Name: Neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde Oligomère Infusion est contrecarré par Antibody traitement Infused avec les pompes osmotiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez une méthode chirurgicale d'infusion d'oligomères bêta-amyloïdes dans l'hippocampe pour étudier la neurotoxicité chez le rat. Ce modèle animal permet d'évaluer l'efficacité de l'immunothérapie contre la maladie d'Alzheimer.

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Nous remercions Caroline Bouchard de l’animalerie pour le travail sur les rats. A.S. détient une bourse de maîtrise J.A. De Sève, et B.P. une bourse COPSE de l’Université de Montréal Ce travail a été financé par des subventions attribuées à J.B. du FRQS-Pfizer et des fonds de démarrage du Centre de recherche de l’Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal.

Déclaration d&#39; éthique: Le protocole animal pour ce projet a obtenu l&#39;approbation du Comité de l&#39;Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Animal Care en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. 1. Catheter Préparation avant la chirurgie stéréotaxique <ol><li> Couper les cathéters PE50 (6 cm de longueur) qui seront utilisés pour connecter la canule avec des pompes osmotiques (voir la figure 1A). Remplir les cathéters PE50 avec du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF), et sceller les deux extrémités des cathéters. Maintenir le cathéter à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 2. Canule Implantation par stéréotaxie <ol><li> Effectuer la chirurgie dans des conditions stériles. Stériliser tous les instruments et du matériel chirurgical par autoclavage. Nettoyer l&#39;appareil stéréotaxique et la zone de travail à fond et désinfecté avec une solution d&#39;éthanol à 70%. Porter un masque chirurgical, bonnet de cheveux et des gants stériles.</li><li> Anesthésier les rats par injection intraperitoneale (ip) d&#39;une solution de kétamine et de xylazine (100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement). Confirmer l&#39;anesthésie en vérifiant le mouvement après un orteil pincée douce. </li><li> Injecter un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (méloxicam; 1 mg / kg) par voie sous- cutanée (sc) à l&#39;animal anesthésié au moins 30 minutes avant l&#39;intervention chirurgicale. </li><li> Raser la tête de l&#39;animal en utilisant une tondeuse et désinfecter la peau avec une solution de gluconate de chlorhexidine 2% et d&#39;alcool isopropylique 2% trois fois. Appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. </li><li> Placer l&#39;animal dans un cadre stéréotaxique avec les barres d&#39;oreilles. Fixer une canule sur le bras de support du cadre stéréotaxique. Injecter (sc) un agent anesthésique local (bupivacaïne (1,5 mg / kg) et de la lidocaïne (1,5 mg / kg) sur le dessus de la tête. L&#39;anesthésie est maintient durant toute la procédure en plaçant un cône de nez délivrant 3% d&#39;isoflurane. L&#39;ensemble champ opératoire doit êtredrapé off, mais il n&#39;a pas été fait ici pour mieux démontrer la technique. </li><li> Faire une incision de 3 cm sur le dessus de la tête avec un scalpel. Installez 4 pinces autour de l&#39;incision de quitter le crâne clair. En utilisant une paire de ciseaux rond-pointe, faire une poche (2 x 2 cm 2) sous la peau entre les omoplates de l&#39;animal. </li><li> Grattez le périoste du crâne avec une lame. Appliquez une compresse de gaze sur le crâne si le saignement. </li><li> Vérifiez que le crâne est plat et bien aligné sur le cadre stéréotaxique. Pour vous assurer que le crâne est plat, vérifier les coordonnées de la hauteur au bregma et au lambda. Prenez les coordonnées du bregma qui sera utilisé comme point de référence. </li><li> A partir du bregma, calculer les coordonnées des deux canule de guidage qui seront implantés bilatéralement dans l&#39;hippocampe (antéropostérieur: - 0,42 cm; mediolateral: ± 0,30 cm; dorso - ventral: - 0,28 cm selon les atlas de cerveau de rat Paxinos et Watson) 29 . Indiquer lela position de la canule avec un marqueur. </li><li> Percez un trou (0,5 mm) dans le crâne au point de deux canule d&#39;implantation. Percez deux autres trous d&#39;environ 5 mm au-dessus et au-dessous ces points pour insérer des vis qui consolideront la canule lors de l&#39;application du ciment dentaire. </li><li> Couper une extrémité du cathéter préalablement rempli d&#39;LCRa avec un scalpel, et l&#39;insérer dans le bras de l&#39;angle de la canule. Fixer la première canule avec du ciment dentaire. Éviter de mettre un ciment dentaire autour de la position sur la seconde canule. </li><li> Laissez le dentaire sec de ciment pour 2 - 3 min, puis retirez le bras de support de la première canule, et fixer la seconde canule en elle. Répétez les étapes 2.11 et 2.12. Mettez canule factice à la fois guide de canule. Assurez-vous que le mannequin et le guide canule sont de la même longueur afin d&#39;éviter l&#39;infiltration des tissus et le blocage de la canule. </li><li> Insérez l&#39;extrémité libre des deux cathéters dans la poche précédemment faite entre les omoplates de l&#39;animal. Retirer les pinces et coudre la peau avec unfil de suture 4-0. NOTE: Le guide supérieur canule doit être accessible pour des infusions Aβo à venir. </li><li> Retirer l&#39;animal du cadre stéréotaxique et le remettre dans sa cage. Pendant la récupération post-chirurgicale, placer la cage sur une couverture d&#39;eau de chauffage jusqu&#39;à ce que l&#39;animal se réveille. La cage doit être en partie sur le patin de sorte que le rat peut se déplacer loin de la chaleur si nécessaire. Surveiller l&#39;animal en permanence jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale. </li><li> rats Retour à l&#39;animalerie pour récupérer de la chirurgie pendant 10 jours sous surveillance étroite. REMARQUE: Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. Meloxicam (1 mg / kg) est administré une fois par jour pendant deux jours après la chirurgie pour traiter la douleur. </li></ol> 3. La pompe osmotique Installation <ol><li> Un jour avant l&#39;installation, remplir des pompes osmotiques avec 6E10 anticorps (1 mg / ml; 100 pi) et le contrôle IgG1anticorps (1 mg / ml; 100 ul) selon les instructions du fabricant dans des conditions stériles. Garder les pompes dans l&#39;eau distillée stérile à 37 ° C pendant la nuit pour activer les pompes. </li><li> Anesthetize rats avec isoflurane 3% d&#39;installer des pompes osmotiques (0,5 pi / h pendant 7 jours). Raser entre les omoplates et la désinfection de la peau avec une solution de gluconate de chlorhexidine à 2% et de l&#39;alcool isopropylique à 2%. Faire une incision de 2 cm avec un scalpel entre les omoplates pour localiser les cathéters de PE50 connectés à la canule de guidage. </li><li> Coupez l&#39;extrémité des cathéters de PE50 contenant du ciment dentaire avec un scalpel. Connecter les pompes osmotiques aux cathéters de PE50, et ajouter un peu de ciment dentaire à la pompe et le cathéter de jonction pour sécuriser la connexion. </li><li> Piquez la peau étroitement avec un fil de suture 4-0. Mettez le dos de l&#39;animal dans sa cage sur un coussin d&#39;eau de chauffage. Observer le sillage animal jusqu&#39;à rapidement d&#39;une anesthésie à l&#39;isoflurane (environ 5 min). NOTE: La chirurgie prend approximately 5 à 10 min. </li></ol> 4. Aβo Infusions dans Awake et Rats Librement Moving <ol><li> Préparer la solution Aβo (0,2 pg / pl) comme indiqué précédemment. 28,30 Laissez Aβo d&#39;agréger dynamiquement et spontanément pendant 1 heure à température ambiante avant la perfusion. </li><li> Installez deux 10 seringues ul sur une pompe à perfusion. Remplir les seringues avec 5 pl d&#39;eau distillée stérile. Coupez deux cathéters PE50 à environ 60 cm de longueur avec un scalpel. Remplir les deux cathéters avec de l&#39;eau distillée stérile à l&#39;aide de 1 ml seringues et des aiguilles 21G. </li><li> Gardez les seringues de 1 ml à une extrémité du cathéter et l&#39;autre extrémité aux seringues Hamilton. Retirez les seringues de 1 ml et vérifier qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans les cathéters. </li><li> Insérer une canule interne à l&#39;extrémité des cathéters PE50. Utilisation de l&#39;eau distillée stérile, remplir la canule interne relié à des cathéters PE50 jusqu&#39;à 1 pi sur les seringues Hamilton. Faire une bulle d&#39;air par pulling les pistons jusqu&#39;à 2 pl. </li><li> Mélanger la solution Aβo par pipetage de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pointe de minimum de respect. Eviter la formation de bulles lors du mélange. Remplir la fois la canule interne avec 1,5 pi de solution Aβo en tirant les pistons jusqu&#39;à 3,5 pi. </li><li> Faire des lignes avec un marqueur avant et après la bulle d&#39;air fait dans les deux cathéters. Cela sert de point de perfusion continue à cocher. Pour la perfusion, amener la cage près de la pompe à perfusion et retirer son couvercle. </li><li> Placez le rat dans un câlin et bien gratter le bras du blottir autour de son cou pour immobiliser la tête du rat. Retirer la canule factice de la canule deux guide. Insérez la canule interne préparé précédemment dans la canule de guidage. Vérifiez qu&#39;ils sont bien insérés et bien fixés à la base de la canule de guidage. </li><li> Relâchez rat de la blottir et le remettre dans sa cage pour limiter le stress de contention. Surveiller de près pour veiller à ce que les cathéters ne vrillent pas togetelle et la perfusion se fait correctement. </li><li> Allumez la pompe à perfusion. Injecter 1 pl de solution Aβo à un débit de 0,1 ul / min (10 min). Pendant la perfusion, vérifier que la seringue piston se déplace de 3,5 pi à 2,5 pi, et que la bulle d&#39;air dans les deux cathéters de PE50 déplacer en continu. </li><li> Laisser la canule interne en place pour un autre 5 min après la perfusion pour permettre une diffusion efficace de la solution Aβo. Amener le rat de retour dans le blottir pour enlever la canule interne et plafonné canule de guidage pour empêcher le reflux de la solution injectée. Utilisez la canule factice qui arrête juste avant le bras de l&#39;angle de la canule. Retour de l&#39;animal dans sa cage. </li><li> Répéter la perfusion Aβo une fois par jour pendant 6 jours consécutifs. Euthanasier l&#39;animal par décapitation. </li></ol>

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Il y a des étapes critiques dans ce protocole qui nécessitaient une attention particulière. Lors de l&#39;implantation de la canule, d&#39;éviter de mettre un ciment dentaire quand il est trop liquide pour empêcher le blocage du trou de la seconde canule. Il est important de placer un ciment dentaire à l&#39;extrémité libre du cathéter P50 fixé à la pompe pour éviter une irritation et une réponse inflammatoire possible. Le jour de la chirurgie stéréotaxique, utilisez la canule factice qui sont de la même longueur de guide canule pour éviter le blocage de la canule. Cependant, après l&#39;installation de pompes utilisent une canule plus courte factice qui arrête avant que le bras angulaire de la canule afin de permettre une bonne injection de la solution de la pompe vers l&#39;hippocampe. Surveiller de près infusions Aβo et vérifiez que la bulle d&#39;air fait dans les cathéters est en mouvement continu pendant les perfusions. Assurez-vous toujours que la canule d&#39;injection est complètement inséré dans la canule de guidage pendant les perfusions. Si le problème est la rencontre pendant la perfusion Aß, Vérifiez que la canule interne ne soit pas bloqué. Si tel est le cas, rincer l&#39;eau distillée stérile à travers la canule interne. Si la canule de guidage est obstrué, tourner la canule interne dans la canule de guidage. Sinon déplacer la canule intérieure vers le haut et vers le bas. Contention dans le câlin peut être stressant pour les rats, en particulier le premier jour. Pour diminuer le stress de l&#39;animal, il est recommandé de manipuler et habituer les rats à l&#39;blottir avant la chirurgie stéréotaxique. De nombreux avantages peuvent être attribués à ce roman et flexible approche in vivo. En effet, la nature de Aβo injectée peut contrôler avec précision avant la perfusion et le type de préparations d&#39; Aß différent (par exemple synthétique contre des solutions d&#39; Aß dérivé du cerveau) peut être injecté pour évaluer leur neurotoxicité in vivo. Ce modèle peut également être utilisé pour étudier les mécanismes par lesquels différentes espèces Aß (par exemple, des monomères, bas et haut poids moléculaire oligomers, protofibrils) peuvent induire des effets neurotoxiques in vivo, et comment des traitements comme l&#39; immunothérapie pourraient contrecarrer leur impact délétère dans le cerveau. Étant donné que les perfusions sont exécutent dans des animaux librement mobiles éveillés, il n&#39;y a pas de confusion entre les effets des agents anesthésiques et la solution Aβo sur les voies de signalisation, comme indiqué dans les études précédentes. 32,33 Infusions à se déplacer librement des animaux sont également compatibles avec les tests de comportement tout temps avant et après les perfusions. Infusions de Aβo et l&#39;installation de la pompe peuvent être effectuées chez l&#39;animal d&#39;âges différents afin de déterminer les effets des Aβo et des traitements au cours du vieillissement. Etant donné que la neurodégénérescence se produit au voisinage du site de perfusion, synaptique et une perte neuronale peuvent être induites dans des régions différentes et localisées cérébrales. La perfusion collatérale de Aβo et de contrôle (véhicule ou scramble Aß) permet le contrôle de tout changement dans le même animal. A l&#39;inverse, Aβo ou le contrôle solutions peuvent être injectées de façon bilatérale dans le droit et l&#39;hippocampe gauche, par exemple lors du test des animaux dans des tâches comportementales. Infusion de Aβo et le traitement peut être effectué simultanément ou alternativement des pompes peut être installé après la perfusion Aβo pour évaluer si le traitement est efficace après le dépôt Aß. Le même protocole que décrit ici peut également être utilisé lors de faire des infusions intracérébroventriculaire de Aβo. L&#39;effet de Aβo sur les voies de signalisation intracellulaires peut être évaluée avant et après la perte neuronale dans un laps de temps relativement court. La dose et le nombre de perfusions Aß peuvent également être ajustés pour obtenir une pathogénicité Aß plus ou moins graves. Bien que très polyvalent, cette technique a des limites. Canule implantation produit une rupture mécanique du tissu et neuroinflammation dans les premiers jours suivant la chirurgie. Ainsi, il est essentiel d&#39;attendre au moins une semaine après la chirurgie avant de commencer Aβo INFUsion, et d&#39;ajouter des contrôles appropriés (injection de véhicule ou scramble inactive Aß) à prendre en compte ces événements. De plus, seul un petit volume de Aβo peut être perfusée pour limiter la diffusion de la solution. Les pompes osmotiques représentent une méthode de livraison pratique et unique pour la validation préclinique d&#39;agents destinés à prévenir la neurodégénérescence induite par Aß. Depuis l&#39; immunothérapie avec l&#39;anticorps 6E10 a été montré précédemment pour diminuer l&#39; accumulation de Aß dans le cerveau, 31 nous avons utilisé l&#39;anticorps 6E10 comme une preuve de concept à valider notre nouvelle approche in vivo. L&#39;utilisation de pompes osmotiques dans ce modèle peut maintenant être utilisé pour développer de nouvelles thérapies modifiant la maladie qui pourraient empêcher le dépôt et la neurotoxicité de Aβo chez les patients AD pré-cliniques.

Il a d&#39; abord été proposé que l&#39; accumulation d&#39;espèces Aß insolubles dans le cerveau était au centre de la pathogenèse. 1,2 Cependant, les plaques amyloïdes sont également détectés dans certains cognitivement normaux personnes âgées. 3-7 Pour surmonter la faible corrélation existant entre les dépôts de plaque et les déficits cognitifs dans AD, les derniers rapports ont montré la présence de substances toxiques Aβo soluble à l&#39;apparition de la maladie, qui sont en corrélation beaucoup mieux avec l&#39;état clinique des patients. 8-14 Depuis le processus de Aß oligomérisation est très dynamique, il a été suggéré que la neurotoxicité est induite par divers Aβo au lieu d&#39;un seul type spécifique d&#39;oligomère. 14-16 Depuis de nombreuses études ont montré que Aβo peut initier des dysfonctionnements synaptiques avant synapse et la perte neuronale, 17-24 théories actuelles indiquent que le traitement Aß liés pourrait être efficace dans AD au début plutôt qu&#39;à des stades ultérieurs tel que testé jusqu&#39;à présent dans les essais cliniques. Une caractéristique caractéristique de la MA pathogenèse est la mort massive et généralisée cellulaire observée dans les derniers stades de la maladie, et la synapse importante et la perte neuronale observée dans les régions cérébrales localisées lorsque les déficits de mémoire deviennent détectables au niveau clinique. La voie perforant qui projette du cortex entorhinal (CE) du gyrus denté (DG) est perturbée de façon marquée à l&#39;apparition précoce de la MA. 25,26 Pendant l&#39;état prodromique de AD lorsque la déficience cognitive légère (MCI) devient apparente mort cellulaire significative est détectée dans la CE ainsi que la perte synaptique dans la DG. 25,26 Bien qu&#39;un grand nombre de preuves a mis en évidence l&#39;action toxique du Aβo soluble au début de notre ère, 8-14 neurodégénérescence Aβo induite observée dans la culture neuronale ou la culture de tranches de cerveau organotypique a été plus difficile à reproduire dans les modèles animaux. 27 La plupart des AD transgénique modèles surexprimant Aβ ont des plaques amyloïdes, tau hyperphosphorylation, déficit synaptique et déficits de la mémoire. 27 Cependant, ces modèles ont été beaucoup moins de succès dans la mort cellulaire de modélisation observé dans l&#39;hippocampe des patients atteints de MA. Pour surmonter ces problèmes techniques, nous avons développé un modèle basé sur des perfusions intracérébrales de Aβo soluble. Nous avons signalé précédemment que répétées perfusions hippocampiques de Aβo solubles induisent une perte neuronale progressive et tau hyperphosphorylation, deux caractéristiques pathologiques associés à un déclin de la mémoire dans la MA. 28 Ici, nous montrons une nouvelle méthode pour tester les thérapies de la MA en utilisant une canule spécialement conçu pour les perfusions simultanées de Aβo et perfusion continue d&#39;anticorps Aβo (6E10) avec des pompes osmotiques. Les pompes osmotiques constituent un moyen unique de tester in vivo l&#39;efficacité d&#39;un anticorps (ou d&#39; autres composés) à l&#39; encontre de la neurodégénérescence induite par Aβo directement sur ​​le site de perfusion Aβo. Ainsi, ces pompes réédESENT un outil pratique pour établir une solide preuve de concept concernant les mécanismes d&#39;action des agents thérapeutiques potentiels dans la MA. Depuis les rapports récents soulignent l&#39;impact critique de Aβo soluble dans les premiers stades de la MA, de nombreux traitements dirigés vers Aβo sont réellement testés par des laboratoires académiques et pharmaceutiques. Ce nouveau modèle animal permet de mimer la perte synaptique et neuronale observée au début de la MA, et des pompes osmotiques sont utilisés pour perfuser en continu des agents de traitement spécifiquement au niveau du site de perfusion Aβo. Les échecs répétés des thérapies de la MA testés au cours des dernières années en légère à modérée patients comme incité les chercheurs à initier des essais chez des patients pré-démence avant Aβo commencent à accumuler abondamment et générer des dommages irréversibles au cerveau. Dans ce contexte, l&#39;essai de nouveaux composés qui empêchent le dépôt, et par conséquent la neurotoxicité de Aβo pourrait être intéressant chez les patients pré-cliniques.

<table><tbody><tr><td>Liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>59-7316</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 Cathéter à paroi mince</td><td>Plastiques un</td><td>C232CT</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine (100 mg/ml)</td><td>Bioniche</td><td>1989529</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine (100 mg/ml)</td><td>Bimeda</td><td>8XYL004C</td><td></td></tr><tr><td>Méloxicam (5 mg/ml)</td><td>Norbrook</td><td>215670I01</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gluconate de chlorhexidine 2 % et d’alcool isopropylique 2 %</td><td>Carefusion</td><td>260100C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lidocaïne</td><td>Alveda Pharma</td><td>0122AG01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de bupivacaïne</td><td>Hospira</td><td>1559</td><td></td></tr><tr><td>pommade ophtalmique</td><td>Baussh and Lomb inc.</td><td></td><td></td>2125706</tr><tr><td>cadre stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Bras porte-canule stéréotaxique</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4837</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Canule de guidage</td><td>Plastiques un</td><td>326OPG/spc</td><td></td></tr><tr><td>Canule d’injection</td><td>Plastiques un</td><td>C315I/spc</td><td></td></tr><tr><td>Canule factice</td><td>Plastiques un</td><td>C315DC/spc</td><td></td></tr><tr><td>Filetage de suture enduit vicryl rapide 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VR2297</td><td></td></tr><tr><td>Dental Acrylic Cement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-6906</td><td></td></tr><tr><td>Vis</td><td>JI Morris Company</td><td>P0090CE125</td><td></td></tr><tr><td>6E10 anticorps (isotype IgG1 de souris)&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>803003</td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG1 contrôle isotype anticorps</td><td>Abcam</td><td>AB18447</td><td></td></tr><tr><td>Alzet pompes osmotiques modèle 1007D</td><td>Durect corporation</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid-beta 1-42&nbsp ;</td><td>rPeptide</td><td>A-1163-1</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton (10 &micro ; l)</td><td>Fisher Scientique</td><td>14815279</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue à perfusion CMA 402</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CMA8003110</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 21 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2125R</td><td></td></tr><tr><td>Câlin</td><td>Lomir Biomedical</td><td>RTS04</td><td></td></tr></tbody></table>

neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde oligomère infusion est contrecarré par antibody traitement infused avec les pompes osmotiques

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Baisse de la mémoire explicite hippocampique-dépendante (mémoire des faits et des événements) est l&#39;un des premiers symptômes cliniques de la maladie d&#39;Alzheimer (MA). Il est bien établi que la perte de synapses et de la neurodégénérescence qui a suivi sont les meilleurs prédicteurs de troubles de la mémoire dans AD. Les dernières études ont souligné le rôle neurotoxique des oligomères solubles de bêta-amyloïde (Aβo) qui commencent à accumuler dans le cerveau humain d&#39;environ 10 à 15 ans avant que les symptômes cliniques deviennent apparents. De nombreux rapports indiquent que Aβo soluble en corrélation avec les déficits de mémoire dans les modèles AD et les humains. La neurodégénérescence induite par Aβo observée dans des cultures de coupes cérébrales et neuronales a été plus difficile à reproduire dans de nombreux modèles animaux. Le modèle de perfusions répétées Aβo montré ici à surmonter ce problème et permettre à aborder deux domaines clés pour le développement de nouvelles thérapies modifiant la maladie: identifier les marqueurs biologiques pour le diagnostic précoce AD, et déterminer le mecha moléculairemécanismes qui sous-tendent les déficits de mémoire Aβo induites au début de notre ère. Depuis soluble agrégat Aβo relativement rapide en fibrilles Aß insolubles qui se corrèlent mal avec l&#39;état clinique des patients, Aβo solubles sont préparés fraîchement et injecté une fois par jour pendant six jours pour produire la mort cellulaire marquée dans l&#39;hippocampe. Nous avons utilisé une canule spécialement conçu pour les perfusions simultanées de Aβo et perfusion continue d&#39;anticorps Aβo (6E10) dans l&#39;hippocampe en utilisant des pompes osmotiques. Cette innovante méthode in vivo peut maintenant être utilisé dans des études précliniques pour valider l&#39;efficacité de nouvelles thérapies de la MA qui pourraient empêcher le dépôt et la neurotoxicité de Aβo chez les patients pré-démence.

L&#39;effet neurotoxique de Aβo a été étudiée chez des rats Long-Evans par implantation d&#39;une canule dans le DG de l&#39;hippocampe. Aβo soluble ont été injectés quotidiennement pendant six jours consécutifs. Nous avons utilisé une canule spécialement conçu pour les perfusions simultanées de Aβo et une perfusion continue de 6E10 ou de contrôle IgG1 dans l&#39;hippocampe en utilisant des pompes osmotiques (figure 1A). Pour les rats ont été anesthésiés immunohistochimie, perfusée par voie transcardiaque avec du NaCl 0,9%, et les cerveaux immergés dans une solution de paraformaldehyde à 4% pour une solution de saccharose à 48 h et de 15% pendant 24 heures. Flottantes libres coupes coronales (40 um) ont été traités avec 0,3% de H 2 O 2 pendant 30 min, bloqué dans du sérum de chèvre à 1% pendant 1 h, et ​​on fait incuber pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps anti-pan-Aß. Les coupes ont été traitées avec de l&#39;acide formique à 70% pendant 3 min avant l&#39;application de l&#39;anticorps. La détection a été effectuée en utilisant le complexe ABC et un 0.05% solution 3,3-diaminobenzidine. Les coupes ont été montées sur des lames revêtues de gélatine verre, séché à l&#39;air 2 h, déshydraté (30, 70, 95 et 100% d&#39;alcool), mis en incubation dans du toluène 5 min et lamelle. Pour crésyl violet coloration, les coupes ont été incubées 10 min dans une solution de crésyl violet à 0,5%, incubée 1 minute dans une solution d&#39;acide acétique à 0,5%, décoloré (70, 95 et 100% d&#39;alcool), immergé dans du toluène 5 min, et recouverts lamelle de verre. Les résultats présentés ici montrent le dépôt de Aβo dans la direction générale au voisinage du site de perfusion, et la mort cellulaire associée à cette accumulation. Nous avons constaté que le niveau Aβo a sensiblement diminué par 6E10 traitement par anticorps (figure 1B). La neurodégénérescence marquée a été observée à proximité du site d&#39;injection de Aβo et 6E10 a été atténuée par un traitement d&#39;anticorps (figure 1B). Ces résultats sont cohérents avec l&#39;accumulation Aβo que nous avons observé dans le DGsuivant les perfusions répétées Aβo chez la souris. 28 Apurement des dépôts amyloïdes par immunothérapie avec 6E10 anticorps montré ici est en ligne avec un autre rapport fait dans un modèle de souris transgénique AD. 31 <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig1.jpg" /> Figure 1. Photo de l&#39;animal avec Canule bilatérale Pendant Aβo Infusion Une solution de Aβo. (0,2 pg / pl; 1 pi) a été injecté chez des rats éveillés et déplaçant librement (une fois par jour pendant 6 jours) en utilisant des cathéters PE50 connectés à canule interne inséré dans le guide canule. Le traitement avec le contrôle (CTL) IgG1 ou 6E10 anticorps a été perfusé directement sur ​​le site de la perfusion Aβo utilisant des pompes osmotiques situées sous - cutanée entre les omoplates de l&#39;animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de th</a>est la figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig2.jpg" /> Figure 2. La perte neuronale induite par Aβo Le dépôt est atténué par l&#39; anticorps 6E10 traitement A, Aβo (0,2 ug / ul, 1 ul). On injecte une fois par jour pendant 6 jours consécutifs, et on traite avec Ctl (IgG1) ou l&#39; anticorps 6E10 à la le site de la perfusion en utilisant des pompes osmotiques. B, l&#39; accumulation représentant de Aβo dans la DG sur une section juste à côté de l&#39; insertion de la canule, et une coloration représentative avec le violet de crésyl montrant la perte de cellules. Barres d&#39;échelle: 50 um (n = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Pour étudier les effets d’Aβo in vivo, nous avons développé un modèle basé sur des perfusions répétées d’Aβo soluble dans l’hippocampe couplées à une perfusion continue d’anticorps Aβo (6E10) dans l’hippocampe à l’aide de pompes osmotiques pour contrer l’effet neurotoxique d’Aβo.

Neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde Oligomère Infusion est contrecarré par Antibody traitement Infused avec les pompes osmotiques

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

L'objectif général de cette intervention chirurgicale est de tester l'effet de thérapies sur la toxicité des oligomères bêta-amyloïdes in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la maladie d'Alzheimer, telles que la découverte de nouvelles thérapies ciblant l'effet neurotoxique des oligomères bêta-amyloïdes dans un modèle animal. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être utilisée pour étudier les mécanismes par lesquels les oligomères bêta-amyloïdes induisent des effets neurotoxiques in vivo.Et notre traitement, comme l'immunothérapie, pourrait contrer l'effet néfaste sur le cerveau. La procédure sera démontrée par Chloe Provost, technicienne de mon laboratoire. Pour commencer le processus d'implantation de la canule, couper d'abord des cathéters PE50 sur une longueur de six centimètres.Ensuite, remplir les cathéters avec du liquide céphalorachidien artificiel. Sceller les deux extrémités des cathéters à l’aide d’une machine à sceller à chaud. Ajouter du ciment dentaire aux deux extrémités.Après avoir anesthésié les rats selon une méthode approuvée, confirmez l'anesthésie en vérifiant l'absence de mouvement suite à une légère pression sur l'orteil. Ensuite, injectez à l'animal anesthésié un anti-inflammatoire non stéroïdien. Après avoir rasé la tête de l'animal à l’aide d’un tondeur, désinfectez la peau avec une solution de 2 % de chlorhexidine gluconate et 2 % d’alcool isopropylique.Appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement pendant l'anesthésie. Placer maintenant l'animal dans un cadre stéréotaxique à l'aide des barres auriculaires. Fixer une canule sur le bras porteur du cadre stéréotaxique.Après avoir injecté un agent anesthésique local et pratiqué une incision de trois centimètres au scalpel sur le dessus de la tête, installer quatre pinces autour de l'incision afin de dégager le crâne. Ensuite, utiliser une paire de ciseaux à pointe ronde pour créer une poche carrée de deux centimètres sur deux centimètres sous la peau entre les omoplates de l'animal. Revenir ensuite à la tête et gratter le périoste du crâne avec une lame.Appliquez un tampon de gaze sur le crâne en cas de saignement. Pour vérifier que le crâne est plat et bien aligné sur le cadre stéréotaxique, contrôlez les coordonnées de hauteur au niveau du lambda et du bregma. Enregistrez les coordonnées du bregma qui serviront de point de référence.Après avoir calculé les coordonnées pour un positionnement bilatéral correct des deux canules de guidage, percez un trou de 0,5 millimètre dans le crâne au point d'implantation de chaque canule. Percez trois autres trous d'environ cinq millimètres au-dessus et au-dessous de ces points afin d'insérer les vis qui stabiliseront les canules lors de l'application du ciment dentaire. Ensuite, coupez une extrémité du cathéter, préalablement rempli d'ACSF, avec des ciseaux, puis insérez-la dans le bras angulaire de la canule.Fixer la première canule avec du ciment dentaire. Il est essentiel d'éviter de mettre du ciment dentaire autour de l'emplacement destiné à la seconde canule. Après avoir laissé sécher le ciment dentaire pendant deux à trois minutes, retirer le bras du support de la première canule et placer la seconde canule, préalablement coupée, dans celui-ci.Fixer la deuxième canule en place à l'aide de ciment dentaire. Ensuite, placer une canule factice sur chacune des canules guide. Insérer l'extrémité libre des deux cathéters dans la poche préalablement réalisée entre les omoplates de l'animal.Retirez les pinces, puis sutures la peau avec un fil 4-0. Ajoutez davantage de ciment autour de la canule. Retirez l'animal du cadre stéréotaxique et placez-le sur un tapis chauffant dans une cage propre.Surveiller l'animal en permanence jusqu'à ce qu'il retrouve une conscience suffisante pour maintenir une position sternale. Ensuite, le ramener dans la salle d'hébergement pour un rétablissement de 10 jours sous surveillance étroite. Un jour avant l'implantation, remplir les pompes osmotiques avec l'anticorps 6E10 ou l'anticorps contrôle IgG1, selon les instructions du fabricant.Placer les pompes dans de l'eau distillée stérile et les maintenir à 37 degrés Celsius toute la nuit pour activer les pompes. Une fois que le rat a été anesthésié avec 3 % d'isoflurane et que les poils ont été rasés entre les omoplates, désinfecter la peau avec une solution contenant 2 % de chlorhexidine gluconate et 2 % d'alcool isopropylique. Après avoir pratiqué une incision de deux centimètres à l'aide d'un scalpel entre les omoplates, localiser les cathéters PE50 reliés à la canule-guide.Ensuite, couper les extrémités des cathéters PE50 contenant du ciment dentaire à l’aide d’un scalpel. Connecter les pompes osmotiques aux cathéters PE50 et ajouter un peu de ciment dentaire au niveau de la jonction entre la pompe et le cathéter afin de fixer la connexion. Enfin, suturer la peau solidement avec des points de suture 4-0.Remettez l'animal dans sa cage sur un tapis chauffant, et surveillez-le pendant qu'il émerge de l'anesthésie à l'isoflurane. Après avoir préparé la solution d'oligomères de bêta-amyloïde comme décrit précédemment, laissez la solution s'agréger dynamiquement et spontanément pendant une heure à température ambiante avant l'infusion. Ensuite, remplissez chaque seringue avec cinq microlitres d'eau distillée stérile.Ensuite, couper deux cathéters PE50 à environ 60 centimètres de longueur à l’aide d’un scalpel. Utiliser deux seringues d’un millilitre équipées d’aiguilles de calibre 21 pour remplir les deux cathéters avec de l’eau distillée stérile. Tandis que les seringues d’un millilitre restent en place à une extrémité de chaque cathéter, relier les extrémités libres à des seringues Hamilton.Retirez les seringues d'un millilitre et vérifiez qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les cathéters. Insérez la canule interne à l'extrémité des cathéters PE50. Utilisez les seringues Hamilton pour remplir chaque canule interne jusqu'à un microlitre, puis créez une bulle d'air en tirant le piston jusqu'au repère de deux microlitres.Maintenant, mélangez la solution d'oligomères de bêta-amyloïde en aspirant et en expulsant à l’aide d’une pipette munie d’une pointe à faible adhérence. Évitez de former des bulles pendant le mélange. Ensuite, remplissez les deux cannules internes avec 1,5 microlitre de solution d'oligomères de bêta-amyloïde en tirant les pistons jusqu’à 3,5 microlitres.Ensuite, marquer des lignes avant et après la bulle d'air dans les deux cathéters. Ceci sert de point de contrôle de l'infusion en cours. Placer le rat éveillé en position de maintien sécurisée et immobiliser sa tête.Retirez la canule factice des deux canules de guidage, puis insérez la canule interne préparée précédemment dans la canule de guidage. Vérifiez qu'elles sont entièrement insérées et bien fixées à la base de la canule de guidage. Relâchez maintenant le rat de la prise en douceur et remettez-le dans sa cage afin de limiter le stress dû à la manipulation.Activez la pompe à perfusion et injectez un microlitre de solution d'oligomères de bêta-amyloïde à un débit de 0,1 microlitre par minute. Pendant la perfusion, vérifiez que le piston de la seringue passe de 3,5 microlitres à 2,5 microlitres et que les bulles d'air dans les deux cathéters PE50 se déplacent continuellement. Vérifiez le rat afin de s'assurer que les cathéters ne s'entortillent pas ensemble.Laisser la canule interne en place pendant cinq minutes supplémentaires après l'infusion afin de permettre une diffusion efficace de la solution d'oligomères de bêta-amyloïde. Après l'infusion, reprendre la manipulation du rat en position de confort (« snuggle hold ») et retirer la canule interne ainsi que la canule guide bouchée afin d'éviter un reflux de la solution injectée. Placer une canule factice s'arrêtant juste avant le bras angulaire de la canule guide.Enfin, remettez l'animal dans sa cage. Les résultats présentés ici montrent le dépôt d'oligomères de bêta-amyloïde dans le gyrus denté près du site d'infusion, ainsi que la mort cellulaire associée à cet accumul. Le taux d'oligomères de bêta-amyloïde a été considérablement réduit par le traitement à l'anticorps 6E10, comme l'indique la coloration immunohistochimique avec l'anticorps anti-A-bêta.Une neurodégénérescence marquée a été observée près du site d'injection des A-beta-O et a été atténuée par le traitement à l'anticorps 6E10, comme le montre la coloration à la violette de crésyl. Une fois maîtrisée, l'implantation de la canule peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement. L'installation de la pompe osmotique prend environ 10 minutes, et l'injection de bêta-amyloïde, environ 15 minutes.Lors de cette procédure, il est important de ne pas appliquer de ciment dentaire autour de l'emplacement de la seconde canule lors de l'insertion de la première canule. En outre, attendez que l'animal soit calmé avant d'insérer la canule interne dans la canule guide. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment implanter des canules et des pompes osmotiques afin d'infuser des oligomères de bêta-amyloïde et tester des traitements contre la maladie d'Alzheimer, tels que l'immunothérapie.

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Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Ici, nous présentons un protocole pour la perfusion cérébrale stéréotaxique directe de bêta-amyloïde. Cette méthodologie fournit un modèle murin vivo alternatif pour aborder les effets à court terme de la bêta-amyloïde sur les neurones cérébraux.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Le amyloïde-β (Aß) -injected modèle animal permet à l'administration d'une quantité et d'espèces de fragments Aß défini et réduit les différences individuelles au sein de chaque groupe d'étude. Ce protocole décrit l'injection intracérébroventriculaire (ICV) de Aß sans instrument stéréotaxique, ce qui permet la production d'anomalies du comportement de type Alzheimer chez les souris normales.

Injection intracérébroventriculaire de Peptides amyloïde-ß chez les souris normales à Provoquer Pleinement Déficits cognitifs de type Alzheimer

Nous avons développé une méthodologie pour la 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) de amyloïde cérébrale-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode peut être généralisée pour la quantification de pratiquement tous les cas de phagocytose in vivo.

3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer

Ce protocole décrit comment préparer des oligomères bêta-amyloïdes d’un peptide synthétique in vitro et d’évaluer les quantités relatives des oligomères bêta-amyloïdes par une dot blot analyse.

A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis

Ce protocole illustre une méthode d'encapsulation cellulaire par la gélation physique rapide de l'alginate pour immobiliser des cellules. Les microbilles obtenues permettent une sécrétion contrôlée et soutenue de l'amyloïde au fil du temps et peuvent être utilisées pour étudier les effets de l'amyloïde sécrété dans les modèles in vitro et in vivo.

Fabrication de microbilles d'amyloïde-Sécrétion d'alginate pour l'utilisation dans la modélisation de la maladie d'Alzheimer

Découvrez une méthode chirurgicale d'infusion d'oligomères bêta-amyloïdes dans l'hippocampe pour étudier la neurotoxicité chez le rat. Ce modèle animal permet d'évaluer l'efficacité de l'immunothérapie contre la maladie d'Alzheimer.

Neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde Oligomère Infusion est contrecarré par Antibody traitement Infused avec les pompes osmotiques (Vidéo) | JoVE Journal

Neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde Oligomère Infusion est contrecarré par Antibody traitement Infused avec les pompes osmotiques

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