Name: Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour létude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Apprenez à quantifier l'adhérence des lymphocytes T sous contrainte de cisaillement pour étudier l'activation des intégrines et les interactions cellulaires immunitaires. Cette méthode permet d'analyser les mécanismes moléculaires de signalisation.

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La Fondation pour la recherche en rhumatologie et le Hirschil Trust ont soutenu ce travail.

1. Placage les cellules CHO-ICAM Remarque: Le but de cette étape est de plaquer les cellules CHO-ICAM dans les chambres d&#39;écoulement pour la croissance durant la nuit dans le but de générer une monocouche confluente. <ol><li> Maintenir les cellules CHO-ICAM dans 10 cm de culture de tissus traités boîtes de culture dans 10 ml de milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (CHO-ICAM milieu de culture complet) à 37 ° C avec 5% CO 2. </li><li> Pour recueillir les cellules, ajouter 1 ml de 0,5% de trypsine-EDTA, et on incube à température ambiante pendant 1 min avec agitation douce. Neutraliser la trypsine avec 4 ml de milieu. </li><li> Compter les cellules CHO-ICAM en utilisant un hématimètre et calculer 0,75 x 10 5 cellules par chambre. Remarque: Dans cette expérience: 2,25 x 10 5 cellules seront nécessaires pour ensemencer 3 chambres. </li><li> Centrifugeuse 0,75 x 10 5 cellules CHO-ICAM par chambre pendant 5 min à 500 x g, température ambiante et à remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 pl par la chambre de CHOICAM milieu complet de culture. Remarque: Dans cette expérience, 90 pi seront nécessaires pour ensemencer 3 chambres. </li><li> ajouter lentement les cellules dans un réservoir de la chambre d&#39;écoulement. Laisser les cellules sédimenter pendant 5 min dans l&#39;incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Ajouter 200 ul de milieux de culture complets sur les deux réservoirs de chaque chambre. additions alterner entre les deux pour éviter le mouvement des cellules que le système équilibrant. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2. </li></ol> 2. Préparation des cellules T Remarque: Ce test peut être effectué avec des cellules T humaines primaires ou d&#39;une lignée de lymphocytes T. Un protocole sur l&#39; isolement à partir du sang des cellules T a été décrit précédemment. 10 Si l&#39; aide de cellules T humaines primaires utilisent des cellules fraîchement isolées pour de meilleurs résultats. Si l&#39;on utilise une lignée de cellules T, suivre le protocole de culture spécifiée par la source des cellules. Afin de détecter les cellules sur une microsco fluorescentepe les cellules T sont marquées avec un ester de succinimidyle carboxy-fluorescéine (CFSE). <ol><li> Compter les cellules T en utilisant un hématimètre et calculer 2 x 10 6 cellules par chambre. Note: Dans cette expérience, 6 x 10 6 cellules seront nécessaires pour 3 chambres. </li><li> Centrifugation de 2 x 10 6 cellules T par la chambre pendant 5 min à 500 x g, température ambiante et à remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de glucose ou 2% de FBS. </li><li> Ajouter CFSE à 1: 1000 dilution (actions faite à 5 mM). Couvrir de la lumière et incuber pendant 8 min à température ambiante </li><li> Spin à 500 xg pendant 5 min, RT. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire avec 240 pi par condition (voir la section 4 &quot;Note&quot;) de sérum manquant RPMI médiatique. Dans cette expérience, resuspendre le culot cellulaire dans 720 pi de RPMI. Diviser les cellules dans 1,5 ml vides tubes étiquetés pour chaque chambre, 240 pl par tube. Gardez les cellules dans un bloc C de chaleur 37 ° jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Mise en place d&#39;ee Input / Hosing de sortie et seringue <ol><li> Réchauffer la chambre d&#39;imagerie en direct de microscope à 37 ° C. </li><li> Préparer le tuyau d&#39;entrée: <ol><li> Remplir une bouteille en verre de 500 ml avec de l&#39;eau et faire 2 trous dans le couvercle. Marquez les trous &quot;dans&quot; et &quot;out&quot;. Ceci agira comme un bain d&#39;eau de chauffage pour le support d&#39;entrée. </li><li> Exécuter l&#39;entrée de jet d&#39; eau à travers les trous dans le couvercle et dans le bain d&#39;eau. Assurez -vous que le côté du jet d&#39; eau qui se connecte à la seringue vient à travers la &quot;dans&quot; trou et le côté qui va se connecter au réservoir d&#39;entrée vient à travers le trou &quot;out&quot;. </li><li> Rincer l&#39;entrée hosing avec 60 ml d&#39;eau pour éliminer tout l&#39; air du système. </li><li> Premier entrée hosing avec un milieu RPMI sans sérum chauffé à 37 ° C. Remplir une seringue de 60 ml et pousser à travers les médias jusqu&#39;à ce que le tuyau est complètement apprêté et sans bulles d&#39;air. Remarque: Selon le length de tube utilisé le volume requis pour amorcer variera. <ol><li> Calculer le volume de supports requis pour l&#39;expérience en multipliant le débit d&#39;écoulement (ici 0,3 ml / min) par le nombre de minutes (5 min) en fonction du nombre de chambres dans l&#39;expérience (ici 3); dans cette expérience, utiliser 4,5 ml médias. Note: Nous recommandons d&#39;avoir 5 ml de volume supplémentaire (ici un total de 9,5 ml) restant dans la seringue après l&#39;amorçage. </li></ol></li><li> Placez la configuration d&#39;entrée entière dans l&#39;enceinte de l&#39; imagerie en direct du microscope pour maintenir 37 ° C. Exécutez le tuyau et la seringue hors de l&#39;enceinte et de charger la seringue dans la pompe seringue. </li></ol></li><li> Préparer le tuyau de sortie: <ol><li> Faire un trou dans le couvercle d&#39;une bouteille de 250 ml à utiliser en tant que déchets de sortie. </li><li> Faire fonctionner le tube de sortie à travers le trou et dans la bouteille. Librement fixer le couvercle, ne pas fermer tout le chemin. </li><li> Placez la configuration de sortie dans l&#39;enceinte d&#39;imagerie en direct de la microscope. </li></ol></li><li> Calculer le débit (ml / min) nécessaire pour générer la contrainte de cisaillement souhaitée (dynes / cm2). La contrainte de cisaillement varie dans les différents compartiments vasculaires, donc prendre en compte le modèle global, y compris les types de cellules à étudier et les traitements au moment de décider sur un niveau de contrainte de cisaillement. Note: Ces expériences sont menées à 0,4 dyn / cm 2 pour imiter étroitement un cadre de petite veine. <ol><li> Prenez les dimensions de la chambre en compte lors du calcul de la contrainte de cisaillement. Utilisez la formule suivante (fournie par le fabricant 11) pour les chambres d&#39;écoulement utilisées ici (voir le tableau des matériaux): T = η * 176.1 * ø où le stress T = cisaillement, η = viscosité dynamique, ø = débit. Remarque: La viscosité dynamique du milieu RPMI à 37 ° C est de 0,007. </li></ol></li></ol> 4. Chargement des Chambres de débit et de stimulation des cellules Remarque: Afin d&#39;initier l&#39;adhésion,les cellules T doivent être stimulés. Dans l&#39;expérience suivante , les cellules seront soit rester ou non stimulées sont stimulées par SDF-1α 12 ou phorbol myristate acétate (PMA; contrôle positif) 13. Pour une bonne présentation des chimiokines à des lymphocytes T, des cellules CHO-ICAM sont préincubées avec le SDF-1α (suivie par des lavages en série), permettant la présentation sur la surface cellulaire. La PMA est un ester de phorbol qui est structurellement similaire au second messager diacyle glycérol (DAG); Ici, il est utilisé comme témoin positif. Les cellules T sont directement traitées avec du PMA avant le chargement dans la chambre d&#39;écoulement. <ol><li> Placer la lame de la chambre d&#39;écoulement sur le microscope et définir le plan focal de la monocouche des cellules CHO-ICAM en utilisant l&#39;objectif 20X. </li><li> Gardez les cellules T CFSE colorées pour toutes les autres conditions dans le bloc C de chaleur 37 °. Préparer les cellules CHO-ICAM ou T comme suit immédiatement avant l&#39;essai pour cette condition: <ol><li> Pour la condition non stimulées (chambre 1), gardez un tube / flux chambre non traité, pour servir de témoin négatif pour la stimulation. </li><li> Pour PMA stimulation (chambre 2), stimuler un tube de cellules T avec PMA (10 ng / ml) pour servir comme témoin positif; traiter immédiatement avant le chargement dans la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Pour la stimulation SDF-1α, (chambre 3), de stimuler la chambre d&#39;écoulement troisième avec le SDF-1α (100 ng / ml) en enlevant 70 ul à la fois 3 fois depuis le réservoir supérieur (réservoir de sortie), puis en ajoutant 70 ul de SDF -1α (100 ng / ml) dans le réservoir inférieur (réservoir d&#39;entrée). Incuber pendant 5 min. </li></ol></li><li> Retirer et jeter 70 pi à un moment 3 fois à partir du réservoir de sortie d&#39;une chambre. </li><li> Ajouter 70 pi de suspension pré-traitée (selon le cas) cellules T dans le réservoir d&#39;entrée 3 fois. Attendez 5 min pour permettre aux cellules de se déplacer de l&#39;entrée de la chambre ( &quot;In&quot;), et d&#39;atteindre la sortie proximale ( &quot;Out&quot;) de la chambre. </li><li> Pendant ce temps, l&#39;image 5champs pour les cellules T CFSE colorées. Choisir des champs qui sont dispersés dans tout le centre de la chambre (figure 1). Utiliser les conditions d&#39;excitation / émission suivantes: excitation longueur d&#39;onde du laser: 488 nm; émission filtre de collection: 500 - 540 nm. Ces images serviront les comptages de cellules pré-flux. </li><li> Attacher la tubulure d&#39;entrée et de sortie simultanément dans les réservoirs de la chambre d&#39;écoulement. Remarque: Fixation du tube simultanément est essentiel afin de ne pas introduire de bulles d&#39;air dans la chambre et le maintien de l&#39;équilibre global dans la chambre. </li><li> Commencez débit à 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2) tout en visualisant les cellules T CFSE colorées. Comme l&#39;écoulement commence, surtout avec la première chambre, il y a souvent un décalage entre initier l&#39;écoulement et l&#39;observation de roulement des cellules T, commencent donc le moment 5 min au début du mouvement des cellules T. </li><li> Terminate écoulement après 5 min, et l&#39;image 5 champs dans le canal CFSE. Choisissez les champs dispersés au hasard throughout le centre de la chambre d&#39;écoulement (figure 1). Ces images serviront les comptages de cellules post-flux. </li></ol> 5. Déterminer le pourcentage de cellules adhérentes Note: La détermination du nombre de cellules dans les images acquises est réalisé de manière objective avec un logiciel automatisé. Pour nos études, nous avons utilisé le logiciel Volocity (Version 6.2.1), mais d&#39;autres logiciels tels que ImageJ (version 1.48V) sont également applicables. <ol><li> Déterminer le nombre de cellules par champ pré-flux pour chaque condition. La moyenne des champs 5 est le &quot;nombre moyen des cellules pré-flux.&quot; 7 </li><li> Déterminer le nombre de cellules par champ post-flux pour chaque condition. La moyenne des champs 5 est le &quot;nombre moyen des cellules post-flux.&quot; 7 </li><li> Calculer le pourcentage de cellules adhérentes à l&#39; aide de la formule suivante: Pourcentage de cellules adhérentes = (nombre de cellules moyenne post-débit) / (nombre de cellules moyenne pré-débit) x 100%. </li></ol>

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Afin d&#39;analyser correctement T l&#39; adhésion cellulaire, le stimulant à inclure dans l&#39;étude doit être pris en compte lors du choix d&#39; une méthode in vitro. Bien qu&#39;il existe plusieurs tests pour étudier les signaux menant à LFA-1 activation et ICAM-1 liant toutes les méthodes ne sont pas interchangeables. Un essai d&#39;adhérence statique 10 est le mieux adapté pour étudier les interactions des cellules T-APC; En variante, le procédé de la contrainte de cisaillement détaillé ici es...

Adhérence des lymphocytes T médiatise un certain nombre de processus distincts dans un système immunitaire sain, 3 jouant un rôle essentiel dans le trafic des lymphocytes T et la présentation de l&#39; antigène. Que ce soit lors de la surveillance immune ou une réponse immunitaire active ces deux tâches d&#39;adhérence sont critiques. 4 Les événements de signalisation physiologiques des interactions cellulaires de cellules endothéliales T sont distinctes des cellules T cellule présentatrice d&#39; antigène (APC) des interactions, et donc nécessitent des méthodes distinctes de étude pour comprendre mieux les cascades de signalisation impliquées. L&#39;adhérence ferme d&#39;une cellule T à une paroi du vaisseau sanguin pendant l&#39;extravasation des lymphocytes nécessite une activation rapide et dynamique intégrine. L&#39;interaction étroite entre une intégrine et d&#39; adhérence des molécules d&#39;État actifs le long de l&#39;endothélium conduit à résistant à l&#39;écoulement du sang adhérence, qui permet aux cellules T à ramper le long de la surface à la recherche d&#39;une zone permissive au passage cellulaire. 5 L&#39;exploration d&#39;un bi cellulaire T -directionally alonga paroi du vaisseau sanguin est tributaire de l&#39; adhésion polarisée, avec une extrémité avant adhésive distincte de la cellule T. 6 Plus important encore , l&#39; adhésion ferme et la transmigration exigent une résistance à la force de cisaillement générée par la circulation du flux sanguin. Lors de la conception des expériences pour étudier l&#39;adhérence des lymphocytes, l&#39;attention devrait être accordée à la relance d&#39;intérêt spécifique. Bien que l&#39;activation des intégrines est un composant commun et critique de toutes les formes de T adhésion cellulaire, les cascades d&#39;activation sont susceptibles d&#39;être unique en aval des récepteurs individuels et co-récepteurs. De même, les paires d&#39;intégrine et la molécule d&#39;adhésion en fonction des micro-environnements spécialisés et sur des sous-populations spécifiques. De cette façon, ces paires peuvent être réglées différemment. Le modèle présenté ici est idéal pour l&#39;étude des cascades conduisant à l&#39; activation qui se déroule dans des conditions de contrainte de cisaillement intégrine de signalisation. 7 Ces interactions ne peuvent être compris de manière adéquate dans un ADHESI statiquesur le système en raison de l&#39;impact a été démontré que ces forces d&#39;avoir directement sur ​​le comportement des cellules T. 8 Bien que présenté ici avec des cellules T et CHO (ovaire de hamster chinois) , les cellules modifiées pour exprimer (cellules CHO-ICAM) ICAM-1 humain , le système peut facilement être modifié pour étudier différentes populations leucocytaires ou des molécules d&#39;adhésion. Cet essai fournit un procédé pour quantifier adhésivité des cellules T et l&#39;activation de l&#39;intégrine en utilisant une contrainte de cisaillement, en fournissant un modèle pour la phase solide d&#39;adhérence de leucocyte extravasation. Grâce à l&#39;utilisation de cellules CHO-ICAM l&#39;affinité de LFA-1 pour son ligand dans les cellules vivantes peuvent être examinées en temps réel en réponse à divers stimuli d&#39;intérêt. Cette technique nécessite facilement obtenu, disponibles dans le commerce des chambres micro-flux en combinaison avec une pompe seringue, grandement simplifier l&#39;équipement nécessaire pour modéliser le flux sanguin et la contrainte de cisaillement par rapport aux autres modèles. 9 Un autre avantage majeur de cette analyse est que la signalisation spécifiquecascades et l&#39;état d&#39;activation résultant des intégrines individuelles peuvent être étudiées proprement grâce à l&#39;utilisation de cellules CHO modifiées exprimant des molécules d&#39;adhésion humaines d&#39;intérêt. En outre, la combinaison des données quantitatives avec l&#39;imagerie des cellules vivantes est un avantage important de cette méthode. Dans l&#39;ensemble, tandis qu&#39;un certain nombre d&#39;essais de statique adhérence des cellules T ont été décrit que bien modéliser les interactions des cellules T-APC, ces modèles ne sont pas suffisantes pour capturer le processus dynamique de T adhérence de cellules épithéliales. Pour cette raison, lors du choix d&#39;un test d&#39;adhérence du stimulus en question doit être envisagée.

<table><tbody><tr><td>Échantillons de lymphocytes T (lignées cellulaires ou primaires)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Lymphocytes T humains périphériques</td></tr><tr><td>CHO-ICAM-1 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&micro ;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre de 500 ml</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre de 250 ml</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubulure 0,8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal avec chambre d’incubation</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Tout microscope fluorescent à grand champ</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 60 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha ;</td><td>R& D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp ;</td>Microcentrifugeuse <td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de volocité</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture traitées par culture tissulaire</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %) Rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Chaleur Inactivée FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

dosage de adhérence sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes t-adhesion molecule interactions

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Dans l&#39;ensemble, l&#39;adhérence des cellules T est une composante essentielle de la fonction, ce qui contribue aux processus distincts de recrutement cellulaire à des sites d&#39;inflammation et de l&#39;interaction avec les cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) dans la formation des synapses immunologiques. Ces deux contextes de T adhésion cellulaire diffèrent en ce que T interactions cellule-APC peuvent être considérés comme statique, alors que les interactions des vaisseaux cellules T dans le sang sont contestées par la contrainte de cisaillement générée par la circulation elle-même. les interactions cellule T-APC sont classés comme statique en ce que les deux partenaires cellulaires sont statiques par rapport à l&#39;autre. En règle générale, cette interaction se produit dans les ganglions lymphatiques. Comme une cellule T interagit avec la paroi du vaisseau sanguin, les cellules arrêtent et doivent résister à la contrainte de cisaillement générée. 1,2 Ces différences mettent en évidence la nécessité de mieux comprendre l&#39; adhérence statique et l&#39; adhérence dans des conditions d&#39;écoulement comme deux processus réglementaires distincts. La régulation de T adhérence cellulaire peut être très succinctement décrit comme conpêche à la traîne de l&#39;état de molécules d&#39;intégrine exprimées sur la surface cellulaire, et régulant ainsi l&#39;interaction des intégrines avec les ligands de molécules d&#39;adhérence exprimées à la surface de la cellule d&#39;interaction d&#39;affinité. Notre compréhension actuelle de la réglementation des intégrines états d&#39;affinité provient souvent simpliste dans des systèmes modèles in vitro. L&#39;essai d&#39;adhérence en utilisant des conditions d&#39;écoulement décrites ici permet la visualisation et la quantification précise des interactions cellulaires de cellules épithéliales T en temps réel, suite à un stimulus. Une adhérence sous test d&#39;écoulement peut être appliqué à l&#39;étude de l&#39;adhérence de signalisation au sein des cellules T après un traitement avec des substances inhibitrices ou stimulateurs. De plus, ce dosage peut être étendu au-delà de la signalisation des cellules T à une population leucocytaire adhésif et une paire quelconque d&#39;une molécule d&#39;intégrine-adhérence.

Les résultats représentatifs sont présentés dans le test d&#39;adhérence de l&#39; écoulement à l&#39; aide de Jurkat et des cellules T CD3 + humaines primaires, comme indiqué, stimulées par le SDF-1α. Les contrôles négatifs dans toutes les expériences présentées sont des cellules non stimulées. Un seuil de base pour cent l&#39;adhésion des cellules non stimulées est comprise entre 5 - 10%; adhérence de base, notamment au-dessus de cette fourchette indique une expérience probl...

Ce test d&#39;adhésion de flux fournit un modèle d&#39;impact simple, élevé d&#39;interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l&#39;adhérence des cellules T en utilisant des conditions d&#39;écoulement.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Le but global de ce test est de déterminer les effets de traitements d'intérêt sur l'adhésion cellulaire dans des conditions de contrainte de cisaillement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des cellules immunitaires, telles que les facteurs qui régulent l'activation des intégrines. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'étudier des paires de molécules d'adhésion uniques, les intégrines, dans un système d'écoulement facilement reproductible.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'activation de LFA1, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres intégrines. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés car la mise en place technique doit être exécutée avec précision. Pour récolter les cellules CHO-ICAM, traitez la culture avec une solution de trypsine-EDTA à 0,5 % pendant une minute à température ambiante en agitant doucement.Lorsque les cellules commencent à se détacher, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de milieu frais, puis comptez le nombre de cellules dissociées. Diluez les cellules à une concentration de 0,75 × 10⁵

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Pendant le processus d'infection, une étape clé est l'adhésion des agents pathogènes avec les cellules hôtes. Dans la plupart des cas, cette étape d'adhésion a lieu en présence de contraintes mécaniques générées par l'écoulement liquide. Nous décrivons une technique qui introduit la contrainte de cisaillement comme un paramètre important dans l'étude de l'adhésion bactérienne.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des récepteurs et des ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l'endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

Nous rapportons une méthode in vitro qui permet de quantifier le nombre réel de cellules adhésives au sein d’une monocouche de cellules endothéliales.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

adhérences de surface cellulaire sont au cœur de la mécanotransduction, car ils transmettent une tension mécanique et d'initier les voies de signalisation impliquées dans l'homéostasie et le développement des tissus. Ici, nous présentons un protocole pour disséquer les voies biochimiques qui sont activés en réponse à une tension, en utilisant des microbilles magnétiques revêtues de ligand et l'application de la force sur les récepteurs d'adhérence.

Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Nous décrivons une méthode en solution pour appliquer un cisaillement uniforme aux récepteurs de surface plaquettaire à l’aide de la viscosimètre à plaques coniques. Cette méthode peut également être utilisée plus largement pour appliquer le cisaillement à d’autres types de cellules et des fragments de cellules et n’a pas besoin de cibler une paire ligand-récepteur spécifique.

Un dosage de cisaillement uniforme pour les récepteurs plaquettaires et de surface cellulaires humains via la viscosimètre à plaques coniques

Cette méthode est utile pour quantifier la dynamique précoce de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules dépendantes de l'ancrage sur la fibronectine. En outre, cet analyse peut être employé pour étudier les effets de l'homéostasie altérée de redox sur la diffusion de cellules et/ou les voies intracellulaires liées à l'adhérence cellulaire.

Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Apprenez à quantifier l'adhérence des lymphocytes T sous contrainte de cisaillement pour étudier l'activation des intégrines et les interactions cellulaires immunitaires. Cette méthode permet d'analyser les mécanismes moléculaires de signalisation.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l'étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

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