Name: Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour In Vivo Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez le suivi des neutrophiles dans la moelle osseuse murine grâce à une chambre à fenêtre fémorale et à la microscopie intravitale. Cette méthode permet l'imagerie longitudinale des cellules immunitaires in vivo.

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Les auteurs tiennent à remercier le Fonds avancée Microscopie optique (de www.aomf.ca) au Réseau universitaire de santé de l&#39;aide à la microscopie, et M. Jason Ellis de la princesse Margaret Cancer Center Machine Shop pour la fabrication du WC et l&#39;étape d&#39;imagerie. Nous tenons également à remercier le Dr Iris Kulbatski pour l&#39;édition de manuscrits.

NOTE: Tous les travaux des animaux a été effectuée dans le protocole # 2615 approuvé par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux University Health Network. 1. Préparation chirurgicale de la souris <ol><li> Avant la chirurgie, stériliser les instruments chirurgicaux et la chambre à fenêtre (WC) par autoclavage. Compléter l&#39;eau potable avec 50 mg / kg de poids corporel de l&#39;amoxicilline 2 jours avant l&#39;intervention chirurgicale. Injecter de la souris avec 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine par voie intrapéritonéale 4 heures avant l&#39;intervention chirurgicale. </li><li> Anesthetize la souris nude athymiques par injection intrapéritonéale d&#39;une solution saline 350-400 ul contenant 80 mg / kg de kétamine et 13 mg / kg de xylazine (Note: Ceci a été approuvé par le Comité de protection des animaux dans les institutions, et nous avons pas eu une expérience avec des effets indésirables ). Confirmer l&#39;anesthésie correcte en testant pied réflexe. Continuer d&#39;observation du rythme respiratoire, la couleur des muqueuses et réflexes du pied au cours de la procédure. </li><li> Effectuer la pr chirurgicaleocedures sous une enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles au cours de la chirurgie. Placer la souris sur un coussin chauffant électrique recouverte d&#39;un drap chirurgical pour maintenir la température du corps pendant l&#39;intervention chirurgicale. Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous la loupe binoculaire. </li><li> Appliquer une pommade oculaire pour garder les yeux humides pendant la chirurgie. Répéter si nécessaire pendant la procédure chirurgicale. La stérilisation de la zone de fonctionnement de la souris en essuyant avec 7,5% de povidone-iode, 70% d&#39;alcool isopropylique et 10% de povidone-iode consécutivement, et répéter deux fois cette procédure. </li><li> Faire une incision longitudinale de la peau de 10 mm en utilisant un scalpel avec une lame (# 15), se rapprochant du fémur du côté latéral. Exposer le fémur entre les muscles fléchisseurs et extenseurs par dissection en utilisant des pinces hémostatiques et pour assurer la fonctionnalité musculaire. </li><li> Insérez la barre en forme de U sous l&#39;os, et installer le WC (Figure 1). Fixer la barre à la fenêtre en utilisant deux écrous, et serrer les écrous avec pourCèpes. Remplir l&#39;espace entre l&#39;os et le WC avec du ciment dentaire. </li><li> Broyer l&#39;os cortical dans une région de 2 mm x 2 6 avec un micro-foret pour obtenir un accès optique à la cavité médullaire. Remarque: Inspectez soigneusement l&#39;amincissement de l&#39;os cortical sous le microscope pendant cette procédure. Laissez une couche de périoste intact, presque transparent de l&#39;os. </li><li> Placez le 8 mm lamelle sur la fenêtre, et fixer la lamelle avec un anneau élastique pour le maintenir en place. </li><li> Réajuster la musculature des muscles fléchisseurs et extenseurs de retour à leur emplacement d&#39;origine en utilisant des pinces pour maintenir leur fonction après la chirurgie. Suturer le derme à l&#39;aide de fil de suture 5-0 et un porte-aiguille. </li><li> Surveiller la souris pour la récupération, jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit conscient et est en mesure de se déplacer librement. Mettre l&#39;animal dans une nouvelle cage lorsqu&#39;ils ont été récupérés. </li><li> Après la récupération, effectuer l&#39;acquisition d&#39;images sur l&#39;animal le même jour ou les jours suivants (voir la section 2). Surveiller la phyétat cal de la souris quotidienne. Note: Surveiller les conditions physiques, telles que le poids portant sur le membre, courbant, respiration rapide ou superficielle, gonflement des membres postérieurs, l&#39;auto-mutilation, la cellulite et la dermatite sévère. </li><li> Donner une injection intrapéritonéale de 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine pendant 3 jours et 1 mg / kg de poids corporel du méloxicame pendant 5 jours après la chirurgie pour le traitement de la douleur et de l&#39;inflammation post-opératoire. Continuer à fournir l&#39;eau amoxicilline supplémenté pendant 5 jours. </li><li> Au point limite expérimental, euthanasier l&#39;animal par le CO 2 narcose suivie d&#39;une méthode secondaire (par exemple, la dislocation cervicale). </li></ol> 2. Acquisition d&#39;image à l&#39;aide combinée multi-photon et microscopie confocale <ol><li> Avant l&#39;imagerie, anesthésier les souris par injection intraperitoneale d&#39;une solution saline 350 à 400 pi contenant 80 mg / kg de kétamine et 13 mg / kg de xylazine. Vous pouvez également utiliser un anesthésique inhalable, lorsqu&#39;il est disponible.Appliquer une pommade oculaire. </li><li> Injecter le mélange de colorants intravasculaires pour l&#39;étiquetage vasculature (0,65 mg de 2 MDa fluorescéine (FITC) -dextrane) et de neutrophiles (4 ug de allophycocyanine (APC) anticorps Ly6G -anti). </li><li> Utiliser un multi-photons combiné en position verticale et confocal équipé d&#39;un laser à photons multiples allant 705-980 nm pour l&#39;excitation à deux photons, ainsi que les lasers à photon unique qui fournit des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation du bleu au rouge. </li><li> Définir une étape d&#39;imagerie sur mesure sur le microscope (figure 1B). Fixer la souris sur la scène par serrage des deux extrémités du WC avec des pinces crocodiles. Remarque: Les composants critiques de la scène sont: deux pinces crocodile pour maintenir le WC, et un élément de chauffage pour maintenir la température physiologique (37 ° C) de la souris lors de l&#39;imagerie. </li><li> Allumez le laser à deux photons et le système confocal, et lancer le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image en cliquant sur &quot;Start System&quot;. Une fenêtre avec 4 onglets (Localiser,Acquisition, traitement, et maintenir) ouvrira. </li><li> Mettre en place les canaux d&#39;imagerie. Cliquez sur «Smart Setup» sous l&#39;onglet Acquisition et choisissez les colorants qui seront utilisés pour l&#39;imagerie: FITC (excitation à 488 nm, 493-588 nm émission) et APC (633 nm excitation et 638-743 nm émission). Choisissez &quot;Meilleur Signal&quot; et cliquez sur &quot;Appliquer&quot;. </li><li> Ajouter la deuxième génération d&#39;harmoniques (SHG) canal d&#39;acquisition d&#39;image manuellement. Allumez le laser à deux photons dans la fenêtre &quot;Laser&quot; dans l&#39;onglet Acquisition. Sous la fenêtre Canaux, cliquez sur le signe &quot;+&quot; pour ajouter une piste. </li><li> Mettre en place la piste SHG. Changer la longueur d&#39;onde de 840 nm sous la fenêtre des canaux en utilisant les flèches vers le haut et vers le bas, et choisissez la plage de détection à être 415-425 nm sous la fenêtre &quot;Path Light&quot; en utilisant la barre de défilement. </li><li> Cliquez sur &quot;Oculaires en ligne&quot; sous l&#39;onglet Locate. Cliquez sur FITC sous le réglage de filtre pour FITC pour afficher la région d&#39;intérêt et d&#39;ajuster la mise au point manuellement en tournant til se concentre bouton sur le côté du microscope. Lorsque la région d&#39;intérêt se trouve, cliquez sur &quot;Oculaires Hors ligne&quot; sous l&#39;onglet Locate. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet Acquisition. Sélectionnez la piste FITC sous la fenêtre des canaux et cliquez sur &quot;Live&quot; pour prévisualiser l&#39;image de FITC-dextran avec l&#39;objectif 5X. Réglez la mise au point, si nécessaire, et cliquez sur &quot;Stop&quot; sous l&#39;onglet Acquisition pour arrêter la prévisualisation. </li><li> Tourner manuellement à 20X objective de l&#39;eau en déplaçant une roue au-dessus des lentilles. Voir l&#39;image à nouveau pour FITC-dextran en utilisant l&#39;objectif 20X, et ajuster Master Gain et sténopé sous la fenêtre des canaux pour obtenir un signal optimal et le contraste. Répéter pour les autres canaux en sélectionnant APC et SHG pistes sous la fenêtre des canaux. </li><li> Choisissez les paramètres d&#39;imagerie. Cliquez sur &quot;Mode d&#39;acquisition&quot; pour ouvrir sa fenêtre. Définissez la taille de l&#39;image soit 1.024 x 1.024 pixels, et la moyenne de 4X pour obtenir des images de haute qualité. </li><li> Acquérir un instantané 2D. Sélectionnez tous les canaux sous les canaux gagnentdow et cliquez sur &quot;Snap&quot; sous l&#39;onglet Acquisition. Vérifiez la qualité de l&#39;image et de modifier les paramètres d&#39;imagerie si nécessaire. </li><li> Acquérir image 2D time-lapse. <ol><li> Cochez &quot;Time Series&quot; dans l&#39;onglet Acquisition pour ouvrir la fenêtre Time Series. Tapez 0 dans les intervalles, et 40 pour le nombre total de balayages de prendre 40 images en continu, sans intervalle de temps. Note: 40 scans génère environ 5 minutes de temps-série avec une vitesse de balayage de 7,5 sec / cadre et la taille de l&#39;image de 600 um x 600 um. Ajuster l&#39;intervalle et le nombre de balayages en fonction du microscope, les paramètres d&#39;acquisition d&#39;image et la vitesse de l&#39;appareil de trame. Un intervalle de temps fixe (&gt; 0 sec) peut être utilisé pour comparer les images time-lapse acquises à différents moments. Une durée plus longue d&#39;imagerie time-lapse peut être nécessaire en fonction de la vitesse moyenne attendue des neutrophiles (ou d&#39;autres cellules d&#39;intérêt) dans la condition expérimentale. </li></ol></li><li> Acquérir image 3D.<ol><li> Cochez &quot;Z-Stack&quot; dans l&#39;onglet Acquisition pour ouvrir la fenêtre Z-Stack. Démarrez le &quot;Live&quot; mode de prévisualisation pour FITC-dextran. Focus sur la partie supérieure de l&#39;échantillon et cliquez sur &quot;Définir d&#39;abord», et se concentrer sur l&#39;autre extrémité de l&#39;échantillon et cliquez sur &quot;Définir Last&quot; dans la fenêtre Z-stack. </li><li> Réglez l&#39;intervalle de 10 um sous la fenêtre Z-stack. En fonction de la première et de la dernière tranche optique sélectionné à l&#39;étape précédente, cela va générer 10-20 tranches, avec une épaisseur optique globale de 90 à 180 um. Remarque: L&#39;intervalle z pile dépend de la taille du trou d&#39;épingle, qui détermine l&#39;épaisseur de la tranche optique. Régler l&#39;intervalle soit inférieure à l&#39;épaisseur de la tranche optique. </li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer Experiment&quot; sous l&#39;onglet Acquisition de commencer à recueillir des images. </li></ol></li><li> Acquérir image 3D time-lapse. <ol><li> Cochez &quot;Time Series&quot; et &quot;Z-stack&quot; dans l&#39;onglet Acquisition pour ouvrir la série chronologiqueet les fenêtres Z-stack. </li><li> Mettre en place la série Le temps et les paramètres d&#39;acquisition Z-stack comme décrit dans les étapes 2.14 et 2.15. Cliquez sur &quot;Démarrer Experiment&quot; sous l&#39;onglet Acquisition de commencer à recueillir des images. </li></ol></li><li> Surveiller la souris lors de l&#39;imagerie pour vous assurer qu&#39;il est stable et inconscient. Si la souris est instable et / ou consciente lors de l&#39;imagerie, retirez la souris de la scène, l&#39;injection supplémentaire de 100-150 ul de la solution anesthésique par voie intrapéritonéale, et continuer l&#39;imagerie. Remarque: Les signes d&#39;instabilité comprennent une respiration rapide et le mouvement de la souris, qui peut être vu comme déplacer des objets dans les images acquises. </li><li> Après l&#39;acquisition d&#39;image, prenez la souris hors de la scène et le retourner à la cage. Utilisez une lampe chauffante pour le garder au chaud, et de surveiller la souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit conscient. </li></ol> Analyse et Quantification 3. image <ol><li> Utilisez un logiciel d&#39;analyse d&#39;images pour analyser les données 3D et de séries chronologiques. Ouvrez le logiciel etajouter des images en les faisant glisser dans l&#39;écran ouvert, qui est appelé vue &quot;Arena&quot;. Double-cliquez sur un fichier image pour l&#39;ouvrir; l&#39;image sera ouverte sous &quot;Surpass&quot; vue. </li><li> Créer une image 2D / 3D. <ol><li> Dans la barre «Plus» qui se trouve sur le coin en haut à droite, cliquez sur &quot;Modifier / Afficher Réglage de l&#39;affichage&quot; pour ouvrir &quot;Réglage de l&#39;affichage&quot; fenêtre. Optimiser l&#39;affichage de la fluorescence en ajustant les seuils pour chaque canal, et prendre une photo pour enregistrer l&#39;image. </li></ol></li><li> Générer des pistes d&#39;objets en utilisant des images de time-lapse. <ol><li> Ouvrez l&#39;image à analyser sous &quot;Surpass&quot; vue. Cliquez sur l&#39;icône avec une image de points orange, trouvé sous l&#39;icône &quot;Surpass&quot;. Cela va ouvrir une nouvelle fenêtre &quot;Spots&quot;. </li><li> Cochez &quot;Spots de piste (dans le temps)&quot; et cliquez sur la flèche bleue pour aller à l&#39;étape suivante. Sélectionnez le canal contenant les objets à suivre sous &quot;Source Channel&quot;, et définir le Diamet objet estiméer sous &quot;estimée Diamètre XY&quot; en tapant un numéro. Cliquez sur la flèche bleue pour aller à l&#39;étape suivante. Remarque: Pour le suivi des neutrophiles, sélectionnez le canal contenant APC fluorescence pour les neutrophiles et régler le diamètre de l&#39;objet à 12 pm en fonction de la taille connue de neutrophiles. </li><li> Dans la fenêtre, recherchez et sélectionnez &quot;Qualité&quot; filtre en cliquant sur la flèche vers le bas. Observer les points définis par le logiciel et régler le seuil manuellement pour inclure ou exclure des taches. Une fois que le seuil est défini, cliquez sur la flèche bleue pour passer à l&#39;étape &quot;Suivi&quot;. </li><li> Avec l&#39;algorithme, trouver et sélectionner &quot;Autoregressive Mouvement Algorithm&quot; en cliquant sur la flèche vers le bas. Tapez 10 pm pour &quot;Max Distance&quot; et 3 pour &quot;Taille Max Gap&quot; trouvé sous Paramètres. Cochez «Combler les lacunes avec tous les objets détectés&quot; pour commencer le suivi, et cliquez sur la flèche bleue pour aller à l&#39;étape suivante. Note: &quot;algorithme de mouvement Autoregressive» est utilisé fou des objets qui ont dirigé le mouvement, car il génère des pistes basées sur l&#39;emplacement prévu du mouvement précédent. &quot;Max Distance&quot; et &quot;Max Gap Size&quot; peut être ajustée en fonction de la dimension attendue et la vitesse de l&#39;objet suivi, ainsi que la durée globale de l&#39;image time-lapse. </li><li> Sous Type de filtre, sélectionnez le &quot;Track Durée&quot; filtre. Cliquez sur la flèche verte pour terminer le suivi et vérifier les pistes qui ont été générés. Retour à l&#39;étape précédente si nécessaire pour trier manuellement les pistes. </li></ol></li><li> Si l&#39;image dérives time-lapse générés, corriger la dérive de la traduction. <ol><li> Cliquez sur l&#39;icône avec une image d&#39;un crayon. Ceci est un onglet d&#39;édition qui ouvre &quot;Modifier Tracks&quot; fenêtre. Examinez l&#39;image time-lapse et trouver une place de référence qui ne devrait pas être en mouvement pour toutes les images. </li><li> Dans le coin supérieur gauche de l&#39;écran, trouver &quot;Pointer&quot; fenêtre et cocher &quot;Sélectionner&quot; pour activer le cursor pour sélectionner un endroit. Cliquez sur le point de référence. </li><li> Cliquez sur &quot;Drift correcte&quot; dans la fenêtre &quot;Modifier Tracks&quot;. Cochez &quot;Translational Drift&quot;. Le logiciel génère automatiquement la série corrigée des images. </li></ol></li><li> Mesurer le mouvement cellulaire défini par les traces d&#39;objets dans les images de time-lapse. <ol><li> Sous la fenêtre &quot;Modifier Tracks&quot;, cochez &quot;Tracks&quot; et sélectionnez une piste qui représente le mouvement d&#39;une cellule. La piste sélectionnée sera surlignée en jaune dans l&#39;image des séries chronologiques. </li><li> Cliquez sur l&#39;icône avec une image d&#39;un graphique pour ouvrir la fenêtre (onglet statistiques) &quot;Statistiques&quot;. </li><li> Sous &quot;Sélection&quot;, sélectionnez &quot;Track Vitesse moyenne&quot; en cliquant sur la flèche vers le bas pour générer la vitesse de la piste signifie pour la piste sélectionnée. Choisissez différentes pistes et répétez les étapes pour mesurer la vitesse de la piste signifie pour toutes les cellules d&#39;intérêt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrents.

En temps réel, l&#39;imagerie en série des processus cellulaires dynamiques dans la moelle osseuse contient des informations qui est par ailleurs difficile à obtenir en utilisant des techniques classiques telles que l&#39;histologie et la numération totale du sang. Le modèle de WC du fémur décrit ici offre des occasions uniques pour enquêter sur des altérations cellulaires et structurelles dans la moelle osseuse au fil du temps. Bien qu&#39;un modèle fémur WC a été indiqué précédemment, notre nouvelle conception fournit...

La moelle osseuse est un organe important impliqué dans l&#39;hématopoïèse et la régulation immunitaire. Il se compose d&#39;un composant hématopoïétique contenant des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (hspC), et un composant de stroma contenant des cellules progénitrices non hématopoïétiques qui donnent naissance à des cellules mésenchymateuses 1. Deux tiers de l&#39; activité hématopoïétique est dédié à la génération de cellules myéloïdes 2. En particulier, un grand nombre de neutrophiles sont produites dans la moelle osseuse, avec 1-2 x 10 cellules 11 produites par jour chez un humain adulte normal 2. Les neutrophiles sont la première ligne de défense contre les infections microbiennes et sont principalement réservés dans la moelle osseuse jusqu&#39;à ce que le stress déclenche leur mobilisation pour compléter les neutrophiles périphériques 1,3. En plus de leurs effets anti-microbiens, des études récentes suggèrent un rôle important de neutrophiles dans la biologie du cancer, ayant à la fois pro- et anti- tumorigène phénotypes en fonction de la croissance transformantfacteur bêta (TGF-β) de signalisation dans le 4,5 microenvironnement de la tumeur. Par ailleurs, des études ont montré que les neutrophiles qui accumulent dans les tumeurs primaires exercent des effets pro-tumorigènes et métastatiques en supprimant la fonction cytotoxique des lymphocytes T 6,7, tandis que les neutrophiles en circulation exercent un cytotoxique, un effet anti-métastatique 8. En tant que tel, enquête sur les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse, en particulier des neutrophiles, est cruciale pour élucider leur rôle dans la régulation immunitaire et la tumeur. Histopathologie et un dénombrement complet du sang périphérique sont couramment utilisés pour évaluer les altérations cellulaires et structurelles dans la moelle osseuse 9. Cependant, ces procédés ne fournissent que des informations statiques de différentes populations cellulaires ou des microstructures de tissu. Longitudinale imagerie in vivo peut être utilisé en combinaison avec les méthodes standard pour évaluer la dynamique de plusieurs cellules, vasculaires et stromales, ainsi que des composants de cellule à cinteractions ell de manière longitudinale. Microscopie intravitale (IVM), définie comme l&#39; imagerie d&#39;animaux vivants à une résolution microscopique 10 est particulièrement utile pour l&#39; évaluation des processus cellulaires dynamiques au cours du temps dans un même échantillon, ce qui réduit le nombre d&#39;animaux d&#39; expérimentation nécessaire. IVM est souvent combiné avec une chambre de fenêtre chroniquement transplanté (WC) pour accéder à l&#39;organe d&#39;intérêt pour l&#39;imagerie sur une durée de quelques semaines ou mois. modèles WC crâniennes et dorsale-skinfold ont la plus longue histoire d&#39;utilisation qui remonte au milieu des années 1990. Plus récemment, d&#39; autres modèles de WC spécifiques d&#39;organes , tels que ceux du coussinet adipeux mammaire et les divers organes de l&#39; abdomen ont été développés 11. L&#39;approche typique pour l&#39; imagerie de la moelle osseuse in vivo est exposée principalement impliquée de la calvaria de souris, où l&#39;os amincie permet la visualisation directe des cellules individuelles avec une intervention chirurgicale minimale 12-14. Cependant, l&#39;os calvarial osseuse peut be distinct de celui des autres os, tels que l&#39;os long, tel que démontré par un nombre inférieur de HSPCs et les cellules hypoxiques dans calvaria, qui indique le maintien et le développement de HSPCs 15 réduite. Par conséquent, des approches alternatives pour l&#39;évaluation des composants cellulaires dans l&#39;os long ont été étudiés. Ceux - ci comprennent l&#39; exposition directe de l&#39;os fémoral osseuse 16 et de la transplantation ectopique du fémur scission du dorsale skinfold WC 17. Cependant, la première est une procédure de terminal qui ne permet pas le suivi des altérations cellulaires, structurelles et fonctionnelles sur des périodes de temps plus longues, et le second probablement perturbe le fonctionnement normal de la moelle osseuse en raison de la transplantation du fémur à un site ectopique à l&#39;intérieur du WC dorsale du pli cutané. Une autre méthode qui permet une imagerie en série orthotopique de la moelle osseuse du fémur au cours du temps est l&#39;utilisation d&#39;un WC dans l&#39;os du fémur. Un rapport précédent a démontré l&#39;imagerie à long terme de la microcirculation dans l&#39;os fémoral osseuse au moyen d&#39;unfémur WC chez les souris 18. En outre, les auteurs ont démontré la visualisation des cellules tumorales dans le fémur, ce qui indique son utilité dans la métastase de la moelle osseuse de surveillance. Cependant, cette conception de WC est limitée par sa grande taille (1,2 cm de diamètre) et relativement petite surface d&#39;imagerie (4 mm de diamètre), qui est uniquement pour la grande souris (26-34 g, 3-6 mois), ce qui rend le approche pratique pour une utilisation de routine. Par conséquent, un nouveau WC avec une taille globale plus petite et la plus grande surface d&#39;imagerie interne a été conçue dans le but de la présente étude. Le but de cette étude était de fournir un procédé pour imager différents types de cellules dans la moelle osseuse du fémur. Le modèle de WC du fémur a été développé en interne et a été utilisé pour visualiser et suivre neutrophiles dans le réseau vasculaire 3D. En utilisant ce modèle, MIV de la moelle osseuse peut être réalisée en série sur 40 jours. Cette approche peut être appliquée à une variété de domaines pour élucider les processus de l&#39;hématopoïèse, une régulation immunitairele développement de la tumeur nd.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F souris nues athymiques</td><td>Taconic</td><td>Ncr nude</td><td>8-10 semaines, femelles</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de kétamine</td><td>Bioniche Santé animale Canada, Inc.</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Champ chirurgical</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant électrique</td><td>Life Brand</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux (gel lacrymal)</td><td>Novartis&nbsp ;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7,5 % de bétadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’alcool isopropylique</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10 % de bétadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort courbés</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince Graefe extra fine</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-foret</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Fraises de micro-foret</td><td>Outils de science fine</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de fenêtre fémur</td><td>PMCC atelier</td><td>d’usinage conception sur mesure</td><td>9,1 mm- 8,5 mm- 7,5 mm (diamètre extérieur à intérieur), 2,16 mm (rayon de deux trous), 13,9 mm (distance entre deux trous), 0,7 mm (épaisseur)</td></tr><tr><td>Barre en forme de U</td><td>PMCC atelier</td><td>d’usinage conception</td> <td>sur mesure13,8 mm (longueur), 1,6 mm (largeur), 3,7 mm (hauteur)</td></tr><tr><td>Verre de protection (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp ;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Bague de retenue (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>Écrous (hexagone en acier inoxydable)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Ciment dentaire</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Suture (5-0 Monosof noir)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td>Porte-aiguille</tr><tr><td>Halsey</td><td>Outils de science fine</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine (Temgesic)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicilline (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-souris Ly-6G (Gr-1)&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à deux photons LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Platine d’imagerie</td><td>PMCC atelier</td><td>d’usinage conception sur mesure</td><td>15,9 cm (longueur), 11 cm (largeur), 0,9 cm (hauteur)</td></tr><tr><td>Logiciel Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Logiciel d’analyse d’images décrit à la section 3 du protocole&nbsp ;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Logiciel d’acquisition d’images décrit à la Section 2 du Protocole&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

fémur fenêtre chambre modèle pour<em&gt; in vivo</em&gt; suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

La moelle osseuse est un organe complexe qui contient diverses cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques. Ces cellules sont impliquées dans de nombreux processus biologiques, notamment l’hématopoïèse, la régulation immunitaire et la régulation tumorale. Les méthodes couramment utilisées pour comprendre les actions cellulaires dans la moelle osseuse, telles que l’histologie et la numération globulaire, fournissent des informations statiques plutôt que de capturer l’action dynamique de plusieurs composants cellulaires in vivo. Pour compléter les méthodes standard, un modèle basé sur une chambre fenêtre (WC) a été développé pour permettre l’imagerie in vivo en série des cellules et des structures de la moelle osseuse murine. Ce protocole décrit une intervention chirurgicale pour l’installation du WC dans le fémur, afin de faciliter l’accès optique à long terme à la moelle osseuse fémorale. En particulier, pour démontrer son utilité expérimentale, cette approche WC a été utilisée pour imager et suivre les neutrophiles dans le réseau vasculaire du fémur, fournissant ainsi une nouvelle méthode pour visualiser et quantifier le trafic et la régulation des cellules immunitaires dans la moelle osseuse. Cette méthode peut être appliquée pour étudier divers processus biologiques dans la moelle osseuse murine, tels que l’hématopoïèse, la greffe de cellules souches et les réponses immunitaires dans des conditions pathologiques, y compris le cancer.

Murine fémorale de la moelle osseuse est accédé avec succès à l&#39; aide du WC pour permettre la visualisation des neutrophiles et des réseaux individuels vasculaires. La figure 1 montre l&#39;instrument WC et décrit la procédure chirurgicale, qui comprend une exposition de l&#39;os du fémur et de l&#39; amincissement de la corticale pour avoir accès optique à l&#39; intérieur du OS. La chirurgie est bien tolérée chez la souris; ils ont été évalués pour des réactions ph...

Le protocole décrit un nouveau modèle de chambre fenêtre du fémur murin qui peut être utilisé pour suivre le mouvement des cellules dans la moelle osseuse fémorale in vivo. La microscopie à fluorescence multiphotonique intravitale est utilisée pour imager trois composants de la moelle osseuse fémorale (système vasculaire, matrice de collagène et neutrophiles) au fil du temps.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer un suivi microscopique à long terme des neutrophiles dans les structures vasculaires de la moelle osseuse murine à l'aide d'une chambre à fenêtre chronique implantée au-dessus du fémur. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en immunologie et en oncologie concernant le rôle des monocytes dans la régulation d'une infection, la tumorigenèse et les métastases tumorales. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet un accès microscopique prolongé à la moelle osseuse fémorale, site central de l'hématopoïèse, et qu'elle fournit des informations dynamiques difficiles à obtenir par des méthodes conventionnelles.Bien que cette méthode soit spécifique à l'imagerie des neutrophiles dans un réseau vasculaire, elle peut également être utilisée pour visualiser d'autres populations de cellules immunitaires d'intérêt. Le jour de l'intervention chirurgicale, confirmez le niveau approprié de sédation par l'absence de réponse à une pincée des orteils d'une souris nue athymique. Ensuite, placez la souris sur un tapis chauffant électrique, recouverte d'un champ opératoire, sous un microscope stéréo.Ensuite, appliquer une pommade sur les yeux de l'animal et stériliser la zone chirurgicale à l’aide de deux passages successifs avec du polyvidone-iode à 7,5 %, de l’alcool isopropylique à 70 % et du polyvidone-iode à 10 %. Une fois l’animal préparé, utiliser un scalpel muni d’un embout n°15 pour pratiquer une incision cutanée longitudinale de 10 millimètres en approchant le fémur par la face latérale. Puis, effectuer une dissection émoussée à l’aide de pinces et de pinces hémostatiques afin d’exposer le fémur entre les muscles fléchisseurs et extenseurs.Lorsque le fémur est visible, insérez une barre en forme de U sous l'os et installez la chambre à fenêtre. À l'aide de deux écrous, fixez la barre à la fenêtre. Ensuite, serrez les écrous avec une pince.Utilisez la pince pour réajuster la musculature des fléchisseurs et des extenseurs à leurs emplacements d'origine. Remplissez l'espace entre l'os et la chambre de fenêtre avec du ciment dentaire afin de fixer la chambre de fenêtre en place. Ensuite, utilisez un micro-perceuse pour aplanir une zone de six par deux millimètres dans l'os cortical afin d'obtenir un accès optique à la cavité médullaire.Lorsqu'une couche périostée presque transparente de l'os a été obtenue, placez un verre de couverture de huit millimètres sur la fenêtre et utilisez un anneau de fixation pour maintenir le verre de couverture en place. Fermez ensuite le derme à l'aide d'un point de suture 5-0 et d'un porte-aiguille. Puis, placez la souris dans une nouvelle cage avec de la litière propre, et surveillez-la jusqu'à ce qu'elle soit complètement rétablie.Pour obtenir des images combinées de microscopie multiphoton et confocale à travers la chambre à fenêtre, injectez d'abord les solutions fluorescentes appropriées d'étiquetage des neutrophiles vasculaires dans la veine de la queue de la souris. Fixez les extrémités de la chambre à fenêtre à l'aide de pinces crocodile afin d'attacher la souris sur une platine sur mesure. Ensuite, placez la platine d'imagerie sur le microscope combiné multiphoton et confocal.Lorsque la souris est bien fixée, activez le laser à deux photons et le système confocal, puis cliquez sur Démarrer le système pour lancer le logiciel d'acquisition d'images. Pour configurer les canaux d'imagerie, sous l'onglet Acquisition, cliquez sur Configuration rapide et sélectionnez les lasers pour l'imagerie. Choisissez Meilleur signal, puis cliquez sur Appliquer.Ajoutez manuellement le canal d'acquisition d'image de génération du deuxième harmonique en activant le laser à deux photons dans la fenêtre Laser, puis en réglant les longueurs d'onde d'acquisition appropriées pour la génération du deuxième harmonique. Sous l'onglet Localiser, cliquez sur Oculaires en ligne et localisez la région d'intérêt à travers le microscope par inspection visuelle. Cliquez sur Oculaires hors ligne, puis ouvrez l'onglet Acquisition.Dans la fenêtre Canaux, sélectionnez la piste FITC et cliquez sur Direct pour prévisualiser l'image du dextran marqué au FITC avec un objectif 5x. Ajustez la mise au point si nécessaire. Ensuite, cliquez sur Arrêter dans l'onglet Acquisition pour mettre fin à la prévisualisation.Maintenant, sélectionnez manuellement l'objectif à immersion dans l'eau 20x et visualisez à nouveau l'image de la dextrane marquée par la FITC, en ajustant le gain principal et le diaphragme dans la fenêtre des canaux pour obtenir le meilleur signal et contraste. Lorsqu'une image optimale a été obtenue pour les trois canaux, sélectionnez tous les canaux dans la fenêtre des canaux, puis cliquez sur Capturer dans l'onglet Acquisition pour acquérir une image 2D instantanée. Ensuite, pour acquérir une image 2D en laps de temps, sélectionnez Série temporelle pour ouvrir la fenêtre Série temporelle, puis saisissez zéro comme intervalle et 40 comme nombre total d'analyses afin d'obtenir 40 images consécutivement sans intervalle de temps.Pour analyser les images, ouvrez le logiciel approprié d'analyse d'images, puis ouvrez un fichier image. Pour générer des trajectoires d'objets à l'aide des images en laps de temps, dans la vue Surpass, ouvrez l'image à analyser et cliquez sur l'icône représentant des points orange afin d'ouvrir la nouvelle fenêtre Spots. Après avoir défini les paramètres de suivi, cochez la case Remplir les intervalles avec tous les objets détectés pour démarrer le suivi.Et cliquez sur la flèche bleue pour passer à l'étape suivante. Sous Type de filtre, sélectionnez le filtre Durée de la trajectoire, puis cliquez sur la flèche verte pour terminer le suivi. Ensuite, vérifiez les trajectoires générées, en revenant à l'étape précédente si nécessaire.Pour mesurer le déplacement cellulaire, défini par les trajectoires d'objet dans les images en prise de vue différée, sous la fenêtre Éditer les trajectoires, sélectionnez la case Trajectoires, puis choisissez une trajectoire correspondant au mouvement de la cellule d'intérêt. La trajectoire sélectionnée sera mise en évidence en jaune sur l'image de la série temporelle. Enfin, sous l'onglet Statistiques, cliquez sur l'icône représentant un graphique pour ouvrir la fenêtre Statistiques.Ensuite, sous Sélection, cliquez sur la flèche vers le bas pour générer la vitesse moyenne de suivi. Les vaisseaux sanguins présents dans la moelle osseuse peuvent être visualisés à l'aide de colorants intravasculaires, tels que le FITC-Dextran. Étant donné que le contraste dépend de l'injection du colorant, l'image acquise représente la vascularisation fonctionnelle où il existe un débit sanguin suffisant.Ces images de la même zone de la moelle osseuse à différents moments illustrent la présence de neutrophiles à la fois dans les espaces intravasculaires et extravasculaires sur une période de plusieurs jours. L’imagerie de cet os cortical, composé principalement de fibres de collagène, a été réalisée par génération de seconde harmonique, mettant ainsi en évidence l’infiltration du tissu vasculaire par les neutrophiles. Ces neutrophiles ont été suivis dans la niche vasculaire de la moelle osseuse sans intervalle de temps supplémentaire entre chaque acquisition, permettant un suivi précis de leur déplacement.La vitesse des trajectoires générées par le logiciel d'analyse d'images peut ensuite être mesurée afin d'analyser la vélocité de chaque cellule. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'utilisation de cellules marquées ex vivo ou de souris transgéniques rapporteuses, peuvent être employées pour évaluer d'autres processus biologiques in situ, comme l'influence des cellules immunitaires sur la progression tumorale et les métastases. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'installer une chambre à fenêtre sur l'os fémoral de la souris afin de suivre les neutrophiles à travers le compartiment vasculaire de la moelle osseuse et les structures de collagène.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce protocole décrit une procédure de prélèvement en série de moelle osseuse fémorale (BM) sans nécessiter le sacrifice de souris. Cette procédure facilite les études longitudinales de la composition en BM des souris au fil du temps et fournit un accès en série aux cellules à l’intérieur de la BM pour les études ex vivo et de transplantation.

Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Les monocytes sont des régulateurs clés de l’immunité innée et jouent un rôle critique dans le renouvellement du système phagocytaire mononucléaire périphérique et en cas d’inflammation. Ce manuscrit décrit la procédure d’imagerie en temps réel de la moelle osseuse de la calvaria de souris pour étudier le mécanisme de mobilisation des monocytes.

Suivi moelle osseuse de souris monocytes<em&gt; In Vivo</em

Une stratégie d’analyse quantitative des données histologiques dans la moelle osseuse est présentée. La microscopie confocale de cellules marquées par fluorescence dans des coupes de tissus permet d’obtenir des images en 2 dimensions, qui sont automatiquement analysées. Les analyses de co-localisation de différents types de cellules sont comparées aux données d’images simulées, ce qui donne des informations quantitatives sur les interactions cellulaires.

Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Une méthode pour créer et diffuser différentes niches humanisées de moelle osseuse chez la souris est présentée. Sur la base de la niche de soutien créée par les cellules mésenchymateuses humaines, l'addition de cellules endothéliales humaines induit la formation de vaisseaux humains, tandis que l'addition de rhBMP-2 induit la formation de tissu osseux matriciel humain-souris chimère.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.

In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

La microscopie intravitale permet d’étudier des processus biologiques dynamiques tels que la régénération tissulaire et le développement tumorale. La moelle osseuse calvaire, un tissu très dynamique, offre des informations sur l’hématopoïèse et la fonction vasculaire. L’utilisation d’un implant de fixation de la tête biocompatible imprimé en 3D permet une imagerie longitudinale répétitive, améliorant ainsi notre compréhension de la dynamique des tissus et du microenvironnement tumoral.

Imagerie longitudinale intravitale de la dynamique vasculaire dans la moelle osseuse calvaire

Le modèle de lésion de la moelle osseuse murine est un outil utile pour étudier l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse. Ce protocole chirurgical simplifié décrit la procédure d’ablation de la moelle osseuse pour l’évaluation en aval de la formation de nouveaux os et des réponses cellulaires après une blessure.

Méthodologie améliorée pour l’étude de l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse dans un modèle de lésion de la moelle osseuse murine

Découvrez le suivi des neutrophiles dans la moelle osseuse murine grâce à une chambre à fenêtre fémorale et à la microscopie intravitale. Cette méthode permet l'imagerie longitudinale des cellules immunitaires in vivo.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour

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