Name: Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Apprenez à isoler et à cultiver des cellules souches mésenchymateuses du placenta humain par dissection manuelle et digestion enzymatique. Cette méthode fiable permet d'obtenir des MSC pour la recherche en médecine régénérative.

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RP a été soutenu par un Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) formation postdoctorale Fellowship. VS a été soutenue par l&#39;Université du Queensland international Postgraduate Student bourse. MRD a été soutenu par le NHMRC et Inner Wheel Australie. Nous remercions le personnel clinique et les soins infirmiers pour aider à le consentement du patient et de la collecte de l&#39;échantillon. Nous remercions Prof. Nickolas Fisk, le professeur Kerry Atkinson et Dr Rohan Lourie pour des discussions pertinentes en obstétrique, le développement foeto-placentaire et de l&#39;anatomie du placenta.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le placenta est un organe physiquement grand foeto - maternelle, à partir de laquelle MSC foetale ou maternelle peut être isolé 22. Ici, nous avons fourni un aperçu détaillé de l&#39;anatomie du placenta et des instructions sur la façon de disséquer spécifiquement decidua (maternelle), villosités choriales (de fœtus), et la plaque chorionique (foetal) tissu (étape 2,2-2,4). Par la suite, nous avons décrit un protocole robuste qui permet MSC l&#39;isolement de chacun de ces trois tissus (étape 2,5-2,6). L&#39; expansion placentaire MSC est efficace et les cultures semblent similaires à la moelle osseuse dérivés MSC cultures (figures 3 et 4). Une différenciation ostéogénique est fiable (figure 5B), tandis que la différenciation adipocytaire est généralement moins efficace (figure 5C) 5. Beaucoup de nouveaux arrivants sur le terrain vont présumer que les cultures dérivées de villosités choriales foetal ou des tissus de la plaque choriales seront enrichies en MSC foetal. Cependant, dans nos mains fel&#39; enrichissement cellulaire tal est seulement transitoire lorsque le milieu d&#39;expansion de MSC standard tel que DMEM-LG + 10% de FBS est utilisée 5. Ici, nous fournissons des résultats représentatifs à l&#39;aide de tissus placentaires provenant d&#39;un bébé de sexe masculin. En utilisant le tissu placentaire d&#39;un bébé de sexe masculin, les cellules foetales sont facilement identifiable comme ayant des chromosomes XY, tandis que les cellules maternelles sont identifiables comme ayant des chromosomes XX. La figure 6 montre les résultats de FISH XY pour une culture représentative. Alors que le MSC fœtal (XY) sont enrichis (jusqu&#39;à 80%) dans les cultures initiales dérivées de villosités choriales du foetus ou de tissus de la plaque choriales, les mêmes cultures sont rapidement rattrapés (~ 100%) par la mère (XX) du MSC au cours des deux premiers passages . Dans un milieu standard, composé de DMEM-LG + 10% de FBS, le MSC maternel dérivé rares qui contaminent les tissus foetaux outcompete les cellules foetales dérivées de la culture. Une étape critique décrite dans ce protocole est une appréciation de l&#39;anatomie du placenta et d&#39;où foetalet le tissu maternel peut être le plus efficacement récolté. Comme il est indiqué dans la section des résultats représentatifs, la dissection du tissu fœtal ne permet l&#39;enrichissement transitoire pour MSC fœtaux dérivés. L&#39;amélioration de la croissance à moyen formulation, par le biais exogène facteur de croissance moyen de suppléments spécifiques devraient permettre une expansion sélective des populations de MSC fœtaux dérivés, et la production d&#39;un produit cellulaire qui est enrichi pour foetal plutôt que des cellules maternelles (notre groupe est en train de développer de telles formulations moyennes). La fabrication des populations de MSC foetales peut avoir un certain nombre d&#39;avantages, comme MSC foetal sont censés avoir une plus grande angiogenèse et des propriétés immunosuppressives que les populations de MSC maternels équivalents 37. Dans chacun des protocoles d&#39;isolement décrits, on a utilisé environ 10 grammes de tissu. Tout un placenta est typiquement 500-750 g, et dans le travail précédent, nous avons démontré que, grâce à un tissu automatisé condensé et un bioréacteur proc d&#39;expansion cellulaireesses qu&#39;il devrait être possible de fabriquer plus de 7000 doses de cellules cliniques d&#39;un seul placenta 4. Ces chiffres mettent en évidence la pertinence potentielle de MSC placentaire dérivés dans les thérapies de MSC allogéniques, et l&#39;importance de cette méthode sans distinction d&#39;origine MSC (foetale ou maternelle). Du point de vue thérapeutique, il est plus important que les utilisateurs ont une compréhension complète du produit cellulaire et la capacité de fabriquer de manière fiable ce produit cellulaire. Nous espérons que notre vidéo aidera les chercheurs à comprendre l&#39;anatomie du placenta, isoler MSC à partir du placenta, et anticiper la composition cellulaire foetale ou maternelle probable de leurs cultures.

Cellules stromales souches / mésenchymateuses (MSC) sont en train de devenir un candidat prometteur pour une utilisation dans les thérapies à base de cellules 1. La plupart des applications semblent viser la réparation des tissus MSC médiée ou la régulation immunitaire 2. Dans beaucoup de ces applications, allogénique MSC peut être aussi efficace que MSC autologues 3. L&#39;utilisation de MSC allogéniques a l&#39;avantage économique d&#39;être compatible avec la fabrication à grande échelle de doses multiples de cellules à partir d&#39; un seul tissu source 4 pour traiter de nombreux patients. Historiquement, les études pré-cliniques et cliniques ont utilisé MSC dérivées de la moelle osseuse 4. La moelle osseuse est généralement collectées à partir de la crête iliaque d&#39;un donneur volontaire. Ce processus est invasif, et seulement un petit volume de moelle (~ 20 ml) sont recueillies au moyen d&#39;une seule piqûre. Générer des nombres cliniquement significatives de MSC nécessite une dans l&#39; expansion in vitro. Cellule puissance diminue avec le nombre de passage <sup&gt; 3, ce qui crée un paradoxe , où le nombre théorique des cellules nécessaires pour une efficacité clinique augmente plus la population de cellules est agrandi. Contrairement à aspirats de moelle osseuse, placenta à terme est un physiquement grand tissu de départ (typiquement 500-750 g 4), qui peut être récolté aseptique pendant la césarienne sans risque pour le donneur. MSC dérivé de placenta ont prolifération 5 et immunomodulateur capacité à long terme 6, supérieure à MSC dérivées de moelle osseuse. Dans une étude précédente, nous avons montré qu&#39;un seul placenta à terme contenait MSC suffisante pour la fabrication de jusqu&#39;à 7000 4 doses cliniques. Ces caractéristiques en font un tissu de placenta source idéale pour la fabrication de MSC allogéniques. Le placenta est un organe foeto - maternelle comprenant à la fois le tissu fœtal et maternel 7, et donc MSC d&#39;origine foetale ou maternelle peut être, théoriquement, isolé. Les références suivantes fournissent deinformations à queue sur le développement et la pathologie, ainsi que l&#39; examen microscopique et macroscopique du placenta humain et de ses annexes 8,9. Le placenta approprié est constitué en grande partie des vaisseaux sanguins du foetus et sécrétoires et les cellules de soutien appelées trophoblastes, qui constituent les villosités choriales couvertes par les frondosum chorionique (plaque) 8. Les villosités placentaires ramifiés sont baignées dans le sang maternel délivré des artères utérines en spirale, ce qui permet des éléments nutritifs, l&#39;hormone et l&#39;échange de gaz entre le fœtus et la mère. Le placenta est ancré sur l&#39;endomètre par les cellules stromales déciduales maternelles et des trophoblastes foetaux sont entrecoupées extravillious dans une matrice extracellulaire 8. Les villosités convergent sur ​​la plaque chorionique foetal où ils forment le cordon ombilical 8. Un résultat du premier atelier international sur les cellules souches placentaires dérivées (2008) est une appréciation de la nécessité de normaliser l&#39;isolement et characterization de cellules de placenta humain à terme 10. En raison de l&#39;anatomie du placenta, la dissection des tissus différents, l&#39;isolement du MSC et les résultats de culture prévus peut être écrasante pour les nouveaux arrivants sur le terrain. Dans ce protocole, la récolte des tissus placentaires choriales, suivie par MSC isolement et l&#39;expansion est bien détaillée. MSC caractérisation par cytométrie en flux et dans la différenciation in vitro sont considérés comme routine 5,11-13, et donc que brièvement détaillé ici. Comme l&#39;a souligné dans une revue systématique de la littérature récente 14, MSC obtenu à partir des villosités choriales placentaires sont généralement supposés être fœtal. Bien que, seulement 18% des études ont examiné l&#39;origine du MSC obtenu, et de ceux, seulement la moitié des études a rapporté MSC foetal et l&#39;autre moitié ont déclaré les populations de MSC maternels ou mixtes. Chacun des trois composants de tissus décrits ici (villosités choriales, plaque et decidua basalis choriales) sont compOSED principalement du fœtus membrane / villosités, et une petite proportion de cellules maternelles utérines dérivées, qui restent attachées au placenta livré. Nous fournissons des données démontrant que l&#39; isolement MSC du côté maternel du placenta, plutôt que du côté foetal du placenta, comme nous l&#39; avons signalé précédemment 5,11, est un matériau de départ plus approprié si MSC maternelle sont souhaités. Ce protocole décrit également l&#39;utilisation de XY FISH pour valider la contribution foetale ou maternelle à des cultures cellulaires. Bien que ce soit un protocole standard du fabricant, cette analyse est souvent négligée et son importance sous - estimée 14.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Nom long : Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nom long : Fetal Bovin Serum</td></tr><tr><td>trypsin-substitute</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>Nom long : TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>Nom long : Dulbecco' s Aigles modifiés Teneur moyenne-faible en glucose</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nom long : Dulbecco' s Eagles modifiés Glucose moyennement élevé (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>PBS (sans Mg+Ca+)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Nom long : Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, sans magnésium ni calcium</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nom long : solution antibiotique-antimycotique x100</td></tr><tr><td>poudre de paraformaldéhyde ou solution à 4 %</td><td>n’importe laquelle ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagénase I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp ;</td><td>2 500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml in&nbsp ; 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp ;</td><td>10 mg/ml dans l’eau (20 000 U/ml).</td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Disposables :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 ml</td><td>Falcon ou boîtes</td> de Pétri de toute marque<td></td><td></td></tr><tr><td>, plastique stérile (25 cm et 10 cm de diamètre)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crépines cellulaires (100 &mu ; m)</td><td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 et 75 cm2 (T175 et T75) flacons de culture tissulaire</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml pipettes sérolgiques</td><td>stériles de toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipement :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Centrifugeuse&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; incubateur de culture tissulaire 37 &deg ; C, 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enceinte</td><td></td><td></td><td></td> de sécurité biologique</tr><tr><td>&nbsp ; Ciseaux et pinces</td><td></td><td></td><td></td>à épiler</tr><tr><td>stériles Porte-tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-boy ou équivalent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pipettes de type Gilson et pointes stériles 1 000 & micro ; l, 200 et micro ; l, 20 &micro ;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubateur à bascule ou à secousses (37 &deg ; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solutions de nettoyage de l’équipement</td> de protection individuelle (adaptées au sang)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conteneurs à déchets, bacs d’élimination corrects pour les tissus/sang</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forts>réactifs pour la caractérisation des CSM</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td></td>forts>anticorps (Clone ID)</forts><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fabricant</td><td>N° de catalogue</td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>Souris IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>Souris IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>Souris IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>souris IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>Souris IgG1</td></tr><tr><td>Isotype Controls (Clone ID)</td><td>Fabricant</td><td>N° de catalogue </td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>Isotype IgG1 de souris (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>Isotype IgG1 de souris (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a de souris (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a de souris (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>Tampon MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td><fort>Différenciation ostéogénique</fort></td><td><fort>Fabricant</td><td>N° de catalogue </td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nom long : Dulbecco' s Eagles modifiés Glycémie moyenne-élevée (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nom long : Sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nom long : solution antibiotique-antimycosique x100</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Glycérol Phophate</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbique 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rouge d’alizarine S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>Pour la coloration de la matrice calcique</td></tr><tr><td><forte>Différenciation adipogénique</forte></td><td><forte>Fabricant</td><td>N° de catalogue</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nom long : Dulbecco' s Aigles modifiés Glycémie moyenne-élevée (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nom long : Sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nom long : solution antibiotique-antimycosique x100</td></tr><tr><td>insuline</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Indométacine</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-méthyl xanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O solution</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>Pour la coloration des vacuoles lipidiques</td></tr><tr><td>XY FISH kit pour déterminer l’origine fœtale ou maternelle des cellules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY chomosome FISH kit</td><td>Vysis (Abbott Molecular)</td><td>07J20-050</td><td>Nom long : CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Kit de sonde d’ADN fluorescente à marquage direct</td></tr></tbody></table>

isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain tissue

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) sont des candidates prometteuses pour une utilisation dans les thérapies cellulaires. Dans la plupart des cas, la réponse thérapeutique semble dépendre de la dose cellulaire. Le placenta humain est riche en CSM et est un tissu physiquement grand qui est généralement jeté après la naissance. Le placenta est un matériau de départ idéal pour la fabrication à grande échelle de doses cellulaires multiples de CSM allogéniques. Le placenta est un organe fœtomaternel à partir duquel les tissus fœtaux ou maternels peuvent être isolés. Cet article décrit l’anatomie placentaire et la procédure pour disséquer le tissu décidua (maternel), les villosités choriales (fœtales) et la plaque choriale (fœtale). Le protocole décrit ensuite comment isoler les CSM de chaque région tissulaire disséquée et fournit une analyse représentative des CSM élargies dérivées des types de tissus respectifs. Ces méthodes sont destinées à l’isolement préclinique des CSM, mais ont également été adaptées à la fabrication clinique de CSM placentaires à des fins thérapeutiques humaines.

Nous décrivons ici des procédés pour la dissection de tissus foetaux et maternels à partir de placenta humain à terme, suivie par l&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules souches / cellules stromales (MSC) à partir de ces tissus.

Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et d'expander des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu placentaire humain. Bonjour, je suis Mike Doran. Je suis chef d'équipe à l'Université de technologie du Queensland, à l'Institut de recherche translationnelle de Brisbane, en Australie.Bonjour, je m'appelle Rebecca Pelekanos, et je suis chercheuse au Centre de recherche clinique de l'Université du Queensland. Aujourd'hui, je vais démontrer la procédure d'isolement des CSM. Le placenta est normalement éliminé après l'accouchement.Étant donné que le tissu pèse entre cinq et 700 grammes, il constitue une source exceptionnellement abondante de cellules souches mésenchymateuses allogéniques. En général, les personnes novices dans l'isolement des cellules souches mésenchymateuses placentaires éprouvent des difficultés, car elles ne connaissent pas l'anatomie du placenta, ne savent pas comment traiter le tissu et ignorent quels types de cellules, maternelles ou fœtales, composeront leur culture finale de cellules souches mésenchymateuses. Afin d'aider les chercheurs, nous abordons ces détails importants dans cette vidéo.La première étape de cette procédure consiste à se familiariser avec l'anatomie du placenta. La deuxième étape consiste à disséquer manuellement 10 grammes de tissu provenant soit de la décidua, des villosités choriales, soit de la plaque choriale, à l'aide de ciseaux. Les deux premières étapes sont résumées à nouveau ici de manière schématique.À l'étape trois, les tissus du chorion, des villosités choriales ou de la plaque choriale sont finement hachés à l'aide de ciseaux. À l'étape quatre, les cellules sont libérées des petits fragments de tissu par une digestion d'une à deux heures dans de la dispase et de la collagénase I. À l'étape cinq, les cellules sont séparées du tissu fibreux en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Les cellules sont ensuite récupérées, resuspendues dans un milieu de culture et placées dans des flacons de culture.Les cellules souches mésenchymateuses, ou MSC, seront sélectionnées en fonction de leur aptitude à l'adhérence plastique et de leur capacité à survivre et à proliférer dans le milieu de culture cellulaire. Enfin, dans la section des résultats, les MSC amplifiés peuvent être caractérisés et conservés pour être utilisés dans des expériences ultérieures. Le placenta est un organe temporaire qui permet l'échange de nutriments et de déchets entre le fœtus et la mère pendant la grossesse.Le placenta peut facilement être collecté de manière aseptique après une césarienne et l'accouchement sans danger du bébé. Le placenta est principalement composé de vaisseaux sanguins et de membranes d'origine fœtale. Toutefois, il contient également quelques cellules maternelles.Le placenta est relié à l'utérus par des cellules déciduales d'origine maternelle, dérivées de l'utérus, et par des trophoblastes d'origine fœtale qui envahissent les tissus. Il n'est généralement pas possible de distinguer à l'œil nu l'interface précise entre les tissus maternels et fœtaux. Toutefois, la face fœtale du placenta est facilement identifiable comme étant le côté où se trouve le cordon ombilical.Une fois le bébé expulsé, seule une fine couche de tissu décidual reste attachée au placenta. En orientant physiquement le placenta, il est possible de localiser les trois tissus que nous allons prélever aujourd'hui. Le premier tissu à prélever sera la décidua maternelle.Le marqueur vert indique le tissu décidual qui reste en surface après le décollement du placenta de la paroi utérine. Le second tissu, qui sera prélevé à l'intérieur du placenta, est constitué des villosités choriales fœtales. Celles-ci sont indiquées par les cercles bleus sur les schémas.Le troisième tissu à prélever sera la plaque choriale fœtale. Ce tissu est identifié par les marqueurs rouges sur les schémas. Bon, commençons.Placer le placenta dans la hotte de sécurité biologique. Déployer les membranes fœtales et s'orienter par rapport aux différentes parties du placenta. Le côté fœtal avec l'insertion du cordon ombilical, le chorion amniotique lisse, ou la poche amniotique.La surface fœtale du placenta présente des vaisseaux sanguins importants bien visibles dans la plaque choriale, recouverte par la membrane amniotique, qui peut à nouveau être facilement séparée mécaniquement. Le côté maternel est opposé au côté fœtal et présente des cotylédons ou lobes nettement visibles. Veiller à ce que la surface maternelle soit orientée vers le haut.Prélevez des morceaux de 0,5 cm d'épaisseur du côté maternel du placenta ou de la décidua. Pendant les dissections, placez les fragments de tissu dans une boîte de Pétri contenant une solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, afin de maintenir les tissus humides. Agitez les tissus dans les boîtes contenant du HBSS pour éliminer une partie du sang.Transférez suffisamment de tissu pour remplir le tube jusqu’au trait de 10 millilitres d’un tube de 50 millilitres, environ 10 grammes. Remarque : davantage de tissu peut être isolé à ce stade si un plus grand nombre de cellules est requis à la fin de la procédure. Veillez à ce que la surface fœtale soit orientée vers le haut.Retirer mécaniquement la membrane amniotique de la surface fœtale du placenta, en laissant intact le plateau choriale. Couper le plateau choriale en bandes d'environ un demi-centimètre de profondeur dans le tissu villositaire sous-jacent. Ensuite, disséquer le tissu des villosités choriales sur une profondeur d'environ un centimètre dans le placenta, à partir de l'endroit où le plateau choriale a été retiré.Placer les tissus dans du HBSS et mesurer environ 10 millilitres de tissu, comme précédemment. Transférer les morceaux de tissu, en minimisant le transfert de liquide, dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et les hacher finement en morceaux d’environ un millimètre cube à l’aide de ciseaux. Replacer le tissu haché dans le tube de 50 ml.Répétez pour tous les échantillons de tissu restants. Ajoutez le milieu de digestion fraîchement préparé dans un rapport d'au moins un pour un par rapport au tissu. Retournez le tube plusieurs fois pour homogénéiser.Incuber les tissus dans le tube avec le milieu de digestion pendant une à deux heures, à 37 degrés dans un incubateur agité. Lorsque la solution de digestion des tissus devient trouble et que les vaisseaux sanguins blancs sont visibles dans la solution, ajouter 15 millilitres de HBSS pour diluer les enzymes présents dans le milieu de digestion. Faire une courte centrifugation par impulsions, uniquement jusqu’à ce que la centrifugeuse atteigne 340 g pendant cinq secondes, puis arrêter.Cela obligera les gros débris à s'accumuler au fond du tube. Replacer les échantillons dans la cabine de sécurité biologique. Placer un filtre à cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres.Prélèvez au pipet le surnageant contenant les cellules mononucléées et faites-le passer dans le filtre, en récupérant l'éluat dans le nouveau tube. Laissez les débris de tissu placentaire dans le premier tube. Ajoutez 15 millilitres de HBSS aux débris placentaires, agitez vigoureusement pour récupérer davantage de cellules, puis effectuez une courte centrifugation par pulsation de l'échantillon.De nouveau, prélevez le surnageant au pipetage et transférez-le dans le tube contenant le filtre à cellules placé sur le tube de collecte. Verser le surnageant directement sur le filtre à cellules peut s'avérer plus approprié, selon la consistance de l'échantillon. Rincez le filtre à cellules avec 5 millilitres de HBSS.Jetez le tube contenant les débris de tissu placentaire. Centrifugez l'échantillon de surnageant pendant cinq minutes à 340 g pour former un culot cellulaire. Les globules rouges sont visibles sous forme d'une couche située au fond du culot, tandis que les cellules mononucléées, incluant les CSM, forment une couche plus claire au-dessus des globules rouges.Replacer les échantillons dans la hotte de sécurité biologique. Verser soigneusement le surnageant et le jeter. Tapoter plusieurs fois le tube avec un doigt pour détacher le culot cellulaire, puis resuspendre le culot cellulaire dans 35 millilitres de milieu pour MSC.Transférez la suspension cellulaire dans un flacon T175 par 10 millions de tissu, et cultivez dans une incubateur à 37 degrés avec 5 % de CO2. Après l'isolement, changez le milieu de culture après 48 heures. Alimentez les cultures une fois par semaine jusqu'à confluence.Les cultures devraient être confluentes après environ 14 jours. Enfin, étendre et cryoconserver les cellules, analyser les caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les utiliser dans des expériences. Après 48 heures de culture, les CSM se seront attachées au plastique de culture tissulaire, tandis que les populations cellulaires hématopoïétiques et autres ne se seront pas fixées.À ce stade, le milieu est remplacé par 35 millilitres de milieu de culture frais. L'aspect du surnageant de la culture peut varier considérablement entre les donneurs de placenta. L'exemple un et l'exemple deux illustrent cette variation.Ces deux isolations ont été réalisées simultanément, mais à partir de deux placentas différents. Une fois lavées, les cultures sont débarrassées des globules rouges et des débris tissulaires, comme illustré dans l'exemple trois, et les résultats d'expansion ultérieurs sont généralement reproductibles. Après le changement de milieu à 48 heures, seules quelques cellules sont attachées au flacon.Sept jours après l'isolement, des colonies de MSC de type fibroblastique sont visibles, bien que des cellules non MSC soient également présentes sous forme de cellules rondes ou faiblement adhérentes. Treize jours après l'isolement, les colonies de MSC fibroblastiques sont grandes, et souvent la monocouche de MSC est suffisamment confluente et prête à être passagée. À partir du premier passage, la monocouche de MSC développe une morphologie caractéristique en forme de tourbillon à la confluence.Les CSM placentaires présentent un profil classique de marqueurs des CSM par analyse en cytométrie en flux. Les cellules sont positives pour CD73, CD105 et CD90, et négatives pour les marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34 et HLA-DR. Les CSM placentaires subissent généralement une différenciation ostéogénique robuste, mais une différenciation adipogénique faible.De nombreuses publications supposent que les cellules isolées du chorion fœtal donnent des CSM fœtaux en culture. Cependant, comme nous l'avons rapporté précédemment, toutes les cultures dérivées du chorion fœtal à l'aide de ce protocole s'enrichissent rapidement en CSM maternels, comme on pouvait s'y attendre pour les cultures de CSM déciduaux maternels. Les données présentées ici quantifient la composition en cellules fœtales et maternelles des cultures de CSM placentaires isolées à partir de tissus déciduaux, de villosités choriales et de la plaque choriale.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'isoler et de mettre en culture des CSM provenant de tissu placentaire. Nous espérons que ces méthodes vous seront utiles dans vos recherches et applications cliniques qui pourraient utiliser des CSM dérivées du placenta.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons identifié le placenta comme un organe majeur lors du développement hématopoïétique. Nous avons constaté que les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à la fois générées et développées dans le placenta dans des niches uniques microenvironnementales. Ici, nous décrivons des techniques expérimentales nécessaires à l'isolement et la visualisation des CSH dans le placenta de souris.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel de différenciation vers la lignée ostéoblastique lorsqu’elles sont stimulées par des facteurs solubles ou des biomatériaux spécifiques. Ce travail présente une nouvelle option pour l’administration de CSM à partir de la membrane amniotique humaine (AM-hMSC) qui utilise la matrice osseuse bovine Nukbone (NKB) comme échafaudage.

Isolement de mésenchymateuses humaines cellules souches et de leur culture sur la matrice osseuse poreuse

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

Le tissu adipeux est une excellente source de cellules souches mésenchymateuses. Ici, nous apportons étape par étape l’extraction, la culture et la caractérisation de cellules souches dérivées du tissu adipeux adipeux (ADSC) à partir de tissu adipeux épididymaire de souris suisses.

Isolement, expansion in vitro et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux épididymaire de souris

Ce protocole décrit et compare deux méthodes représentatives pour différencier les hiPSCs en cellules stromales mésenchymateuses (CSM). La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile. La méthode des corps embryoïdes (EBs) se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

L’isolementdes CSM BAMBIà hauteMFGE8, l’un des trois principaux sous-groupes constituant les CSM-UC humaines hétérogènes, est utile pour bien comprendre les caractéristiques et les fonctions de ce sous-type en vue de son application future pour améliorer l’efficacité clinique dans des maladies spécifiques. Nous présentons ici une méthode de tri des UC-MSCBAMBI highMFGE8.

Isolement de cellules stromales mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical BAMBIhumain

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques.  Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Apprenez à isoler et à cultiver des cellules souches mésenchymateuses du placenta humain par dissection manuelle et digestion enzymatique. Cette méthode fiable permet d'obtenir des MSC pour la recherche en médecine régénérative.

Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

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