Techniques pour l'évolution de la levure robuste Pentose-fermentation pour la bioconversion de lignocellulose en éthanol

L’objectif global de cette procédure d’évolution adaptative est de dériver des souches robustes de la levure de fermentation xylose native scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 qui peuvent fermenter plus rapidement les sucres hexose et pentose dans les hydrolysats non détoxifiés en éthanol économiquement récupérable. Cette méthode fait avancer l’industrie de la lignocellulose vers l’éthanol en fournissant une feuille de route vers les souches avec des modifications complexes, permettant la fermentation des sucres dans des hydrolysats contenant des inhibiteurs microbiens. Ici, le principal avantage de l’évolution ciblée est que des souches robustes sont moulées à partir d’une levure indigène capable de fermenter le xylose, éliminant ainsi le besoin de concevoir des souches industrielles de saccharomyces.

Nous avons réalisé qu’il était peu probable qu’une seule souche de levure soit robuste dans différents types d’hydrolysats, tels que les tiges de maïs prétraitées AFEX ou le panic raide prétraité à l’acide dilué. La capacité de Scheffersomyces stipitis à subir un cycle de reproduction sexuée est bénéfique pour une exploitation ultérieure dans le présent travail, car les différentes souches développées peuvent être combinées en une seule souche plus robuste par l’accouplement de souches ayant ces divers caractères. Les coauteures Stephanie Thomson et Maureen Shea-Andersh, qui sont techniciennes en sciences biologiques dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Avant de commencer cette procédure d’enrichissement, préparez une préculture de la souche NRRL Y-7124 dans une fiole de 125 millilitres et une série de dilutions de l’enzyme enzyme expansion de fibres d’ammoniac saccharifiées hydrolysat de tiges de maïs prétraitées, ou AFEX CSH. À l’aide d’une pipette à répétition, remplissez une microplaque de 96 puits avec 15 microlitres par puits et huit puits par dilution d’hydrolysat. Inoculer avec quelques microlitres de préculture par puits pour permettre une absorbance initiale à 620 nanomètres, ou A620 supérieure ou égale à 0,1.

Placez la microplaque dans une boîte en plastique avec une serviette en papier humide pour l’humidité et incubez statiquement pendant 24 à 28 heures à 25 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre à lecture de microplaques pour identifier les cultures qui ont physiquement atteint un A620 supérieur à 1,0 dans la dilution d’hydrolysat la plus concentrée. Regrouper les puits identifiés dans un tube de microfuge et les distribuer dans une plaque de remplissage.

Transférez un à cinq microlitres de la plaque de remplissage vers chaque puits d’une nouvelle série de dilution d’hydrolysat pour obtenir un A620 initial supérieur ou égal à 0,1 et incubez la plaque comme précédemment. Surveillez la croissance des cultures dans la microplaque à l’aide d’un spectrophotomètre à lecture de microplaques. Préparez régulièrement des stocks de glycérol de cultures d’adaptation.

Regrouper quatre puits de la plus grande concentration d’hydrolysat colonisés dans une lime cryogénique, et mélanger un à un avec 20 % de glycérol stérile. Congelez les cellules à moins 80 degrés Celsius. Répétez cette procédure d’enrichissement jusqu’à ce que la croissance dans 12 % de glucane AFEX CSH soit constamment visible après 24 heures.

Pour commencer cette procédure, striez des stocks de glycérol sélectionnés de cultures d’adaptation à la levure, au malt, au peptone, au dextrose ou à la gélose YM. Ensuite, après la croissance, utilisez des stries pour inoculer 50 microlitres de 3 % ou 6 % de glucane AFEX CSH dans chacun des trois puits de microplaques. Incuber la microplaque pendant 24 heures à 25 degrés Celsius.

La piscine reproduit les puits colonisés à la force d’hydrolysat la plus élevée avec une forte croissance. Et plaque de dilution à YM ou 6 % de glucane AFEX CSH agar. Incuber les plaques dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures.

Choisissez cinq colonies simples dans la plaque de dilution la plus élevée montrant la croissance pour geler sous forme de cultures mères de glycérol. Striez chaque colonie sur une plaque YM et incubez pendant 24 heures. À l’aide d’une boucle stérile, transférez une traînée développée de cellules dans un petit volume de 10 % de glycérol mélangé pour suspendre les cellules et distribuez-les à deux ou trois cryofiles pour une congélation à moins 80 degrés Celsius.

Pour tester les isolats dans des cultures discontinues AFEX CSH simples à 6 % de glucane, transférez des cellules de plaques de 48 heures striées de stocks de glycérol vers un tampon de phosphate de potassium pH 7 pour préparer des suspensions cellulaires. Après avoir mesuré la densité optique de chaque suspension de cellule, ajustez le volume avec un tampon supplémentaire pour atteindre un A620 de dix. À l’aide d’un microlitre de chaque suspension, inoculer chacun des quatre puits de 50 microlitres d’hydrolysat de glucane à 3 % jusqu’à un A620 initial de 0,2.

Incuber la microplaque pendant 24 heures. Ensuite, transférez deux puits de microplaques de 24 heures pour inoculer des précultures de 25 millilitres de 6 % de glucane AFEX CSH à pH 5. Fermez les flacons à l’aide d’une éponge de silicone et incubez pendant 24 heures à 25 degrés Celsius et 150 tr/min.

Utilisez les précultures AFEX CSH à 6 % de glucane pour inoculer des cultures de croissance similaires de 25 millilitres en double avec un A620 initial de 0,1. Incuber les cultures de croissance pendant 24 heures à 25 degrés Celsius et 150 tr/min. Pour tester l’absence d’isolats dioxiques dans des cultures discontinues de milieu défini optimal, ou ODM, avec des sucres mélangés, inoculez des précultures de 75 millilitres ODM avec 150 grammes par litre de xylose dans des flacons de 125 millilitres avec des bouchons en éponge de silicone.

Incuber pendant 24 heures à 25 degrés Celsius et 150 tr/min. Utilisez les précultures pour inoculer à un A620 de 0,1 des cultures d’essai similaires de 75 millilitres avec ODM contenant 75 grammes par litre de glucose et 75 grammes par litre de xylose à pH 6,5. Agiter les flacons à 25 degrés Celsius et 150 tr/min.

24 heures avant l’inoculation d’une culture continue, préparer une préculture d’une colonie représentative tolérante à l’AFEX CSH dans de l’ODM sans éthanol dans une fiole de 125 millilitres. Utiliser de cinq à 10 millilitres d’isolat tolérant au CSH AFEX avant la préculture pour inoculer 100 millilitres d’ODM dans une fiole tournante de 100 millilitres avec chemise afin d’obtenir un A620 initial de 0,5. Maintenez le volume de maintien de la culture à 25 degrés Celsius.

Mélangez-le à 200 tr/min et équipez-le d’une électrode de pH stérilisable, d’un contrôleur de pH et d’un bain-marie à circulation à température contrôlée. Initialement, étant donné que la croissance cellulaire sera lente en raison de l’exposition à l’éthanol, installez une pompe actionnée par le pH de sorte que lorsque la fermentation de la culture diminue le pH à 5,4, la pompe alimente le pH 6,3 ODM avec 100 grammes par litre de xylose et 50 grammes par litre d’éthanol pour arrêter les baisses de pH. Maintenir le volume à 100 millilitres à l’aide d’une pompe à effluents qui effleure continuellement la surface de la culture.

Mesurer le volume d’effluent recueilli et prélever des échantillons dans des cultures continues toutes les 48 à 72 heures pour l’analyse de la concentration cellulaire viable, des produits et des substrats, comme décrit dans le manuscrit. Conservez régulièrement les stocks de glycérol en isolant les colonies à partir de plaques de viabilité de dilutions d’échantillons tamponnés formant 30 à 100 colonies, représentant les colonies robustes les plus répandues à ce moment-là en matière d’enrichissement. Inonder les plaques avec cinq millilitres de glycérol à 10 % pour permettre la préparation de fichiers cryogéniques en double.

Si les cultures peuvent croître régulièrement à des taux spécifiques supérieurs à 0,01 par heure sur le xylose en présence de plus de 25 grammes par litre d’éthanol, commencer l’alimentation continue de la culture à un faible taux de dilution d’environ 0,01 par heure pour le volume de maintien de 100 millilitres. Au fil du temps, augmentez l’éthanol dans l’alimentation jusqu’à 50 grammes par litre. L’irradiation ultraviolette des inoculums pour redémarrer les cultures continues est une option pour accélérer le taux de mutation.

Capturer des populations avancées dans les stocks de glycérol. Avant d’isoler les colonies de cellules uniques, les populations de stock de glycérol avec une meilleure fermentation du xylose en présence d’éthanol sont identifiées comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez ces populations supérieures pour strier les plaques.

Les plaques striées sont utilisées pour préparer des suspensions denses de cellules tamponnées d’un A620 égal à cinq. Ensuite, des suspensions cellulaires sont utilisées pour inoculer des précultures dans 96 plaques à puits profonds. Incuber pendant 48 heures à 25 degrés Celsius, 400 tr/min et une orbite d’un pouce.

Ensuite, enrichissez les colonies tolérantes en utilisant chaque préculture pour inoculer 16 cultures répliquées d’un millilitre à un A620 initial de 0,5 dans de la liqueur d’hydrolysat de panic raide prétraitée à l’acide, mélangée un à un avec de l’ODM plus 50 grammes par litre de xylose, et suffisamment d’éthanol pour fournir une provocation de 20, 30 ou 40 grammes par litre d’éthanol. Incuber pendant 48 heures à 25 degrés Celsius, 400 tr/min et une orbite d’un pouce. Pour chaque stock de glycérol différent, récoltez les puits de culture avec la plus forte concentration d’éthanol permettant la croissance et l’utilisation du xylose.

Plaquez chaque lignée cellulaire dans une gélose YM pour obtenir des colonies uniques prévalentes à conserver dans le glycérol. Choisissez 10 colonies par lignée cellulaire et soyez-les chacune sur une plaque de gélose YM pour la préparation du stock de glycérol. Après adaptation sur AFEX CSH, une comparaison des performances de fermentation en ODM entre la souche parentale et les populations adaptées révèle que les populations adaptées utilisent le xylose plus efficacement pour fabriquer de l’éthanol plus rapidement et en plus grandes quantités.

Une colonie tolérante à l’hydrolysat a été développée pour améliorer la tolérance à l’éthanol par une sélection continue de cultures sur des ODM contenant du xylose et des niveaux élevés d’éthanol. Toutes les populations adaptées ont surpassé le parent dans la capacité d’induire le métabolisme du xylose en présence de 40 grammes par litre d’éthanol. Ces graphiques résument les performances des isolats tolérants supérieurs évalués en termes de taux d’absorption du xylose et de rendements en éthanol par rapport à la souche parentale pour chaque formulation de PSGHL.

Les meilleures souches sélectionnées à partir du criblage primaire sur des PSGHL riches en xylose ont ensuite été criblées sur trois hydrolysats complets et l’indice de performance relatif, ou IPR, a été calculé pour la fermentation de chaque isolat dans chaque hydrolysat. Ensuite, les indices de performance globaux combinés pour chaque isolat ont été calculés. Cinq isolats, trois, 14, 27, 28 et 33, avaient des IPR globaux supérieurs à 60, ce qui les classait comme les plus robustes à toutes les variations des conditions d’hydrolysat et de nutriment combinées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez savoir comment défier une levure en fermentation xylose comme scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 dans un processus d’évolution ciblé, enrichir, isoler et évaluer des dérivés plus robustes qui fermentent plus efficacement les sucres mélangés dans des hydrolysats non détoxifiés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée avec un investissement quotidien d’environ une heure par jour. Les changements significatifs dans le processus d’évolution peuvent être documentés en aussi peu que quatre mois.

Tout en tentant cette procédure, il est important de sauver régulièrement les populations en progression en préparant les stocks de glycérol à geler à moins 80 degrés Celsius. Cela permet la reconstitution de la population, l’évaluation périodique, l’isolement ou le redémarrage du processus d’évolution. Pour gérer diverses mutations, n’oubliez pas de dépister régulièrement la levure dans des conditions spécifiques au processus pour un éventail de phénotypes.

Le calcul des indices de performance relatifs globaux sans dimension, ou RPI, basés sur des paramètres cinétiques, permet d’évaluer le rang de la déformation et la robustesse aux variations des conditions de fermentation telles que le type d’hydrolysat et la supplémentation en nutriments. Les levures supérieures issues de chaque phase du processus d’évolution sont candidates pour le séquençage du génome afin que la nature des améliorations, telles que la tolérance aux inhibiteurs, soit réduite et que le décalage dioxique puisse être compris et utilisé pour la conception de souches biocatalytiques de nouvelle génération.