est possible de déterminer leur fonction in vivo.Le principal avantage de cette technique est qu'une fois le vecteur rétroviral construit, le compartiment des lymphocytes T des souris rétrogéniques sera reconstitué en environ sept semaines. De plus, chaque souris rétrogénique est essentiellement une souris fondatrice, ainsi, en analysant plusieurs souris, l'effet fondateur est éliminé. Cette étape de la procédure sera démontrée par le Dr Maria Bettini.Préparer l'extraction de la moelle osseuse en plaçant des ciseaux et une pince de dissection stériles dans la zone chirurgicale et en refroidissant le milieu de dissection dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Après avoir euthanasié la souris et confirmé le décès par dislocation cervicale, utiliser les ciseaux de dissection pour inciser vers le haut puis en dessous du bassin afin de l'extraire. Ensuite, couper vers le bas le long du fémur jusqu'au tibia et retirer soigneusement le fémur, le tibia et l'humérus.Transférez les os dans une boîte contenant du milieu de dissection sous la hotte de culture tissulaire et utilisez des ciseaux et une pince pour retirer tous les tissus environnants afin d'obtenir des os propres. Séparez les os en coupant au niveau des articulations, en veillant à couper les deux extrémités de chaque os. Ensuite, insérez une aiguille de 25 gauge fixée à une seringue de 10 millilitres contenant du milieu de dissection dans un os.Appliquer une pression et faire passer toute la moelle osseuse à travers un tamis de 70 microns placé dans un tube conique de 50 millilitres. Périodiquement, pousser la moelle osseuse à travers le filtre de 70 microns à l’aide du piston d’une seringue d’un millilitre et rincer le tamis avec du milieu. Centrifuger la suspension de cellules uniques de moelle osseuse à 300 ×g pendant 10 minutes à 4 °C.Après la centrifugation, décantez ou aspirez le milieu et resuspendez chaque culot cellulaire dans un millilitre de tampon de lyse des érythrocytes à base de chlorure d'ammonium. Incubez à température ambiante pendant une minute. Ensuite, arrêtez la lyse des érythrocytes en ajoutant 10 millilitres de milieu de culture, puis centrifugez comme précédemment.Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre la moelle osseuse dans cinq millilitres de milieu de mise en culture et effectuer un dénombrement cellulaire à l’aide d’une chambre de comptage de Neubauer. Le rendement doit être d’environ cinq à dix fois dix puissance six cellules par souris, mais il peut varier selon les souches. Ajouter 30 millilitres de milieu de mise en culture, supplémenté avec l’IL-3, l’IL-6 et le SCF récemment décongelés, à des plaques de culture tissulaire de 150 millimètres.Ensuite, ajoutez quatre fois dix puissance sept cellules de moelle osseuse à chaque plaque et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. La démonstration de cette étape de la procédure sera effectuée par Thomas Lee. Ensuite, mettez en culture trois fois dix puissance six cellules productrices de rétrovirus dans des plaques de 150 millimètres contenant 18 millilitres de milieu de mise en culture.Incuber les cellules productrices de rétrovirus toute la nuit. Le jour suivant, utiliser une seringue de 10 millilitres et un filtre de 0,45 micron pour récolter et filtrer le surnageant rétroviral provenant des plaques de production. Remplacer soigneusement le surnageant rétroviral éliminé par 18 millilitres de milieu de mise en culture frais.Supplémentez le surnageant rétroviral filtré avec l'IL-3, l'IL-6, le MSCF et le bromure d'hexadiméthrine. Ensuite, passez à la récolte des cellules de moelle osseuse en transférant d'abord le milieu contenant les cellules non adhérentes dans un tube stérile de 50 millilitres. Puis lavez vigoureusement la plaque avec 10 millilitres de PBS et ajoutez ce liquide au tube conique de 50 millilitres.Après avoir centrifugé les cellules à 300 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, décantez le surnageant, puis resuspendez les cellules dans un à trois millilitres de milieu de mise en culture. Après avoir effectué un dénombrement cellulaire, placez les cellules de moelle osseuse dans le milieu. Ensemencez ce mélange cellulaire à un volume de trois millilitres par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits.Enveloppez les plaques contenant les cellules de moelle osseuse dans du film plastique afin de minimiser les échanges gazeux, puis centrifugez les plaques à 1 000 × g pendant 60 minutes à 37 °C. Une fois la centrifugation terminée, retirez le film plastique et placez les plaques dans un incubateur à dioxyde de carbone à 37 °C pendant 24 heures. Après 24 heures, récupérez le surnageant viral frais à partir de la lignée cellulaire productrice de virus.À ce stade, les cellules doivent être bien espacées et présenter une morphologie caractéristique. Ensuite, aspirez soigneusement les deux millilitres supérieurs de milieu dans chaque puits de la plaque à six puits contenant les cellules de moelle osseuse. Évitez d'aspirer les cellules de moelle osseuse, qui sont généralement concentrées au centre du puits.Ajoutez trois millilitres de surnageant viral fraîchement supplémenté dans chaque puits de la plaque à six puits contenant les cellules de moelle osseuse. Après avoir enveloppé les plaques dans du plastique, comme précédemment, répétez la transduction par centrifugation, puis placez les plaques déballées dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 24 heures, au jour trois, retirez et remplacez deux millilitres de milieu dans les puits.Le quatrième jour, recueillir les cellules de la moelle osseuse à partir de la plaque à six puits en lavant vigoureusement avec du PBS, puis recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Après centrifugation des cellules à 300 × g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, décanté le surnageant et resuspendre la moelle osseuse dans un millilitre de PBS contenant 0,5 pour cent de FBS inactivé par la chaleur. Placer le tube contenant les cellules sur de la glace.Ensuite, après avoir effectué un dénombrement cellulaire, resuspendre la moelle osseuse dans un volume suffisant de PBS contenant 0,5 pour cent de FBS inactivé par la chaleur, afin d'injecter au minimum deux fois 10 à la puissance six cellules dans un volume de 200 à 300 microlitres par souris. Enfin, à l’aide d’une micropipette, prélever un échantillon de 10 microlitres de chaque condition de moelle osseuse et l’ajouter à 100 microlitres de PBS pour analyser l’efficacité de transduction par cytométrie en flux. L’efficacité de transduction des cellules de la moelle osseuse a été analysée en fonction du marqueur fluorescent amétrine.Le panneau de gauche montre la diffusion avant et latérale des cellules de la moelle osseuse après cinq jours de culture. Le panneau de droite est défini sur les cellules ametry négatives et inclut les cellules de la moelle osseuse transduites. Une transduction réussie de la moelle osseuse donnera un pourcentage de cellules positives fluorescentes compris entre 25 et 70 pour cent.Cette image montre des lymphocytes T rétrogéniques porteurs du récepteur des lymphocytes T dans le sang périphérique six semaines après la reconstitution de la moelle osseuse. Après lyse des hématies, les cellules restantes ont été marquées pour le récepteur bêta des lymphocytes T. Le panneau de droite présente une analyse représentative de l'expression d'amétrine et de l'anticorps anti-récepteur bêta des lymphocytes T.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transduire de façon rétrovirale et cultiver des cellules de moelle osseuse afin de régénérer des souris rétrogéniques.

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JoVE Journal

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Cette technique démontre d'une manière efficace de se préparer à réplication déficiente stocks rétroviraux codant pour une oncogène humain, et par la suite utilisé pour l'induction de syndromes myéloprolifératifs dans le modèle murin.

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Nous démontrons ici que la reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) peut être utilisé comme un outil pour générer des modèles de souris avec des pré-définis récepteur des cellules T (TCR) des spécificités. Ces souris Transnuclear exprimer la correspondante du TCR de leur locus endogène, sous le contrôle du promoteur endogène.

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Ici, nous décrivons une méthode pour la surexpression rétrovirale et le transfert adoptif des cellules murines B-1a pour examiner in vivo la migration et la localisation de cellules de B-1a. Ce protocole peut être étendu pour divers essais fonctionnels en aval, y compris la quantification de la localisation de cellules B-1a du donneur ou l’analyse des facteurs sécrétés dérivés de cellules de donneurs après le transfert d’adoption.

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Découvrez la transduction rétrovirale des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des souris rétrogéniques TCR. Cette méthode permet d'étudier la fonction in vivo de multiples récepteurs des cellules T en immunologie.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

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