Complexe de polyélectrolyte pour Heparin Binding Domain Growth Factor ostéogénique Livraison

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer une couche de complexation de polyélectrolyte. Un vecteur qui peut piéger et réguler la libération d’un large éventail de facteurs de croissance avec un domaine de liaison à l’héparine. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire orthopédique pour un piégeage efficace et une livraison de facteurs de croissance dédiés.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas souvent l’utilisation de produits organiques. Ce qui est connu pour affecter les activités biologiques des facteurs de croissance. Dissoudre 200 milligrammes d’alginate de sodium non irradié ou 400 milligrammes d’alginate de sodium irradié dans 10 millilitres d’eau distillée doublement.

Et secouez pendant une heure. Conservez la solution d’alginate à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Filtrez la solution d’alginate à l’aide d’un filtre à seringue stérile de 0,2 micron avant la fabrication des microbilles d’alginate.

Désinfectez le générateur électrostatique d’EB et la pompe à seringue avec de l’éthanol à 70 % et placez-les dans une enceinte de sécurité biologique de classe deux. Placez ensuite une bassine en verre avec une barre d’agitation magnétique à l’intérieur du générateur BE. Placez l’électrode du bras du générateur BE à neuf centimètres au-dessus du bassin.

Connectez le câble d’électrode du générateur BE à la vis neuro deux de l’électrode du bras. Et versez 80 millilitres de solution de chlorure de strontium dans le bassin. Ensuite, chargez cinq millilitres de solution d’alginate filtrée de 0,2 micron dans la seringue dans un tube en caoutchouc.

Après avoir connecté le tube en caoutchouc à l’électrode du bras, allumez la pompe à seringue à cinq millilitres par heure. Pendant deux minutes. Pour expulser l’air à l’intérieur du tube et délivrer la solution d’alginate à l’extrémité de la buse.

Ensuite, éteignez le pousse-seringue. Pour commencer la génération de microbilles, réglez l’encapsulateur sur 5,8 kilovolts. Suivi par la pompe à seringue à un débit d’alginate de cinq millilitres par heure.

Jetez les microbilles générées pendant les deux premières minutes car ces microbilles ont tendance à être de taille et de forme irrégulières. Prélever les microbilles suivantes dans la solution de chlorure de strontium à 0,2 molaire. Éteignez le pousse-seringue puis l’encapsulateur.

Après avoir pompé le volume pré-planifié de solution d’alginate. Répétez cette opération pour les lots suivants de fabrication de microbilles. Conservez les microbilles dans 20 millilitres d’une solution de chlorure de strontium à 0,2 molaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour compléter la réticulation et stabiliser le gel.

Prélever 0,5 millilitre de microbilles d’alginate à l’aide d’une pipette en plastique. Et placez-le sur une diapositive en verre. Observez les microbilles au microscope optique à un grossissement de 10x.

Prenez 10 images des microbilles avec une caméra CCD microscope. Enregistrez les images avec une barre à l’échelle de 500 microns au format TIFF à une résolution de 2048 par 1536. À l’aide des outils de longueur de l’image J, mesurez la taille des microbilles.

Et la barre d’échelle. Convertissez ensuite la longueur des microbilles de pixels en micromètres. Cliquez sur les outils de ligne et tracez une ligne au milieu de la perle d’alginate.

Cliquez sur Analyser dans la barre de menu et sélectionnez Mesurer. Une fenêtre contextuelle apparaîtra. Répétez ces étapes pour mesurer toutes les billes d’alginate dans l’image.

Mesurez la barre d’échelle sur l’image. Prélevez les microbilles à l’aide de la passoire en nylon de 100 microns. Et lavez les perles avec de l’eau distillée doublement.

À l’aide d’une spatule, transférez toutes les microbilles constituées de 0,1 millilitre de solution d’alginate dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres et couvrez-le de gaze pour éviter le dessèchement. Enfin, stérilisez les microbilles par clivage automatique en mode liquide ou conformément aux spécifications du fabricant. Ajoutez 1,5 litre d’eau distillée dans la chambre pour éviter que les billes ne sèchent.

À l’intérieur de la hotte BSL2, incubez les microbilles stériles avec un millilitre de solution de protamine stérilisée à deux milligrammes par millilitre pendant une heure à température ambiante. Lavez les microbilles enrobées de protamine deux fois avec de l’eau distillée deux fois. Ensuite, tournez vers le bas, à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 200 fois G pendant trois minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, aspirez l’eau à l’aide d’une seringue. Incuber des microbilles enrobées de protamine avec un millilitre de solution d’héparine stérilisée à 0,5 milligramme par millilitre pendant 30 minutes. Cela crée une coquille de complexation polyélectrolytique avec une affinité avide pour les facteurs de croissance liant l’héparine.

Après l’incubation, aspirez l’héprain à l’aide d’une seringue. Et lavez l’héparine non liée des complexes polyélectrolytiques en lavant deux fois avec de l’eau distillée doublement. Chargez 13,3 microlitres de 1,5 milligramme par millilitre de protéine morphogénétique osseuse 2 ou de molécule semblable à NELL 1 sur 100 microgrammes du complexe polyélectrolytique.

Incuber le complexe polyélectrolytique à quatre degrés Celsius sous 30 tr/min, en agitant pendant 10 heures. Ensuite, plongez les microbilles dans un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, à 37 degrés Celsius en secouant constamment. Prélevez un millilitre de surnageant et remplacez-le par un millilitre de PBS après un, trois, six, 10 et 14 jours.

Évaluer l’efficacité de l’absorption et de la libération de la molécule NELL à l’aide de la méthode de dosage des protéines CBQCA selon le protocole du fabricant. Vous pouvez également effectuer l’application elisa. La bioactivité de la molécule NELL libérée par le complexe polyélectrolytique est évaluée en mesurant sa capacité à augmenter l’expression de la phosphatase alcaline dans les cellules souches de la moelle osseuse de lapin.

Semez 20 000 cellules souches de moelle osseuse de lapin par puits dans une plaque de 24 puits. Et laissez-les grandir pendant une journée avec un millilitre de milieu d’aigle modifié de dulbecco plus 10 % de sérum bovin fœtal à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après 24 heures, remplacez le milieu par un millilitre d’un milieu ostéogénique pendant sept jours à 37 degrés Celsius.

Et 5 % de CO2. Placez 300 microgrammes de complexe polyélectrolytique et de molécule de type complexe polyélectrolytique NELL à l’intérieur d’inserts de culture cellulaire pour garder les complexes séparés des cellules. Placez l’insert dans la plaque à 24 puits pour éviter le lavage des microbilles du complexe polyélectrolytique lors du changement de milieu ostéogénique.

Une fois tous les trois jours, aspirez un millilitre de milieu ostéogène en plaçant une aiguille à l’extérieur de l’insert. Et remplacez par un millilitre de milieu ostéogénique frais. Après sept et 14 jours d’incubation, déterminer l’activité de la phosphatase alcaline à l’aide d’un kit de dosage de la phosphatase alcaline.

Conformément au protocole du fabricant du kit. Empaquetez les complexes polyélectrolytiques dans les pores d’un échafaudage de polycaprolactone triphosphate calcique de qualité médicale biorésorbable. À l’aide d’une spatule stérilisée à l’intérieur d’une chambre BSL2.

Ajoutez une solution de 1,5 milligramme ou millilitre de protéine morphogénétique osseuse deux ou de molécule semblable à NELL sur l’échafaudage rempli de complexe polyélectrolytique. Et incuber toute la nuit à 4 degrés Celsius. Les microbilles d’alginate sont inspectées au microscope afin de surveiller leur taille et leur morphologie.

Les microbilles d’alginate non irradiées sont sphériques et la contrepartie irradiée est en forme de larme. La distribution granulométrique est un facteur important de l’absorption des facteurs de croissance. Et la réduction de la taille augmente le rapport surface/surface.

Lorsque l’on mesure des microbilles d’alginate à l’aide du logiciel image J, une moyenne de 100 microbilles fournit une bonne estimation de la distribution granulométrique dans chaque correspondance de microbilles. Étant donné que l’absorption du facteur de croissance dépend d’une technique de revêtement appropriée, l’épaisseur de la couche de chaque revêtement est observée par microsopie confocale. Ici, des images microsopiques confocales à balayage laser de microbilles d’alginate incubées avec des analogues fluorescents de protamine, d’héparine, de la molécule un de type NELL et de la protéine morphogénétique osseuse deux sont présentées.

L’activité alcaline de la phosphatase est utilisée pour mesurer la bioactivité du facteur de croissance libéré. Une augmentation de 2,2 fois de l’activité de la phosphatase alcaline a été observée après l’incubation avec une molécule de type NELL complexe polyélectrolytique le premier jour 14. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler que les concentrations d’alginate affectent la stabilité des microbilles. Pour les alginates irradiés, nous avons exigé quatre pour cent. Pour les contreparties non irradiées, nous avons exigé deux pour cent à voies.

En suivant ces procédures, nous pouvons encore augmenter la charge du facteur de croissance par un revêtement multicouche. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire d’explorer l’administration de facteurs de croissance dans d’autres modèles de maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous êtes en mesure de fabriquer un complexe de polyélectrolytes avec une distribution de taille étroite.