Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l'étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

L’objectif global de ce test est de déterminer les effets des traitements d’intérêt sur l’adhésion cellulaire dans des conditions de stress de cisaillement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des cellules immunitaires, telles que les facteurs qui interviennent dans l’activation de l’intégrine. Le principal avantage de cette technique est que les paires d’intégrines de molécules d’adhésion unique peuvent être étudiées dans un système d’écoulement facilement reproductible.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’activation de LFA1, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres intégrines. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la configuration technique doit être exécutée avec précision. Pour récolter les cellules CHO-ICAM, traitez la culture avec 0,5 % de trypsine EDTA pendant une minute à température ambiante en agitant doucement.

Lorsque les cellules commencent à se détacher, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de milieu frais et comptez le nombre de cellules dissociées. Diluez les cellules à une concentration de 0,75 fois 10 à 10 pour la cinquième cellule par chambre et faites-les tourner dans une centrifugeuse. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans 30 microlitres par chambre d’écoulement, dans un milieu de culture CHO-ICAM complet, et ensemencez lentement 30 aliquotes de microlitres de cellules par réservoir de la chambre d’écoulement.

Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture complet dans les deux réservoirs de chaque chambre et remettez la plaque dans l’incubateur pour une culture pendant la nuit. Après avoir récolté les lymphocytes T, comptez et diluez la suspension cellulaire jusqu’à une concentration de deux fois 10 à la sixième cellule par chambre.

Ensuite, centrifugez les cellules et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de PBS, complété par 1 % de glucose tous les deux fois dix à la sixième cellule T. Ensuite, étiquetez les lymphocytes T dans une dilution de 1 à 1000 de CFSE à l’abri de la lumière pendant huit minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, centrifugez les cellules et remettez en suspension la pastille dans 240 microlitres de milieu RPMI sans sérum par chambre.

Ensuite, divisez les cellules en un tube de 1,5 millilitre dans chaque chambre et stockez les tubes dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius jusqu’au chargement. Avant l’imagerie, réchauffez la chambre d’imagerie en direct du microscope à 37 degrés Celsius et remplissez une bouteille en verre de 500 millilitres d’eau. Faites deux trous dans le couvercle étiquetés vers l’intérieur et vers l’extérieur, et faites passer le tuyau de raccordement de la seringue à travers le trou d’entrée et le réservoir d’entrée reliant le tuyau à travers le trou de sortie.

Utilisez une seringue de 60 millilitres pour rincer le tuyau d’entrée avec 60 millilitres d’eau, suivi de 60 millilitres de fluide sans sérum à 37 degrés Celsius pour éliminer tout air du système. Lorsque le tuyau est amorcé, transférez l’ensemble de la configuration d’entrée dans la chambre d’imagerie en direct du microscope pour maintenir le système à 37 degrés Celsius. Faites sortir le tuyau et la seringue de la chambre et chargez la seringue dans le pousse-seringue.

Ensuite, faites un trou dans le couvercle d’une bouteille de 250 millilitres pour servir de conteneur de déchets de sortie et faites passer le tube de sortie à travers le trou dans la bouteille. Ensuite, fixez sans serrer le couvercle de la bouteille de sortie et placez l’ensemble de la configuration de sortie dans la chambre d’imagerie en direct. Placez maintenant la lame de la chambre d’écoulement sur la platine du microscope et utilisez l’objectif 20X pour régler le plan focal sur la couche mono CHO ICAM.

Ensuite, en commençant par le contrôle non stimulé, jetez trois volumes de 70 microlitres du réservoir de sortie de la première chambre et ajoutez trois volumes de 70 microlitres de cellules T marquées CFCS dans le réservoir d’entrée. Pendant que les lymphocytes T se déplacent de l’entrée à la sortie, imagez cinq champs aléatoires de lymphocytes T positifs au CFSE dans chaque chambre pour obtenir le nombre de cellules avant le flux. Ensuite, fixez simultanément les tuyaux d’entrée et de sortie aux réservoirs de la chambre d’écoulement, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air, et commencez l’écoulement sous contrainte de cisaillement à 0,3 millilitre par minute, tout en continuant à visualiser les cellules T colorées au CFSC.

Dès qu’un mouvement des lymphocytes T est observé, démarrez une minuterie pendant cinq minutes, pour terminer le flux à la fin de la période de cinq minutes. Ensuite, imagez cinq champs de cellules CFSE positives dans chaque chambre, en choisissant les champs au hasard pour obtenir le nombre de cellules post-flux. Pour la stimulation par PMA, stimulez un tube de cellules T avec de la PMA pour servir de contrôle positif immédiatement avant de charger les cellules T dans la deuxième chambre d’écoulement pour l’imagerie, comme nous venons de le démontrer.

Pour la stimulation SDF-1 alpha, retirez d’abord trois aliquotes de 70 microlitres de fluide du réservoir de sortie de la troisième chambre, puis ajoutez 70 microlitres de SDF-1 alpha dans le réservoir d’entrée. Après cinq minutes, jetez trois aliquotes de 70 microlitres du réservoir de sortie et ajoutez le tube restant de cellules T pour l’imagerie, comme nous venons de le démontrer. Dans ces images représentatives, un nombre similaire de lymphocytes T est observé avant le flux dans les différentes conditions de stimulation.

Après cinq minutes de stress de cisaillement continu, le nombre de lymphocytes T adhérents augmente dans les conditions de stimulation PMA et SDF-1 alpha, tandis que quelques lymphocytes T non stimulés restent adhérents. En effet, l’activation des lymphocytes T alpha SDF-1, par exemple, induit une augmentation de près de deux fois de l’adhésion des lymphocytes T, par rapport aux cellules témoins non stimulées. De plus, lorsque l’on calcule le pourcentage d’adhésion des lymphocytes T CD3 positifs primaires humains en présence ou en l’absence de SDF-1 alpha, 15 % des lymphocytes T non stimulés adhèrent sous contrainte de cisaillement, contre 50 % des lymphocytes T dans des conditions d’activation de SDF-1 alpha.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être raisonnablement étendue à six chambres expérimentales en un seul essai. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de travailler uniquement avec la couche mono confluente ICAM. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse de la forme des cellules, peuvent être effectuées sur les images capturées pour répondre à des questions supplémentaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier l’adhérence des cellules dans des conditions de contrainte de cisaillement. Merci d’avoir regardé cette vidéo, et bonne chance dans vos expériences.