Isoler cellules progénitrices Mesangiogenic (PPM) de Human Bone Marrow

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules progénitrices mésangiogéniques ou MPC de la moelle osseuse humaine par des conditions de culture sélectives. Nous testons à la fois leurs potentiels mésogènes et angiogéniques. Les cellules progénitrices mésangiogéniques sont identifiées à un faible pourcentage avec une culture cellulaire mesen-ki-ma-stro-mo optimisée pour l’application clinique.

Lorsque FBS est remplacé par le sérum humain. Cette technique est unique : en effet, elle permet d’isoler de manière très cohérente un grand nombre de NPC alli-pol-ifiés, propices à la germination, à l’angiogenèse et à une génération de cultures de CSM synchronisées. Nous l’avons découvert lorsque, après des voyages dans la digestion de cultures MCS dans un sérum de talgrum, quelques cellules en forme d’œuf frit restent attachées mais différenciées en MC après le traitement FPS.

Pour isoler les cellules mononucléées de la moelle osseuse humaine, ou MNC, commencez par diluer cinq à 10 millilitres de moelle osseuse fraîche jusqu’à un volume total de 50 millilitres avec du DPBS et mélangez la solution cellulaire par inversion. Ensuite, répartissez également 25 millilitres de cellules dans deux nouveaux tubes coniques de 50 millilitres et ajoutez 25 millilitres de DPBS frais dans chaque tube pour un deuxième mélange par inversion. Ensuite, laissez reposer les cellules à température ambiante pour permettre aux fragments d’os minéraux et à la graisse de se séparer de la solution.

Après 10 minutes, utilisez une pipette pastuer pour éliminer soigneusement la graisse flottante et filtrer les suspensions cellulaires à travers des filtres individuels de 70 microns sans perturber les granules de fragments d’os minéraux. Pour isoler la couche de MNC, 20 à 25 millilitres de moelle osseuse diluée au-dessus de la température ambiante, 1,007 gramme par millilitre, gradient de densité dans chacun des deux tubes de 50 millilitres et séparer les cellules par centrifugation. Ensuite, à l’aide d’une pipette à pastuer stérile, les anneaux blanchâtres des cellules au niveau des faces d’entrée dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Lavez les cellules mononucléées isolées avec un milieu de culture frais pendant cinq minutes à 400 fois G et à température ambiante. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans cinq à 10 millilitres de milieu de culture frais. Pour isoler le MPC, équilibrez les flacons hydrophobes T75 avec 15 millilitres de milieu de culture frais à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone.

Après 30 minutes, ensemencez quatre à six fois 10 pour sept cellules mononucléées de moelle osseuse humaine par flacon pour une incubation de 48 heures. Le deuxième jour, jetez le milieu et les cellules non adhérentes des flacons et nourrissez les cellules avec 15 millilitres de milieu de culture frais. Remettez les cultures dans l’incubateur pendant six à huit jours.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules adhérentes avec du DMEM frais. Ensuite, incubez les cellules avec deux millilitres de solution de détachement de protéas sans animaux pendant cinq à 15 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont été soulevées du fond du ballon, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture frais pour arrêter la réaction et collectez les cellules par centrifugation, en remettant la pastille en suspension dans un à deux millilitres de milieu de culture frais.

Après avoir compté la plaque MPC deux fois, 10 à quatre par centimètre carré de cellules dans des flacons de culture T75 traités pour la culture tissulaire et collez les cellules pendant la nuit dans 15 millilitres de milieu de culture frais dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, remplacez le milieu de culture par 200 microlitres par centimètre carré de milieu d’expansion de cellules misancolmulstromul ou MSC et cultivez les cellules pendant sept à dix jours supplémentaires. Lorsque les cultures ont atteint la confluence, la sous-culture à trois à cinq fois dix à trois cellules par centimètre carré jusqu’à ce qu’elle atteigne une nouvelle confluence de passage deux au MSC, puis effectuez une digestion des protéas pour collecter les cellules, comme démontré précédemment.

Plaque deux fois dix à la quatrième cellules par centimètre carré dans une culture tissulaire traitée, six plaques à puits et un milieu d’expansion frais. Après avoir cultivé les cultures jusqu’à ce qu’elles se confluent à nouveau, marquez deux puits comme aucune différenciation et rafraîchissez le milieu d’expansion. Marquez deux puits comme des explosions ostéo-statiques et remplacez le milieu par 200 microlitres par centimètre carré de milieu ostéogénique standard spécialement conçu pour la différenciation des CSM.

Ensuite, marquez deux puits comme sites adipo et remplacez le milieu par 200 microlitres par centimètre carré de milieu adipo génique standard spécialement conçu pour la différenciation des CSM. Remettez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à trois semaines jusqu’à ce qu’elles se soient différenciées. Passez ensuite à la détection fluorescente des dépôts de calcium extracellulaires et à l’accumulation de gouttelettes lipidiques cellulaires.

Pour produire des sphéroïdes 3D, ensemencez un grand nombre de gouttes de 20 microlitres de suspension MPC fraîchement isolée sur la surface intérieure d’un couvercle de boîte de Pétri. Lorsque toutes les gouttes ont été placées avec précaution, placez le couvercle sur une base de boîte de Pétri contenant du DPBS pour éviter l’évaporation des gouttes suspendues et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain matin, ajoutez 300 microlitres d’allo-quats de protéines de matrice extracellulaire standard dans chaque puits d’une plaque de culture à quatre degrés Celsius et 24 puits et gélifiez les protéines de la matrice à leurs 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ajoutez 700 microlitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale vasculaire standard riche en facteur de croissance endothéliale sur les protéines ECM gélifiées. Lorsque les MPC se sont agrégés en sphéroïdes 3D, retournez soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri et utilisez une pipette Pasteur stérile pour récolter doucement les sphéroïdes. Enfin, semez les sphéroïdes dans les puits de culture et remettez la plaque dans l’incubateur.

Morphilogiquement, les MPC se caractérisent par leur forme distinctive d’œuf au plat avec une région centrale épaisse entourée d’une périphérie mince et plate présentant de nombreux philipodia. L’allongement polaire de la limite cellulaire externe est également souvent observé. La culture de MPC dans un milieu d’expansion MSC entraîne une différenciation rapide mais partielle en cellules plates et multiramifiées proliférantes, avec des MPC résiduelles indifférenciées toujours détectables.

Après un passage supplémentaire, les cultures aboutissent à une monocouche de cellules MSC à croissance exponentielle. Dans le processus, les MPC réorganisent leur F-actine en fibres de stress tandis que l’expression de Nestin se limite à quelques cellules rares. L’analyse des flux de MPC fraîchement isolés montre que plus de 95 % des cellules expriment CD31 et CD45 mais manquent d’antigènes associés à la maladie CD90 et CD 73.

Ces derniers antigènes ne sont fortement exprimés qu’après une différenciation complète en CSM. Confirmant leur nature mis-en-com-ale, lorsqu’elles sont nourries avec un milieu différenciateur pendant au moins deux semaines, ces cellules peuvent facilement être induites dans des explosions ostéostatiques, comme l’indiquent leurs dépôts de calcium, ou adiposités, comme en témoigne l’accumulation de gouttelettes lipidiques. Confirmation de la nature MSC des cultures cellulaires prédifférenciées.

Le typage MPC est confirmé dans un test d’angiogenèse germinative, les cellules présentant une capacité à envahir un gel de protéines de matrice extracellulaire myrienne à partir de sphéroïdes 3D après 24 heures de stimulus du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire. Au bout d’une semaine, les cellules envahissantes migrent sur une distance encore plus grande, une capacité d’invasion qui se perd dans les CSM de second passage après la différenciation mésanogénique. Une fois maîtrisées, les cultures MSC peuvent être établies en une heure si elles sont bien abordées, fournissant entre un ou deux millions de MPC en moins d’une semaine.

Lors de cette procédure, il est important d’évaluer les performances des lots de CR humains avant de les utiliser en culture. À l’heure actuelle, notre protocole d’isolement MPC est le seul permettant d’obtenir une culture MC presque pure hautement reproductible pour une application ultérieure en aval. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine des thérapies cellulaires pour explorer la possibilité d’appliquer la MPC dans la régénération des tissus squelettiques.