Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l'étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Le but global de ce test est de déterminer les effets de traitements d'intérêt sur l'adhésion cellulaire dans des conditions de contrainte de cisaillement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des cellules immunitaires, telles que les facteurs qui régulent l'activation des intégrines. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'étudier des paires de molécules d'adhésion uniques, les intégrines, dans un système d'écoulement facilement reproductible.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'activation de LFA1, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres intégrines. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés car la mise en place technique doit être exécutée avec précision. Pour récolter les cellules CHO-ICAM, traitez la culture avec une solution de trypsine-EDTA à 0,5 % pendant une minute à température ambiante en agitant doucement.

Lorsque les cellules commencent à se détacher, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de milieu frais, puis comptez le nombre de cellules dissociées. Diluez les cellules à une concentration de 0,75 × 10⁵ cellules par chambre et centrifugez-les. Ensuite, reprenez le culot dans 30 µL par chambre d'écoulement, dans du milieu de culture complet CHO-ICAM, et semez lentement des aliquotes de 30 µL de cellules par réservoir de la chambre d'écoulement.

Laisser reposer les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter 200 microlitres de milieu de culture complet dans les deux réservoirs de chaque chambre, puis replacer la plaque dans l'incubateur pour une culture nocturne. Après la récolte des lymphocytes T, dénombrer et diluer la suspension cellulaire à une concentration de deux fois 10 à la puissance six cellules par chambre.

Ensuite, centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans un millilitre de PBS, supplémenté de 1 % de glucose par deux fois dix puissance six cellules T. Puis, marquer les cellules T dans une dilution au 1/1000 de CFSE, protégé de la lumière, pendant huit minutes à température ambiante. À la fin de l'incubation, centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans 240 microlitres de milieu RPMI sans sérum par chambre.

Ensuite, répartir les cellules dans un tube de 1,5 mL par chambre, et conserver les tubes dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius jusqu'au chargement. Avant l'acquisition d'images, préchauffer la chambre d'observation du microscope à 37 degrés Celsius, et remplir une bouteille en verre de 500 mL avec de l'eau. Percer deux orifices dans le couvercle, étiquetés entrée et sortie, puis faire passer le tuyau d'entrée reliant la seringue par l'orifice d'entrée, et le tuyau de raccordement au réservoir d'entrée par l'orifice de sortie.

Utilisez une seringue de 60 millilitres pour rincer le tuyau d'entrée avec 60 millilitres d'eau, suivis de 60 millilitres de milieu sans sérum à 37 degrés Celsius, afin d'éliminer tout air du système. Une fois le tuyau amorcé, transférez l'ensemble du dispositif d'entrée dans la chambre d'imagerie en direct du microscope pour maintenir le système à 37 degrés Celsius. Faites sortir le tuyau et la seringue de la chambre, puis placez la seringue dans la pompe à seringue.

Ensuite, faites un trou dans le couvercle d'un flacon de 250 millilitres destiné à recueillir les déchets en sortie, et passez le tube de sortie à travers ce trou jusqu'à l'intérieur du flacon. Fixez ensuite le couvercle du flacon de sortie de manière lâche et placez l'ensemble du dispositif de sortie dans la chambre d'imagerie en temps réel. Placez maintenant la lame de la chambre à flux sur la platine du microscope, puis utilisez l'objectif 20X pour régler le plan focal sur la monocouche de CHO ICAM.

Ensuite, en commençant par le témoin non stimulé, jetez trois volumes de 70 microlitres provenant du réservoir de sortie de la première chambre, puis ajoutez trois volumes de 70 microlitres de lymphocytes T marqués CFCS au réservoir d'entrée. Pendant que les lymphocytes T migrent de l'entrée vers la sortie, réalisez l'imagerie de cinq champs aléatoires de lymphocytes T positifs au CFSE dans chaque chambre afin d'obtenir les décomptes cellulaires avant l'écoulement. Ensuite, reliez simultanément les tuyaux d'entrée et de sortie aux réservoirs de la chambre d'écoulement, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air, puis démarrez l'écoulement sous contrainte de cisaillement à 0,3 millilitre par minute, tout en continuant à visualiser les lymphocytes T marqués au CFSC.

Dès que le mouvement des lymphocytes T est observé, déclenchez un minuteur de cinq minutes, puis interrompez l'écoulement à la fin de cette période. Ensuite, acquérez des images de cinq champs de cellules positives pour CFSE dans chaque chambre, en choisissant aléatoirement les champs afin d'obtenir les décomptes cellulaires post-écoulement. Pour la stimulation par PMA, stimulez un tube de lymphocytes T avec du PMA afin d'obtenir un témoin positif immédiatement avant de charger les lymphocytes T dans la seconde chambre d'écoulement pour l'acquisition d'images, comme vient d'être illustré.

Pour la stimulation par la SDF-1 alpha, retirez d'abord trois aliquotes de 70 microlitres de milieu du réservoir de sortie de la troisième chambre, puis ajoutez 70 microlitres de SDF-1 alpha dans le réservoir d'entrée. Après cinq minutes, jetez trois aliquotes de 70 microlitres provenant du réservoir de sortie, puis ajoutez le tube restant de lymphocytes T pour l'observation, comme vient de l'être démontré. Sur ces images représentatives, un nombre similaire de lymphocytes T est observé avant l'écoulement sous différentes conditions de stimulation.

Après cinq minutes de contrainte de cisaillement continue, le nombre de lymphocytes T adhérents augmente dans les conditions de stimulation par le PMA et le SDF-1 alpha, tandis que quelques lymphocytes T non stimulés restent adhérents. En effet, l'activation des lymphocytes T par le SDF-1 alpha, par exemple, induit une augmentation d'environ deux fois de l'adhésion des lymphocytes T par rapport aux cellules témoins non stimulées. De plus, lorsque l'on calcule le pourcentage d'adhésion des lymphocytes T primaires humains CD3 positifs en présence ou en absence de SDF-1 alpha, 15 % des lymphocytes T non stimulés adhèrent sous contrainte de cisaillement, contre 50 % des lymphocytes T dans les conditions d'activation par le SDF-1 alpha.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être raisonnablement étendue à six chambres expérimentales dans un seul essai. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler uniquement avec la monocouche confluente de ICAM. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'analyse de la forme des cellules, peuvent être effectuées sur les images capturées afin de répondre à des questions supplémentaires.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de quantifier l'adhérence cellulaire en condition de contrainte de cisaillement. Merci d'avoir regardé cette vidéo et bonne chance dans vos expériences.