Name: Lélevage du Fruit Fly Drosophila melanogaster Sous axéniques et gnotobiotique Conditions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Apprenez à élever Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques pour étudier les interactions entre microbiote et traits de l'hôte. Cette méthode permet de contrôler et manipuler les microorganismes associés aux mouches.

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Certains détails de ce protocole ont été optimisés avec l&#39;aide du Dr Adam Dobson, qui a également fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour les National Institutes of Health (SPNI) numéro de subvention R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD et AED). SPNI numéro de subvention 1F32GM099374-01 (PDN), et Brigham Young University démarrage des fonds (JMC, MLK, MV). Les frais de publication ont été soutenus par le Collège universitaire Brigham Young Life Sciences et du ministère des plantes et de la faune Sciences.

1. Les bactéries Culture (Début ~ 1 semaine avant cueillette des oeufs) <ol><li> Préparer MRS modifié 20 (TMM) plaques et tubes de bouillon (tableau 1). Verser 20 ml de gélose mmrs dans chaque plaque 100 mm de Pétri et laisser refroidir / sécher pendant la nuit, ou 5 ml mmrs bouillon dans 18 tubes à essai en mm. </li><li> Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis et L. plantarum sur mmrs plaques d&#39; agar. Incuber Acetobacter nuit à 30 ° C. Incuber dans des conditions anaérobies Lactobacillus en plaçant les plaques dans un récipient étanche à l&#39; air et l&#39; inondation avec du dioxyde de carbone avant le scellement. Incuber à 30 ° C pendant une nuit. Note: L. colonies brevis peuvent ne pas être visible jusqu&#39;à 24-48 heures. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C et les colonies peuvent être utilisées pour 3 semaines. </li><li> Deux à trois jours avant de transférer les œufs dechorionated à l&#39;alimentation stérile (section 5), choisir une seule colonie de la plaque de TMM dans un tube à essai conmmrs de Taining bouillon. Cultivez Acetobacter avec agitation et grandir Lactobacillus statiquement pendant 24 heures ou jusqu&#39;à ce trouble, à la fois à 30 ° C. </li></ol> 2. Préparer stérile Diet <ol><li> Préparer régime alimentaire stérile (tableau 2) dans un ballon Erlenmeyer de 2 litres. Micro-ondes le régime jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait bouilli 3 fois séquentielles; mélanger entre chaque ébullition. </li><li> Placer le ballon sur une plaque d&#39;agitation pour maintenir l&#39;agitation tout en transférant l&#39;alimentation à tubes à centrifuger coniques. Transfert de 7,5 ml de l&#39;alimentation à tubes de 50 ml de centrifugeuse. plafonner légèrement les tubes, et le placer dans un rack de polypropylène autoclavable couverte. </li><li> Stériliser à l&#39;alimentation de la mouche à l&#39;aide d&#39;un autoclave à 121 ° C et 15 psi pendant 25 min. Retirer les grilles de l&#39;autoclave, et agiter immédiatement chaque rack horizontalement pour assurer l&#39;alimentation ne se sépare pas pendant le refroidissement. Attention à ne pas secouer les grilles verticalement pour empêcher le transfert de l&#39;alimentation sur le couvercle ou rebords des tubes. Laissez l&#39;alimentation refroidir sur un agitateur pendant exactement 45 minutes etagiter de nouveau le régime à l&#39;horizontale à la main. Note: Le régime alimentaire peut être conservé à 4-15 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Comme une alternative à l&#39;utilisation de racks autoclavables couverts (étapes 2.1-2.3), ou pour élever des mouches sur les régimes alimentaires contenant conservateur acide, procédez comme suit: <ol><li> Préparer 1 L diète liquide dans un flacon de 2 litres avec un barreau d&#39;agitation dans le ballon. Autoclave le régime alimentaire. </li><li> Après autoclavage, ajouter 10 ml de conservation et mélanger en continu sur une plaque d&#39;agitation chauffée. Lorsque la gélose a refroidi à 50-60 ° C, déplacer le ballon à une plaque d&#39;agitation chauffée dans une enceinte de sécurité biologique et de maintenir la température du flacon par chauffage à 50-60 ° C. </li><li> Dans le cabinet de biosécurité, pipette ~ 7,5 ml individuellement dans des tubes coniques. </li></ol></li></ol> 3. Préparer Cages pondeuses <ol><li> Fabriquer des plaques d&#39;agar-jus de raisin par micro-ondes 100 ml d&#39;eau, de la levure de bière 10 g, 10 g de glucose et 1 g d&#39;agar-agar. Porter à ébullition 3 fois à l&#39;étape 1.1 et ajouter 10 g de raisins congelés jus concentrate pour augmenter la visibilité des oeufs sur la plaque de gélose. </li><li> Lors de l&#39;agar a refroidi à 55 ° C, verser 20 ml dans des boîtes de Petri de 100 mm et laisser se solidifier. </li><li> Recouvrir la surface des plaques d&#39;agar-agar avec une pâte de levure en mélangeant la levure de bière 1 g à 15 g d&#39;eau. Verser la pâte de levure sur la plaque de gélose assurant que la surface est recouverte, puis verser l&#39;excès, laissant un résidu de levure mince derrière. Si plusieurs plaques sont utilisées, la pâte peut être versé de manière séquentielle à plusieurs plaques. </li><li> Transférer des plaques d&#39;agar dans le fond d&#39;une cage. Remarque: Un conteneur de charcuterie 32 oz est un bon substitut pour les cages à mouches acryliques. <ol><li> Faire des couvercles pour conteneurs de charcuterie 32 oz en perçant un trou dans le haut et le collage d&#39;une maille respirante sur le trou avec de la colle non toxique. Si la colle est soluble dans l&#39;eau d&#39;empêcher l&#39;exposition de l&#39;eau au couvercle. </li></ol></li><li> Transfert 200-300 vole dans le récipient et le couvercle avec couvercle. Couvrez le trou de maille protégée avec une boîte de Pétri couvercle vide prévent l&#39;évaporation de la surface de la gélose et ajouter un papier de soie humide à l&#39;intérieur du couvercle, si désiré. Incuber mouches à 25 ° C pendant la nuit pour 16-20 h. </li></ol> 4. Recueillir des oeufs <ol><li> Préparer un tamis pour la collecte des œufs en plaçant filet de nylon dans une douille en plastique. </li><li> Pour récupérer la plaque avec des oeufs sur elle, retirez les mouches de la cage en transférant à un conteneur vide. Si même les mouches seront utilisées le jour suivant, transférer immédiatement à une nouvelle cage contenant une plaque de gélose jus de raisin fraîchement yeasted. Les mouches peuvent être utilisées pendant 3-5 jours consécutifs </li><li> Retirer les mouches mortes de l&#39;agar-agar avec un pinceau propre, en faisant attention de ne pas briser l&#39;agar-agar. </li><li> Collecter des oeufs en rinçant la plaque de gélose avec de l&#39;eau distillée, le brossage en douceur des œufs de la surface de la gélose, et en versant la suspension sur le maillage. Répéter 3-4 fois jusqu&#39;à ce que la totalité ou la plupart des oeufs ont été enlevés de la plaque de gélose. </li></ol> 5. Dechorionate Oeufs et Transfert à Stérile Diet <ol><li> Préparer l&#39;enceinte de sécurité biologique par pulvérisation à l&#39;intérieur (y compris les côtés) avec 70% d&#39;éthanol. Essuyez le fond avec un tissu de laboratoire, et stériliser le capot avec une lumière UV pendant environ 15 min. Stériliser toutes les fournitures non-biologiques (spécimens tasses, pinceau, pinces, conteneurs de déchets, 400 ml d&#39;eau stérilisée, et 100 ml d&#39;hypochlorite de sodium à 0,6%) par pulvérisation avec de l&#39;éthanol et de placer immédiatement dans l&#39;armoire de biosécurité. Stériliser à la lumière UV pendant 15 min. </li><li> Commencez la première de 2 lavages d&#39;hypochlorite de sodium en plaçant la douille avec les oeufs dans un ml spécimen tasse 120 ou un autre récipient stérile. ~ Verser lentement 90 ml d&#39;une solution d&#39;hypochlorite de sodium à 0,6% dans la douille jusqu&#39;à ce que juste au-dessous de la jante. </li><li> Rincer les œufs pendant 2,5 minutes. Périodiquement remettre en suspension les oeufs à l&#39;aide d&#39;une pince pour déplacer la douille vers le haut et vers le bas dans la solution d&#39;hypochlorite. </li><li> Transférer la douille directement dans une seconde tasse de spécimen, pré-rempli avec 90 ml eau de Javel, dans l&#39;armoire de biosécurité. </li><li> Répéterl&#39;étape 5.3 dans l&#39;armoire de biosécurité. A la fin du deuxième traitement de blanchiment, les œufs devraient commencer à adhérer aux parois de la filière. </li><li> Effectuer les étapes 5.7-5.8 dans l&#39;armoire de biosécurité. </li><li> Jeter l&#39;eau de Javel et laver la douille avec de l&#39;eau stérile 3 fois. Resuspendre les oeufs plusieurs fois au cours de chaque lavage par déplacement de la douille avec une pince. À la fin du troisième lavage la plupart des œufs doivent être fixés sur le côté de la douille. </li><li> Stérilisé à l&#39;aide d&#39;un pinceau dans l&#39;éthanol, le transfert des œufs à partir du côté de la douille à l&#39;alimentation stérile. Transfert des œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30-50 œufs par flacon. Laissez les bouchons en vrac pour permettre à l&#39;oxygène d&#39;entrer dans le tube. Si les flacons doivent rester axénique, transfert à un incubateur d&#39;insectes; sinon, ajouter des bactéries comme ci-dessous. </li></ol> 6. Faire Gnotobiotic Flies Utilisation de 4 espèces bactériennes <ol><li> préparer des bactéries <ol><li> Préparer une enceinte de biosécurité stérilisée avec les fournitures nécessaires (pipettes, boîtes de pointes de pipettes, tubes à centrifuger stérilisés, bouillon de MRS et supports de tube à essai) comme à l&#39;étape 4.1. Essuyez l&#39;extérieur de tubes à essai avec un laboratoire d&#39;éthanol imbibé lingette avant de placer dans l&#39;armoire de biosécurité. </li><li> Sédimenter les bactéries en transférant d&#39;abord 500 pi de croissance pendant une nuit dans un tube de microcentrifugation stérile. Si la densité bactérienne est faible, ajouter jusqu&#39;à 1,5 ml dans chaque tube ou séquentiellement retirer le surnageant et ajouter la culture supplémentaire dans le même tube. Retirer les échantillons de l&#39;enceinte de sécurité biologique et centrifuger pendant 10 min à 10000 x g. Utilisez des conseils de filtre pour éviter la contamination entre les échantillons. </li><li> Déterminer la densité de chaque culture par mesure de la DO 600. Si vous utilisez un lecteur de plaque multi-puits, transférer 200 ul de chaque culture à une plaque de 96 puits dans 1-, 2- et 4- dilutions. </li><li> Déterminer la quantité de TMM dans lequel diluent chaque culot cellulaire (5.2.2) à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre de lecture de plaque et les équations suivantes. Prévoyez d&#39;ajouter assez de bouillon pour ensemencer 50 &amp;# 956; l à chaque flacon de mouche. <ol><li> Collecter des lectures de DO à 600 pour un rapport 1: 1, 1: 2 et 1: 4 dilutions de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre de plaque de lecture. Sélectionnez la dilution pour chaque souche bactérienne qui produit une valeur de 600 OD entre 0,1 et 0,2 et utiliser cette valeur et son facteur de dilution correspondant comme «O» et «D» dans les formules données dans 6.1.4.2 ou 6.1.4.3. </li><li> Si vous utilisez les 4 espèces décrites ici, normaliser les cellules à la colonie équivalente unité de formation (UFC) / ml densités (DO 600 à la conversion CFU précédemment déterminé 20) en utilisant cette équation: E = ((OB) x V x D) / C où E = volume à remettre en suspension le culot dans (ul), O = OD 600 bactéries, B = OD 600 supports vierges, D = pli-dilution, V = culture bactérienne ul avant centrifugation, C = DO 600 de constante prédéterminée. Voir code supplémentaire Fichier des exemples de calculs en utilisant ces équations. Pour spectrophotomètres qu&#39;automatiquement vide, utiliser &quot;O&quot; à la place de &quot;OB&quot;. Remarque: Les constantes prédéterminées (unités DO 600, normalisée à 10 7 ufc ml - 1, les constantes dérivées en 20) sont les suivantes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). </li><li> Si vous utilisez d&#39; autres espèces bactériennes (pas CFU / OD 600 constante est disponible), normaliser la densité de DO 600 = 0,1 en utilisant cette équation: E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600 Note: Les unités sont les mêmes que dans l&#39;étape 6.1.4.2. Voir code supplémentaire Fichier des exemples de calculs en utilisant ces équations. </li></ol></li><li> Dans le cabinet de biosécurité, retirer le surnageant avec une pipette et resuspendre le culot dans mmrs frais ou PBS tel que calculé à l&#39;étape 6.1.4.2. </li></ol></li><li> Inoculer bactéries <ol><li> Transférer 50 pl des bactéries aux tubes coniques avec une alimentation stériled dechorionated oeufs dans l&#39;armoire de biosécurité. Ajouter des bactéries après le transfert d&#39;oeufs pour éviter la contamination entre les flacons. </li><li> Placer les tubes inoculés dans un incubateur à 25 ° C </li></ol></li></ol> 7. Mesurer CFU Load / Test de Stérilité <ol><li> Pour mesurer la charge CFU dans les homogénats entiers de mouche du corps, transfert 5 mouches (5-7 jours après Eclosion) à un tube de 1,7 ml de microcentrifugation contenant 125 pi de billes de céramique et 125 pi de bouillon TMM. Homogénéiser les mouches à l&#39;aide d&#39;un homogénéiseur tissulaire pendant 30 s à 4,0 m / s. <ol><li> Alternativement, omettent des perles et de la main homogénéisent dans des tubes à centrifuger avec pilons en plastique pour 1 min. </li><li> Si la quantification du microbiote intestinal, surface stériliser les mouches pour éliminer les microbes exogènes 22. Transfert vole à un tube de microcentrifugation contenant 100 ul de 70% d&#39;éthanol pendant 1 min, aspirer l&#39;éthanol, et le transfert à un nouveau tube pour homogénéisations. Si la teneur en ADN de l&#39;intestin est mesurée, rincer fou 1 min avec de l&#39;hypochlorite de sodium à 0,6% avant le lavage à l&#39;éthanol. </li></ol></li><li> Diluer le broyat avec 875 mmrs ul, vortex pendant 5 secondes, et pipeter 120 pi d&#39;homogénat dans le premier puits d&#39;une plaque de microtitrage. </li><li> Effectuer deux séquentielles 1: 8 dilutions en utilisant 10 homogénat pi et 70 pi de MRS dans les deux prochains puits. <ol><li> Retirer 10 ul du premier puits et l&#39;ajouter à la deuxième puits contenant 70 ul MRS. Mélanger le contenu du deuxième puits à fond, le transfert de 10 ul du second puits au troisième puits contenant 70 ul MRS, et bien mélanger. Cela conduit à des 3 concentrations totales de l&#39;homogénat initial 1000 pi: non dilué 1: 8 et 1:64. </li></ol></li><li> Transfert de 10 pi de chaque dilution à une plaque mmrs (en utilisant une pipette à canaux multiples si désiré). Inclinez légèrement le plat pour répandre la dilution de plusieurs millimètres en bas de la surface de la gélose et permettre au liquide de sécher avant de déplacer la plaque. Le liquide sèche sur the plaque rapidement si les plaques sont âgés de 2 jours, ce qui réduit le mélange des deux gouttelettes voisines. </li><li> Incuber à 30 ° C pendant 1-2 jours. Retirer les plaques de l&#39;incubateur, une fois distinctes, des colonies individuelles sont visibles, et compter à partir d&#39;une dilution avec 10-100 colonies isolées. </li><li> Calculer CFU par volée en utilisant l&#39;équation E = C x D / P x V / F, où E = CFU par mouche, C = nombre de colonies comptées, D = dilution, P = plaqué ul, V = volume de la mouche homogénat, et F = nombre de mouches homogénéisés. </li></ol>

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<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+the+defined+murine+microbiota%3A+altered+Schaedler+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

<html> La méthode décrite ici est l&#39; une de plusieurs approches pour l&#39; embryon dechorionation 8,11,18,25,26,27, ainsi que d&#39; autres méthodes d&#39;élevage des mouches axéniques, y compris le transfert série des adultes axéniques 18,27 ou un traitement antibiotique 13,18. D&#39; autres méthodes de dechorionation comprennent des lavages à l&#39;éthanol et à réduire les 11,25,26 ou étendent 8 traitement hypochlorite. Étapes de lavage différentes peuvent aid...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/54219/rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic">Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions</a>. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

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Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

La plupart des animaux sont intimement associés à des bactéries ( «microbiote») de la naissance à la mort 1. Les comparaisons de ( «classique») des animaux exempts de micro - organismes ( &#39;axénique&#39;) et un micro-organisme associé ont montré microbes influencent divers aspects de la santé animale, y compris métabolique, nutritionnel, vasculaire, hépatique, respiratoire, immunologique, endocrinien, et la fonction neurologique 2. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un modèle clé pour comprendre un grand nombre de ces processus dans la présence de microbes 3,4 et pour l&#39; étude microbiote influence sur 5,6 de la santé animale. Aucune espèce bactérienne est présente dans chaque individu ( «noyau»), mais les espèces Acetobacter et Lactobacillus dominent numériquement le microbiote des deux élevés en laboratoire et sauvages capturés D. melanogaster. Acetobacteraceae autres (y compris Komagataeibacter et Gluconobacter) Firmicutes (comme Enterococcus et Leuconostoc), et entérobactéries sont soit souvent présent chez les individus de drosophile à faible abondance, ou irrégulièrement présent à forte abondance 7-12. Le microbiote de la drosophile et les mammifères est inconstante au sein et à travers les générations 14,19. Microbiota inconsistance peut conduire à un bruit phénotypique lors de la mesure des traits de microbiote-dépendants. Par exemple, le stockage Acetobacteraceae influence lipides (triglycérides) chez la drosophile 15-18. Si Acetobacteraceae sont plus abondants dans les mouches d&#39;un flacon que dans un autre 19, les mouches isogéniques peuvent avoir différents phénotypes 20. Une solution pour le problème de microbiote inconsistance chez la souris 14 a été dans la pratique depuis les années 1960, par l&#39; introduction d&#39; une communauté définie de 8 espèces microbiennes dominantes souriceaux chaque nouvelle génération (modifié la flore SCHAEDLER),veiller à ce que chaque chiot est exposé aux mêmes membres clés de la microflore de la souris. Cette pratique contrôle de la composition du microbiote même lorsque le microbiote est pas la cible principale de l&#39; étude 32, et crée un précédent pour assurer la présence de microbes clés dans une variété de conditions expérimentales. Pour définir l&#39;influence des microbes sur la drosophile nutrition, plusieurs protocoles pour dériver des lignes de mouche axéniques ont été mis au point, y compris l&#39; hypochlorite dechorionation d&#39;embryons (soit dérivée de novo chaque génération ou maintenu generations par transfert à des régimes alimentaires stériles) et un traitement antibiotique 13. Il y a des avantages à différentes approches, telles que la facilité et la rapidité à la fois du traitement aux antibiotiques et transfert en série, par rapport à un plus grand contrôle des variables confondantes avec de novo dechorionation (par exemple, la densité des oeufs, des microbes contaminants résiduels, les effets hors-cible d&#39; antibiotiques). Indépendamment de la méthode dela préparation, l&#39; introduction d&#39;espèces microbiennes spécifiées aux axéniques embryons permet la culture de Drosophila avec les communautés ( &#39;gnotobiotiques&#39;) définis. Alternativement, imitant l&#39;utilisation de la flore SCHAEDLER, cette communauté pourrait être inoculé aux œufs conventionnellement fixées (en suivant les étapes 6-7 seulement) pour assurer la présence de microbes de traits influençant dans chaque flacon et éviter les complications de microbiote inconsistance. Nous décrivons ici le protocole pour élever axénique et gnotobiotique Drosophila par de novo dechorionation d&#39;embryons, et pour confirmer la présence de taxons microbien introduit ou contaminant.

<table><tbody><tr><td>Levure de bière</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>903312</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158968-3KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher--Lab Scientific</td><td>fly802010</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177</td></tr><tr><td>Welch’s 100 % Concentré</td> <td>de jus de raisinWalmart ou autre épicerie</td><td>9116196</td><td>http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406</td></tr><tr><td>Cage : Conteneur de charcuterie rond translucide de 32 oz</td><td>Webstaurant Store</td><td>999L5032Y</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html</td></tr><tr><td>Couvercle de récipient de charcuterie rond translucide</td><td>Webstaurant Store</td><td>999YNL500</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html</td></tr><tr><td>Bouteilles</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130</td></tr><tr><td>Droso-Plugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101</td></tr><tr><td>Maille Nylon</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102&nbsp ;</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102</td></tr><tr><td>Bague en plastique</td><td>Home Depot</td><td>100404002</td><td>http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002</td></tr><tr><td>Capuchon de douille en plastique</td><td>Home Depot</td><td>100153897</td><td>http://www.homedepot.com/p/1-1-4-en-rigide-Plastique-isolé-Bushing-2-Pack-27529/100153897</td></tr><tr><td>Specimen Cup</td><td>MedSupply</td><td>Partners K01-207067</td><td>http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html</td></tr><tr><td>Répéteur M4</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html</td></tr><tr><td>50 ml Tubes à centrifuger</td><td>TrueLine TR2003</td><td></td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003</td></tr><tr><td>Food Boxes</td><td>USA Scientifique</td><td>2316-5001</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001</td></tr><tr><td>Lysing Matrix D en vrac</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116540434</td><td>http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search</td></tr><tr><td>pointes de pipette à filtre, 300 &mu ; l</td><td>USA Scientific</td><td>1120-9810</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Laboratoire Ventes</td><td>M089303</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC.</td><td>2701</td><td>http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88</td></tr><tr><td>Pinceau</td><td>Walmart</td><td>5133</td><td>http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher</td><td>08-882</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693</td></tr><tr><td>Eau de Javel domestique (6-8 % d’hypochlorite)</td><td>Walmart</td><td>550646751</td><td>http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295</td></tr><tr><td>Universal Peptone</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-260</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td>&<td>nbsp ; Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500</td></tr><tr><td>Phosphate dipotassique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-1KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&amp ; 
N=0& mode=match %20partialmax& lang= 
fr& region=US& focus=produit</td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>25102-500g</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N 
=0& mode=match %20partialmax& lang= 
fr& region=US& focus=product</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>VWR</td><td>97061-994</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500</td></tr><tr><td>Sulfate de manganèse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10034-96-5</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match 
%20partialmax& lang=fr& region =ÉTATS-UNIS& focus=product</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69966-500G</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>96 Well Plate Reader</td><td>BioTek (Epoch)&nbsp ;</td><td>NA</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 1,7 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500</td></tr><tr><td>Pointes de pipette, 1 000 &mu ; l</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830</td></tr><tr><td>96 Plaques</td><td>de puits Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/</td></tr><tr><td>Ceramic Beads</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>6540-434</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116004500</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500</td></tr><tr><td>Classe 1</td><td>BioSafety Cabinet Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>Modèle 1395</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html</td></tr></tbody></table>

l&#39;élevage du fruit fly<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; sous axéniques et gnotobiotique conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

L’influence des microbes sur une myriade de traits et de comportements animaux a été de plus en plus reconnue ces dernières années. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un modèle permettant de comprendre les interactions microbiennes avec des hôtes animaux, facilité par des approches visant à élever de grandes tailles d’échantillons de drosophile dans des conditions exemptes de micro-organismes (axéniques) ou avec des communautés microbiennes définies (gnotobiotiques). Ce travail décrit une méthode de collecte d’embryons de drosophile, de déchorionisation et de stérilisation à l’hypochlorite, et de transfert dans un régime stérile. Les embryons stérilisés sont transférés dans un régime stérile dans des tubes à centrifuger de 50 ml, et les larves et les adultes en développement restent exempts de tout microbe exogène jusqu’à ce que les flacons soient ouverts. Alternativement, les mouches avec un microbiote défini peuvent être élevées en inoculant un régime stérile et des embryons avec des espèces microbiennes d’intérêt. Nous décrivons l’introduction de 4 espèces bactériennes pour établir un microbiote gnotobiotique représentatif chez la drosophile. Enfin, nous décrivons des approches pour confirmer la composition de la communauté bactérienne, y compris des tests pour savoir si la drosophile axénique reste exempte de bactéries à l’âge adulte.

Élevage réussie de mouches axéniques est confirmé par l&#39; isolement d&#39;aucune CFU de homogénéisations corps entier de D. adultes melanogaster (Figure 1). Alternativement, si le broyat plaqué donne des colonies, les flacons sont contaminés et doivent être jetés. Pour les mouches gnotobiotiques, chacun des quatre isolats bactériens ont été isolés à partir de pools de 5 mâles adultes, ce qui démontre les différences de CFU viables totaux associés à m...

Une méthode pour l&#39; élevage Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques est présenté. Fly embryons sont dechorionated dans l&#39;hypochlorite de sodium, transférés de manière aseptique à l&#39;alimentation stérile, et élevés dans des récipients fermés. Inoculant régime alimentaire et les embryons avec des bactéries conduit à des associations gnotobiotiques, et la présence bactérienne est confirmée par plaquage du corps entier homogénats drosophile.

L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

L'objectif général de cette procédure est d'élever des mouches à fruits dépourvues de micro-organismes associés. Cette méthode peut aider tout chercheur dans le domaine de la drosophile à contrôler, manipuler ou étudier la microflore, notamment ses relations avec divers caractères de l'hôte. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet aux chercheurs d'élever des mouches à fruits en l'absence totale de micro-organismes externes.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les étapes de stérilisation et de rinçage doivent être effectuées sans introduire de micro-organismes contaminants. Pour commencer l'expérience, réalisez des stries à partir de cultures préparées au préalable sur des boîtes de Petri contenant un milieu agarisé MRS modifié, ou mMRS. Incubez les boîtes pendant une nuit à 30 degrés Celsius.Incuber les cultures anaérobies dans un récipient hermétique, puis inonder ce dernier de dioxyde de carbone avant de le sceller. Le jour suivant, prélever une colonie unique à partir de la boîte de Petri mMRS et la transférer dans un tube à essai contenant du bouillon mMRS. Faire croître les espèces de lactobacilles en conditi

rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

L’embryon de drosophile est entouré de membranes externes protectrices. Pour accéder à l’embryon, le chorion – la plus externe des membranes – est souvent retiré. Cette vidéo décrit une méthode de déchorionisation couramment utilisée à l’aide d’hypochlorite de sodium. L’exemple de protocole illustre la procédure tout en utilisant des techniques stériles nécessaires à l’élevage d’animaux axéniques ou gnotobiotiques.

drosophile Collecte et déchorionnation des œufs : une méthode pour éliminer la couche d’œuf la plus externe

Le microbiote de la drosophile impacte le développement, l'immunité et la physiologie de l'animal. Cette vidéo décrit une méthode pour quantifier les bactéries des mouches en déterminant les unités formant des colonies à partir de préparations du corps entier. Le protocole présenté démontre la technique avec des mouches, élevées dans des conditions gnotobiotiques à l’aide de quatre espèces bactériennes.

Comptage des unités formant colonies (UFC) : Quantifier les bactéries des corps de mouches

Source : Siva-Jothy, J. A., et al. Infection bactérienne orale et extirpation chez Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)La vidéo montre l’infection buccale de Drosophila melanogaster par des bactéries pathogènes. Cela inclut la préparation de fioles infectées et le transfert de mouches affamées pour permettre l’ingestion bactérienne. La procédure capture la colonisation intestinale, suivie de la stérilisation de surface et de l’homogénéisation des mouches. Enfin, il montre la...

Infection buccale de Drosophila melanogaster avec des bactéries pathogènes

Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour l’élevage, sur une base régulière, d’une population de Drosophila melanogaster à l’aide d’une cage à mouches.

Le maintien d&#39;un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Population Cage

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test de longueur de chemin de recherche de nourriture de Drosophila melanogaster. Nous discutons de la préparation et de la manipulation des animaux de test, de la façon d’effectuer le test et d’analyser les données.

Foraging Protocole Chemin de longueur pour<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; larves

Ce protocole décrit les méthodes à exposer oralement et à infecter la drosophile Drosophila melanogaster avec des bactéries pathogènes et de mesurer le nombre de bactéries infectieuses hangar suite à une infection intestinale. Nous décrivons plus l’effet des mutants immunitaires sur la mouche survie suite à une infection bactérienne par voie orale.

Oral Infection bactérienne et excrétion chez Drosophila melanogaster

Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.

Drosophila melanogaster Protocole d’injection de larves

Une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture a été établie. En utilisant cette méthode, le rôle des signaux systémiques peut être découplé des signaux intrinsèques des tissus dans la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie des cellules souches neurales.

Réactivation des cellules souches neurales dans les explants cérébraux de drosophiles en culture

Ici, nous fournissons des détails sur la préparation des lysats et la réalisation de la traduction in vitro à l’aide d’embryons de Drosophila .

Traduction d’ARNm in vitro sans cellules chez les lysats de Drosophila

Les cellules sanguines de la drosophile, ou hémocytes, circulent entre les sites résidents et la circulation.  Chez la larve, les hémocytes résidents (sessiles) se localisent dans des microenvironnements inductifs, les poches hématopoïétiques, tandis que les hémocytes circulants se déplacent librement dans l’hémolymphe. L’objectif de ce protocole est l’isolement et la quantification standardisés de ces deux populations d’hémocytes, distinctes sur le plan comportemental mais interchangeables.

Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

Apprenez à élever Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques pour étudier les interactions entre microbiote et traits de l'hôte. Cette méthode permet de contrôler et manipuler les microorganismes associés aux mouches.

L'élevage du Fruit Fly

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