Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et d’étendre les cellules stromales souches mésenchymateuses dérivées du tissu placentaire humain. Bonjour, je m’appelle Mike Doran. Je suis chef de groupe à l’Université de technologie du Queensland à l’Institut de recherche translationnelle de Brisbane, en Australie.

Bonjour, je m’appelle Rebecca Pelekanos et je suis chercheuse au Centre de recherche clinique de l’Université du Queensland. Aujourd’hui, je vais faire une démonstration de la procédure d’isolement MSC. Le placenta est normalement jeté après la naissance.

Parce que le tissu pèse de cinq à 700 grammes, il offre une source unique de cellules souches mésenchymateuses allogéniques. En général, les personnes qui débutent dans l’isolement des CSM placentaires auront des difficultés parce qu’elles ne connaissent pas l’anatomie du placenta et ne savent pas comment traiter les tissus et ne savent pas quel type de cellules, maternelles ou fœtales, peupleront leur culture finale de CSM. Pour aider les chercheurs, nous abordons ces détails importants dans cette vidéo.

La première étape de cette procédure consiste à vous orienter avec l’anatomie du placenta. La deuxième étape de cette procédure consiste à disséquer manuellement 10 grammes de tissu de la décidule, des villosités choriales ou de la plaque choriale, à l’aide de ciseaux. Les deux premières étapes sont à nouveau résumées ici de manière schématique.

À la troisième étape, la décidule, les villosités choriales ou les tissus de la plaque choriale sont encore hachés en petits morceaux avec des ciseaux. À la quatrième étape, les cellules sont libérées des petits morceaux de tissu via une digestion d’une à deux heures dans de la dispase et de la collagénase I.In la cinquième étape, les cellules sont séparées du tissu fibreux en les lavant à travers une passoire cellulaire. Les cellules sont ensuite collectées, remises en suspension dans un milieu de culture et placées dans des flacons de culture.

cellules stromales mésenchymateuses, MSC, seront sélectionnées en fonction de leur propension à l’adhérence plastique et de leur capacité à survivre et à proliférer dans le milieu de culture cellulaire. Enfin, dans la section des résultats, la MSC élargie peut être caractérisée et stockée pour être utilisée dans de futures expériences. Le placenta est un organe temporaire qui permet l’échange de nutriments et de déchets entre le fœtus et la mère pendant la grossesse.

Le placenta peut facilement être recueilli de manière aseptique après une césarienne et l’accouchement en toute sécurité du bébé. Le placenta est principalement composé de systèmes vasculaires et de membranes d’origine fœtale. Cependant, il contient également des cellules maternelles.

Le placenta est relié à l’utérus à la fois par des cellules déciduales dérivées de l’utérus maternel et des trophoblastes envahissants dérivés du fœtus. Il n’est généralement pas possible de discerner à l’œil nu l’interface précise entre les tissus maternels et fœtaux. Cependant, le côté fœtal du placenta est facilement identifié comme étant le côté où se trouve le cordon ombilical.

Lorsque le bébé est mis au monde, seule une fine couche de tissu décidual reste connectée au placenta. Grâce à l’orientation physique du placenta, il est possible de localiser les trois tissus que nous allons récolter aujourd’hui. Le premier tissu qui sera prélevé est la décidua maternelle.

Le marqueur vert pointe vers le tissu décidual qui reste à la surface après l’élimination du placenta de la paroi utérine. Le deuxième tissu qui sera prélevé à l’intérieur du placenta est les villosités choriales fœtales. Ceci est indiqué par les cercles bleus sur les diagrammes.

Le troisième tissu à prélever sera la plaque choriale fœtale. Ce tissu est identifié par les marqueurs rouges sur les schémas. D’accord, commençons.

Placez le placenta dans l’enceinte de sécurité biologique. Ouvrez les membranes fœtales et orientez-vous avec les parties du placenta. Le côté fœtal avec l’insertion du cordon ombilical, la laeve chorioamniotique ou sac amniotique.

La surface fœtale du placenta présente de gros vaisseaux sanguins évidents dans la plaque choriale, avec une membrane amniotique sus-jacente, qui, encore une fois, est facilement séparée mécaniquement. Le côté maternel est opposé au côté fœtal, avec les cotylédons ou lobes évidents. Assurez-vous que la surface maternelle est tournée vers le haut.

Coupez des morceaux de 0,5 cm d’épaisseur du côté maternel du placenta ou de la décidule. Pendant les dissections, placez des morceaux de tissu dans une boîte de Pétri contenant la solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, pour garder les tissus humides. Agitez les tissus dans les boîtes avec HBSS pour enlever un peu de sang.

Transférez suffisamment de tissu pour remplir le tube jusqu’à la marque de 10 millilitres d’un tube de 50 millilitres, soit environ 10 grammes. Notez qu’une plus grande quantité de tissu peut être isolée à ce stade si davantage de cellules sont nécessaires à la fin de la procédure. Assurez-vous que la surface du fœtus est tournée vers le haut.

Retirez mécaniquement la membrane amniotique de la surface fœtale du placenta, en laissant la plaque choriale intacte. Coupez la plaque choriale en bandes d’environ un demi-centimètre de profondeur dans le tissu des villosités en dessous. Ensuite, disséquez le tissu des villosités choriales à environ un centimètre de profondeur dans le placenta à partir duquel la plaque choriale a été retirée.

Placez les tissus dans HBSS et mesurez environ 10 millilitres de tissu comme cela a été fait précédemment. Transférez les morceaux de tissu, avec un transfert de liquide minimal, dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et coupez-les en petits morceaux d’environ un millilitre cube, avec des ciseaux. Transférez le tissu haché dans le tube de 50 mil.

Répétez l’opération pour tous les échantillons de tissus restants. Ajoutez le milieu de digestion fraîchement préparé dans un rapport d’au moins un pour un avec le tissu. Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger.

Incuber les tissus dans le tube avec un milieu de digestion pendant une à deux heures, à 37 degrés dans un incubateur agitant. Lorsque la solution de digestion tissulaire a pris un aspect trouble et que les vaisseaux sanguins blancs étaient évidents en solution, ajoutez 15 millilitres de HBSS pour diluer les enzymes dans le milieu de digestion. Centrifuger brièvement les échantillons jusqu’à ce qu’elle atteigne 340 g pendant cinq secondes, puis arrêter.

Cela forcera les gros débris à s’accumuler au fond du tube. Retourner les échantillons dans l’enceinte de sécurité biologique. Placez une crépine cellulaire dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Pipeter le surnageant contenant les cellules mononucléées dans la crépine, en attrapant l’éluat dans le nouveau tube. Laissez les débris de tissu placentaire dans le premier tube. Ajoutez 15 millilitres de HBSS aux débris placentaires, secouez vigoureusement pour récupérer plus de cellules et centrifugez l’échantillon par impulsions.

Encore une fois, pipetez le surnageant dans le tube à l’aide de la crépine de cellule dans le tube de prélèvement. Il peut être plus approprié de verser le surnageant dans la crépine de la cellule, selon la consistance de l’échantillon. Lavez la passoire cellulaire avec 5 millilitres de HBSS.

Jetez le tube contenant les débris de tissu placentaire. Centrifugez l’échantillon surnageant pendant cinq minutes à 340 g pour granuler les cellules. Les globules rouges sont visibles sous la forme d’une couche au fond de la cuiller, et les cellules mononucléaires, y compris les CSM, sont la couche plus légère au-dessus des globules rouges.

Retourner les échantillons dans l’enceinte de sécurité biologique. Décanter soigneusement le surnageant et le jeter. Agitez le tube plusieurs fois avec un doigt pour déloger la pastille cellulaire et remettez la pastille en suspension dans 35 millilitres de milieu MSC.

Transférez la suspension cellulaire dans une fiole T175 par 10 mils de tissu, et cultivez-la dans un incubateur à 37 degrés avec 5 % de CO2. Après l’isolement, changez le milieu de culture après 48 heures. Nourrissez les cultures une fois par semaine jusqu’à ce qu’elles soient confluentes.

Les cultures devraient être confluentes d’ici environ 14 jours. Enfin, agrandissez et cryoconservez les cellules, analysez les caractéristiques des CSM et utilisez-les dans des expériences. Après 48 heures de culture, les CSM se seront attachées au plastique de culture tissulaire, contrairement aux populations hématopoïétiques et aux autres cellules.

À ce moment, le milieu est remplacé par 35 millilitres de milieu de culture frais. L’apparence du surnageant de culture peut varier considérablement d’un donneur de placenta à l’autre. Les exemples un et deux illustrent cette variation.

Ces deux isolements ont été réalisés simultanément, mais à partir de deux placentas différents. Une fois lavées, les cultures sont exemptes de globules rouges et de débris tissulaires, comme le montre le troisième exemple, et les résultats d’expansion subséquente sont généralement cohérents. Après le changement de milieu de 48 heures, seules quelques cellules sont fixées au flacon.

Sept jours après l’isolement, les colonies de CSM fibroblastiques sont visibles, bien que des cellules non CSM soient également présentes, sous forme de cellules rondes ou faiblement attachées. 13 jours après l’isolement, les colonies de CSM fibroblastiques sont grandes et souvent la monocouche de CSM est suffisamment confluente et prête à passer. Du passage à la suite, la monocouche MSC développe une morphologie caractéristique de tourbillon à la confluence.

Les CSM placentaires présentent un profil de marqueur CSM classique par analyse par cytométrie en flux. Les cellules sont positives pour CD73, CD105 et CD90, et négatives pour les marqueurs hématopoïétiques de CD45, CD34 et HLA-DR. Les CSM placentaires subissent généralement une différenciation ostéogénique robuste mais une faible différenciation adipogénique.

De nombreuses publications supposent que les cellules isolées du chorion fœtal produisent des CSM fœtales lors de la culture. Cependant, comme nous l’avons signalé précédemment, toutes les cultures dérivées du chorion fœtal utilisant ce protocole s’enrichissent rapidement pour les CSM maternelles, comme on pourrait s’y attendre pour les cultures de CSM déciduales maternelles. Les données présentées ici quantifient la composition cellulaire fœtale et maternelle des cultures de CSM placentaires isolées à partir de tissus décidaux, de villosités choriales et de plaques choriales.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une assez bonne idée de la façon d’isoler et de cultiver des CSM dérivées du tissu placentaire. Nous espérons que vous trouverez ces méthodes utiles dans vos recherches et vos applications cliniques qui pourraient utiliser des CSM dérivées du placentaire.