Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et d'expander des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu placentaire humain. Bonjour, je suis Mike Doran. Je suis chef d'équipe à l'Université de technologie du Queensland, à l'Institut de recherche translationnelle de Brisbane, en Australie.

Bonjour, je m'appelle Rebecca Pelekanos, et je suis chercheuse au Centre de recherche clinique de l'Université du Queensland. Aujourd'hui, je vais démontrer la procédure d'isolement des CSM. Le placenta est normalement éliminé après l'accouchement.

Étant donné que le tissu pèse entre cinq et 700 grammes, il constitue une source exceptionnellement abondante de cellules souches mésenchymateuses allogéniques. En général, les personnes novices dans l'isolement des cellules souches mésenchymateuses placentaires éprouvent des difficultés, car elles ne connaissent pas l'anatomie du placenta, ne savent pas comment traiter le tissu et ignorent quels types de cellules, maternelles ou fœtales, composeront leur culture finale de cellules souches mésenchymateuses. Afin d'aider les chercheurs, nous abordons ces détails importants dans cette vidéo.

La première étape de cette procédure consiste à se familiariser avec l'anatomie du placenta. La deuxième étape consiste à disséquer manuellement 10 grammes de tissu provenant soit de la décidua, des villosités choriales, soit de la plaque choriale, à l'aide de ciseaux. Les deux premières étapes sont résumées à nouveau ici de manière schématique.

À l'étape trois, les tissus du chorion, des villosités choriales ou de la plaque choriale sont finement hachés à l'aide de ciseaux. À l'étape quatre, les cellules sont libérées des petits fragments de tissu par une digestion d'une à deux heures dans de la dispase et de la collagénase I. À l'étape cinq, les cellules sont séparées du tissu fibreux en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Les cellules sont ensuite récupérées, resuspendues dans un milieu de culture et placées dans des flacons de culture.

Les cellules souches mésenchymateuses, ou MSC, seront sélectionnées en fonction de leur aptitude à l'adhérence plastique et de leur capacité à survivre et à proliférer dans le milieu de culture cellulaire. Enfin, dans la section des résultats, les MSC amplifiés peuvent être caractérisés et conservés pour être utilisés dans des expériences ultérieures. Le placenta est un organe temporaire qui permet l'échange de nutriments et de déchets entre le fœtus et la mère pendant la grossesse.

Le placenta peut facilement être collecté de manière aseptique après une césarienne et l'accouchement sans danger du bébé. Le placenta est principalement composé de vaisseaux sanguins et de membranes d'origine fœtale. Toutefois, il contient également quelques cellules maternelles.

Le placenta est relié à l'utérus par des cellules déciduales d'origine maternelle, dérivées de l'utérus, et par des trophoblastes d'origine fœtale qui envahissent les tissus. Il n'est généralement pas possible de distinguer à l'œil nu l'interface précise entre les tissus maternels et fœtaux. Toutefois, la face fœtale du placenta est facilement identifiable comme étant le côté où se trouve le cordon ombilical.

Une fois le bébé expulsé, seule une fine couche de tissu décidual reste attachée au placenta. En orientant physiquement le placenta, il est possible de localiser les trois tissus que nous allons prélever aujourd'hui. Le premier tissu à prélever sera la décidua maternelle.

Le marqueur vert indique le tissu décidual qui reste en surface après le décollement du placenta de la paroi utérine. Le second tissu, qui sera prélevé à l'intérieur du placenta, est constitué des villosités choriales fœtales. Celles-ci sont indiquées par les cercles bleus sur les schémas.

Le troisième tissu à prélever sera la plaque choriale fœtale. Ce tissu est identifié par les marqueurs rouges sur les schémas. Bon, commençons.

Placer le placenta dans la hotte de sécurité biologique. Déployer les membranes fœtales et s'orienter par rapport aux différentes parties du placenta. Le côté fœtal avec l'insertion du cordon ombilical, le chorion amniotique lisse, ou la poche amniotique.

La surface fœtale du placenta présente des vaisseaux sanguins importants bien visibles dans la plaque choriale, recouverte par la membrane amniotique, qui peut à nouveau être facilement séparée mécaniquement. Le côté maternel est opposé au côté fœtal et présente des cotylédons ou lobes nettement visibles. Veiller à ce que la surface maternelle soit orientée vers le haut.

Prélevez des morceaux de 0,5 cm d'épaisseur du côté maternel du placenta ou de la décidua. Pendant les dissections, placez les fragments de tissu dans une boîte de Pétri contenant une solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, afin de maintenir les tissus humides. Agitez les tissus dans les boîtes contenant du HBSS pour éliminer une partie du sang.

Transférez suffisamment de tissu pour remplir le tube jusqu’au trait de 10 millilitres d’un tube de 50 millilitres, environ 10 grammes. Remarque : davantage de tissu peut être isolé à ce stade si un plus grand nombre de cellules est requis à la fin de la procédure. Veillez à ce que la surface fœtale soit orientée vers le haut.

Retirer mécaniquement la membrane amniotique de la surface fœtale du placenta, en laissant intact le plateau choriale. Couper le plateau choriale en bandes d'environ un demi-centimètre de profondeur dans le tissu villositaire sous-jacent. Ensuite, disséquer le tissu des villosités choriales sur une profondeur d'environ un centimètre dans le placenta, à partir de l'endroit où le plateau choriale a été retiré.

Placer les tissus dans du HBSS et mesurer environ 10 millilitres de tissu, comme précédemment. Transférer les morceaux de tissu, en minimisant le transfert de liquide, dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et les hacher finement en morceaux d’environ un millimètre cube à l’aide de ciseaux. Replacer le tissu haché dans le tube de 50 ml.

Répétez pour tous les échantillons de tissu restants. Ajoutez le milieu de digestion fraîchement préparé dans un rapport d'au moins un pour un par rapport au tissu. Retournez le tube plusieurs fois pour homogénéiser.

Incuber les tissus dans le tube avec le milieu de digestion pendant une à deux heures, à 37 degrés dans un incubateur agité. Lorsque la solution de digestion des tissus devient trouble et que les vaisseaux sanguins blancs sont visibles dans la solution, ajouter 15 millilitres de HBSS pour diluer les enzymes présents dans le milieu de digestion. Faire une courte centrifugation par impulsions, uniquement jusqu’à ce que la centrifugeuse atteigne 340 g pendant cinq secondes, puis arrêter.

Cela obligera les gros débris à s'accumuler au fond du tube. Replacer les échantillons dans la cabine de sécurité biologique. Placer un filtre à cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Prélèvez au pipet le surnageant contenant les cellules mononucléées et faites-le passer dans le filtre, en récupérant l'éluat dans le nouveau tube. Laissez les débris de tissu placentaire dans le premier tube. Ajoutez 15 millilitres de HBSS aux débris placentaires, agitez vigoureusement pour récupérer davantage de cellules, puis effectuez une courte centrifugation par pulsation de l'échantillon.

De nouveau, prélevez le surnageant au pipetage et transférez-le dans le tube contenant le filtre à cellules placé sur le tube de collecte. Verser le surnageant directement sur le filtre à cellules peut s'avérer plus approprié, selon la consistance de l'échantillon. Rincez le filtre à cellules avec 5 millilitres de HBSS.

Jetez le tube contenant les débris de tissu placentaire. Centrifugez l'échantillon de surnageant pendant cinq minutes à 340 g pour former un culot cellulaire. Les globules rouges sont visibles sous forme d'une couche située au fond du culot, tandis que les cellules mononucléées, incluant les CSM, forment une couche plus claire au-dessus des globules rouges.

Replacer les échantillons dans la hotte de sécurité biologique. Verser soigneusement le surnageant et le jeter. Tapoter plusieurs fois le tube avec un doigt pour détacher le culot cellulaire, puis resuspendre le culot cellulaire dans 35 millilitres de milieu pour MSC.

Transférez la suspension cellulaire dans un flacon T175 par 10 millions de tissu, et cultivez dans une incubateur à 37 degrés avec 5 % de CO2. Après l'isolement, changez le milieu de culture après 48 heures. Alimentez les cultures une fois par semaine jusqu'à confluence.

Les cultures devraient être confluentes après environ 14 jours. Enfin, étendre et cryoconserver les cellules, analyser les caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les utiliser dans des expériences. Après 48 heures de culture, les CSM se seront attachées au plastique de culture tissulaire, tandis que les populations cellulaires hématopoïétiques et autres ne se seront pas fixées.

À ce stade, le milieu est remplacé par 35 millilitres de milieu de culture frais. L'aspect du surnageant de la culture peut varier considérablement entre les donneurs de placenta. L'exemple un et l'exemple deux illustrent cette variation.

Ces deux isolations ont été réalisées simultanément, mais à partir de deux placentas différents. Une fois lavées, les cultures sont débarrassées des globules rouges et des débris tissulaires, comme illustré dans l'exemple trois, et les résultats d'expansion ultérieurs sont généralement reproductibles. Après le changement de milieu à 48 heures, seules quelques cellules sont attachées au flacon.

Sept jours après l'isolement, des colonies de MSC de type fibroblastique sont visibles, bien que des cellules non MSC soient également présentes sous forme de cellules rondes ou faiblement adhérentes. Treize jours après l'isolement, les colonies de MSC fibroblastiques sont grandes, et souvent la monocouche de MSC est suffisamment confluente et prête à être passagée. À partir du premier passage, la monocouche de MSC développe une morphologie caractéristique en forme de tourbillon à la confluence.

Les CSM placentaires présentent un profil classique de marqueurs des CSM par analyse en cytométrie en flux. Les cellules sont positives pour CD73, CD105 et CD90, et négatives pour les marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34 et HLA-DR. Les CSM placentaires subissent généralement une différenciation ostéogénique robuste, mais une différenciation adipogénique faible.

De nombreuses publications supposent que les cellules isolées du chorion fœtal donnent des CSM fœtaux en culture. Cependant, comme nous l'avons rapporté précédemment, toutes les cultures dérivées du chorion fœtal à l'aide de ce protocole s'enrichissent rapidement en CSM maternels, comme on pouvait s'y attendre pour les cultures de CSM déciduaux maternels. Les données présentées ici quantifient la composition en cellules fœtales et maternelles des cultures de CSM placentaires isolées à partir de tissus déciduaux, de villosités choriales et de la plaque choriale.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'isoler et de mettre en culture des CSM provenant de tissu placentaire. Nous espérons que ces méthodes vous seront utiles dans vos recherches et applications cliniques qui pourraient utiliser des CSM dérivées du placenta.