Name: Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par Coxiella burnetii Pendant siRNA Silencing (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Découvrez comment utiliser le FRET pour examiner la translocation des effecteurs par Coxiella burnetii pendant le silençage siRNA. Cette méthode combine le silençage génique et un test rapporteur pour étudier les interactions hôte-pathogène.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) (Grant ID 1062383 et 1063646) accordées à HJN. EAL est soutenu par une bourse australienne de troisième cycle.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les systèmes de sécrétion, et les protéines effectrices bactériennes ces systèmes de transport dans le cytoplasme des cellules hôtes sont une composante importante de virulence que de nombreuses bactéries pathogènes utilisent pour établir une infection dans des niches réplicatives uniques. L&#39;objectif de nombreux groupes de recherche a été d&#39;étudier l&#39;interaction entre les effecteurs bactériens et protéines de l&#39;hôte et l&#39;influence de ces effecteurs ont sur les voies cellulaires hôtes. recherche très ...

Coxiella burnetii est un pathogène intracellulaire unique qui provoque la zoonotique infection humaine fièvre Q. Cette maladie est associée à un large éventail de présentations cliniques s&#39;étendant de séroconversion asymptomatique à une infection chronique potentiellement mortelle qui se manifeste souvent endocardite ans après l&#39; exposition 1. L&#39;infection humaine se produit principalement par l&#39;inhalation d&#39;aérosols contaminés avec ruminants le principal réservoir d&#39;infection, en particulier, les vaches laitières, les moutons et les chèvres. Bien que l&#39; infection Coxiella chez ces animaux est généralement subclinique, l&#39;infection peut déclencher l&#39; avortement et la charge bactérienne considérable dans le fluide de l&#39; accouchement et le placenta peut contaminer l&#39;environnement local 1. Un exemple de l&#39;énorme fardeau telle contamination peut avoir sur la santé publique et l&#39;industrie de l&#39; agriculture a récemment été observée dans l&#39;épidémie de fièvre Q qui a eu lieu aux Pays - Bas 2. Entre 2007 et2010, plus de 4000 cas humains de fièvre Q ont été diagnostiqués et cette épidémie était liée à une contamination importante des exploitations caprines 3. En outre, Coxiella est une arme biologique potentielle, classé par les US Centers for Disease Control and Prevention, en raison de la stabilité de l&#39; environnement des bactéries et une faible dose infectieuse nécessaire pour provoquer la morbidité et de la mortalité 4 sévère. Coxiella existe en deux phases: Phase I organismes, isolées à partir de sources naturelles, sont extrêmement virulents et les organismes de la Phase II sont fortement atténués in vivo. Par exemple, après quelques passages in vitro dans des Coxiella burnetii phase I Nine Mile organismes, les bactéries de phase II ont été produits qui contiennent une délétion chromosomique irréversible résultant en un lipopolysaccharide tronqué (LPS) 5. Cette souche, C. burnetii NMII, est phénotypiquement similaire à la phase I dans les modèles de culture de tissus et fournit un mode plus sûrl pour les chercheurs pour étudier la pathogenèse Coxiella dans les laboratoires 5. Au cours des dernières années , plusieurs avancées ont rapidement fait progresser le domaine de la génétique Coxiella. Plus particulièrement, le développement des médias axénique (acidifié milieu de cystéine citrate - ACCM-2) a permis la croissance sans cellule de Coxiella à la fois liquide et sur ​​des supports solides 6,7. Cela a entraîné des améliorations directes des outils génétiques disponibles pour Coxiella , y compris un système d&#39;expression génique inductible, des vecteurs navettes et des systèmes de transposon aléatoires 8-11. Plus récemment, deux méthodes d&#39;inactivation du gène ciblé ont également été mis au point, ouvrant la voie à l&#39; examen des gènes candidats de virulence spécifiques 12. Après intériorisation par les macrophages alvéolaires, Coxiella réplique à un nombre élevé dans un compartiment lié à la membrane appelée Coxiella- contenant des vacuoles (CCV). Le CCV nécessite le trafic d&#39;endocytose hôte eendosomes précoces et tardives rugueux jusqu&#39;à ce qu&#39;il arrive à maturité dans un organite lysosome dérivé 13. Tout au long de ce processus, le CCV acquiert des facteurs hôtes qui soit apparaissent transitoirement ou restent associés à la vacuole, y compris, mais sans s&#39;y limiter, Rab5, Rab7, CD63 et LAMP-13 à 15 janvier. Réplication de Coxiella dans les cellules hôtes est entièrement dépendante d&#39; un type Dot / Icm système entièrement fonctionnel IVB Sécrétion (T4SS) 8,16,17. Ce système de sécrétion est une structure multi-protéique héréditairement liés aux systèmes de conjugaison et englobe à la fois les membranes bactériennes et vacuolaires pour délivrer des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytoplasme de l&#39; hôte 18. Le Coxiella T4SS est fonctionnellement très similaire au type IVB Dot / Icm système Sécrétion bien caractérisé de Legionella pneumophila 19,20. Fait intéressant, l&#39; activation de l&#39;effecteur translocation T4SS et ultérieure ne se produit pas jusqu&#39;à ce que Coxiella atteint le lysosome dérivé acideorganite, environ 8 heures post-infection 17,21. À ce jour, plus de 130 effecteurs Dot / Icm ont été identifiés 9,17,22-24. Beaucoup de ces effecteurs jouent probablement un rôle important lors de la réplication de Coxiella dans les cellules hôtes; cependant, seuls quelques effecteurs ont été caractérisées fonctionnellement 25-29. Dans cette étude , nous utilisons une translocation dosage par fluorescence à base qui repose sur le clivage du substrat FRET CCF2-AM (ci - après dénommé le substrat BlaM) via l&#39; activité β-lactamase dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 1). Le gène d&#39;intérêt est fusionnée à TEM-1 β-lactamase (BlaM) sur un plasmide rapporteur qui permet une expression constitutive. Le substrat BlaM est composé de deux fluorophores (coumarine et fluorescéine) qui forment une paire FRET. L&#39;excitation des résultats de la coumarine dans la case de la fluorescéine et le vert émission de fluorescence en l&#39;absence d&#39;effecteur translocation; cependant, si le BlaM effecteur protéine de fusion subit une translocation dans le cytoplasme de l&#39;hôte, la résultante β-lactamase activité clive la bague β-lactame du substrat BlaM, séparant la paire de FRET produisant une émission de fluorescence bleue après excitation. Ce test de translocation a été éprouvée comme une approche pour identifier les protéines effectrices à partir d&#39; une gamme de différentes bactéries intracellulaires et extracellulaires, y compris C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, entéropathogènes E. coli, Salmonella et Brucella 17,30-35. Pour déterminer le rôle des facteurs de l&#39; hôte spécifiques sur Coxiella effecteur translocation nous utilisons une méthode bien établie pour l&#39; inactivation de gène connu comme l&#39; interférence ARN, en particulier les petits ARN interférents (siRNA). Initialement identifié dans Caenorhabditis elegans, l&#39; interférence ARN est un processus cellulaire endogène conservé utilisé pour defe innéense contre les virus, ainsi que régulation des gènes 36,37. Après la liaison de siRNA spécifique de la séquence, la dégradation de l&#39; ARNm se produit à travers RISC (complexe taire induite par l&#39; ARN) conduisant à l&#39; inactivation de gène spécifique ou knockdown 38. Dans cette étude, l&#39;ARNsi a été utilisé pour cibler deux protéines de l&#39;hôte, et RAB5A Rab7A, qui sont des régulateurs importants de la voie d&#39;endocytose. L&#39;impact du silence RAB5A et Rab7A sur effecteur translocation a été établie à l&#39; aide C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 a été choisi car il a été montré précédemment translocation par le système de sécrétion de point / Icm de Coxiella 17. Utilisant à la fois siRNA silençage génique et le test de translocation fluorescencebased décrit ici, nous commençons à établir un rôle de facteurs de l&#39; hôte dans la translocation des protéines effectrices par Coxiella. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de bactéries intracellulaires et extracellulaires qui possèdent secretio similairesLes systèmes responsables de la translocation de protéines effectrices n.

<table><tbody><tr><td><Réactif>s forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 Teneur moyenne</td></tr><tr><td>Citrate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 Teneur moyenne</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 Teneur moyenne</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 Moyenne composant</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>Sulfate de fer</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>Bacto-néopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 milieu composant</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>Méthyl bêta cyclodextrine</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 composant moyen</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Pour la culture bactérienne</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Lutte non ciblée Pool (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Contrôle non ciblé</td></tr><tr><td>siGENOME Humain PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Provoque la mort cellulaire ; mesure de l’efficacité de transfection</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x tampon siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Utiliser de l’eau stérile sans RNase pour diluer 5x tampon siRNA pour 1x tampon siRNA</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Réactif de transfection</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>Pour la transfection</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Milieu sérique réduit utilisé pour la transfection</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Pour la culture cellulaire et l’infection</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (SCF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Peut utiliser un autre produit équivalent</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Pour le stockage de la souche de Coxiella</td></tr><tr><td>PBS Pour la</td><td></td><td></td><td>culture cellulaire</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Pour la dilution des échantillons et des étalons pour qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Peut utiliser un autre produit équivalent pour extraire l’ADNg</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Peut utiliser un produit de mélange maître qPCR équivalent alternatif pour la réaction qPCR</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Kit de chargement avec CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>Pour la mesure de la translocation par fluorescence et la génération de la solution de charge 6X (contient la solution A, B, C et le DMSO)</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td></td><td>Merck 106469</td><td>Composant de la solution probénicide</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Composant de la solution probénicide Orthophosphate</td></tr><tr><td>d’hydrogène disodique</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Solution probénicide composant</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Solution probenicide composant</td></tr><tr><td>Solution de sonde fluorescente DRAQ5 (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Coloration des noyaux pour déterminer la viabilité cellulaire. Utiliser 1:4000 dilué dans du PBS.</td></tr><tr><td>Solution de PFA (paraformaldéhyde) à 4 % dans PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Solution de fixation pour cellules HeLa 229</td></tr><tr><td>25 cm2 flacon de culture tissulaire avec bouchon ventilé</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Pour la croissance de la souche bactérienne</td></tr><tr><td>96 Bien plat Fond transparent Microplaques en polystyrène noir traité TC, emballées individuellement, avec couvercle, stériles</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture tissulaire de 75 cm2 avec capuchon ventilé</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Pour la croissance de cellules HeLa 229</td></tr><tr><td>175 cm2 avec capuchon ventilé</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>Pour la croissance de cellules HeLa 229</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td>Pour la quantification de cellules HeLa 229</td></tr><tr><td>Tear-A-Way Plaques PCR à 96 puits</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>Pour qPCR réaction</td></tr><tr><td>8-Chaîne de couvercle, plate</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>Pour la réaction qPCR</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench top microfuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Vortex <td></td><td></td><td></td>de <td>paillasse</td></tr><tr><td>Mélangeur</td><td></td><td></td><td></td>orbital</tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Pour la granulation de la culture bactérienne</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>Pour la quantification de l’ADNg</td></tr><tr><td>Mx3005P Machine QPCR</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>Pour la quantification des génomes de Coxiella en culture de 7 jours</td></tr><tr><td>Microplaque ClarioSTAR lecteur</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>Pour la mesure de la fluorescence</td></tr></tbody></table>

application fluorescence resonance energy transfer (fret) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; pendant sirna silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, l&#39;agent causal de la fièvre Q, est un pathogène intracellulaire qui repose sur un type IV Dot / Icm Système Sécrétion d&#39;établir une niche réplicative. Une cohorte de effecteurs sont transloqué à travers ce système dans la cellule hôte pour manipuler les processus d&#39;accueil et de permettre l&#39;établissement d&#39;une vacuole lysosome dérivé unique pour la réplication. La méthode présentée ici implique la combinaison de deux techniques bien établies: silençage génique spécifique en utilisant le siRNA et la mesure de la translocation d&#39;effecteur au moyen d&#39;un substrat à base de FRET qui repose sur l&#39;activité β-lactamase. L&#39;application de ces deux approches, nous pouvons commencer à comprendre le rôle des facteurs de l&#39;hôte en fonction du système de sécrétion bactérienne et effecteur translocation. Dans cette étude, nous avons examiné le rôle de RAB5A et Rab7A, à la fois des régulateurs importants de la voie de trafic endocytose. On démontre que l&#39;inhibition de l&#39;expression d&#39;un des deux protéines à une diminution effecteur translocation efficacité. Ces méthodes peuvent être facilement modifiés pour examiner d&#39;autres pathogènes intracellulaires et extracellulaires qui utilisent également des systèmes de sécrétion. De cette manière, une image globale des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans la translocation bactérienne effecteur peut être révélée.

Pour cette étude, le C. souche burnetii pBlaM-CBU0077 a été choisi comme CBU0077 a été précédemment montré pour être un effecteur translocation du système de sécrétion Coxiella Dot / Icm 17. Avant l&#39;infection, le nombre de génomes / ml dans les sept jours C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 a été dénombrée en utilisant qPCR. La figure 4 montre un exemple du cycle seuil (Ct) des valeurs attendues des deux étalons e...

L&#39;étude des interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes est un domaine important de la recherche biologique. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour mesurer la translocation effecteur par Coxiella burnetii lors de l&#39; inactivation de gène siRNA en utilisant un substrat BlaM.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

L'objectif général de cette procédure expérimentale est d'examiner l'impact de processus spécifiques de l'hôte sur la capacité des pathogènes bactériens à transloquer des protéines effectrices. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie cellulaire. Plus précisément, elle permet de comprendre comment l'hôte participe au blocage ou à la promotion du transfert d'effecteurs de virulence bactériens dans la cellule hôte.Le principal avantage de cette technique est qu'elle combine deux méthodes bien établies, à savoir l'inhibition génique par ARNsi et le test rapporteur pour mesurer la translocation des protéines bactériennes, afin d'étudier l'interaction entre les agents pathogènes et la cellule eucaryote.Cette méthode permet de mieux comprendre la pathogénie de Coxiella et peut également être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène d'autres bactéries dépendant d'un translocation efficace des protéines, comme Chlamydia, Salmonella et les souches d'Escherichia coli adhérentes et effaçantes. Après culture de C. burnetii exprimant CBU0077, fusionnez la bêta-lactamase selon le protocole décrit dans le texte dans un flacon de cul

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