Name: Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre lhypoxie / perturbation induite par la réoxygénation- (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez la culture de trophoblastes villosités humains primaires pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre le stress oxydatif induit par l'hypoxie-réoxygénation. Ce modèle in vitro aide à comprendre les complications de grossesse liées au placenta.

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Soutenu par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (n° 262011-2009) à CV et une subvention de recherche en sciences sociales et comportementales de la Marche des dix sous (#12-FY12-179) à CV et JTS ; par des bourses d’études à LSF du ministère de l’Éducation, de l’Enseignement supérieur et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) et de la Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, à SC du Réseau québécois en reproduction-CRSNG-FONCER, à l’AAHT des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et du FRQ-Santé, et au CPM du CRSNG ; grâce à une bourse du Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) et du Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Placentas ont été obtenus immédiatement après les accouchements vaginaux spontanés des grossesses sans complication au CHUM-Hôpital St-Luc, Montréal, QC, Canada, avec le consentement du patient éclairé et l&#39;approbation des comités d&#39;éthique (CHUM-Hôpital St-Luc et l&#39;INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada). 1. Isolement et purification de cellules Villous Cytotrophoblaste <ol><li> Solutions et médias <ol><li> Préparer les milieux de transport en le complétant de Dulbecco Modifié Moyen Haut-glucose (DMEM-HG) avec 1% vol / vol antibiotique (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) et magasin d&#39;Eagle à 4 ° C. </li><li> Préparer un milieu de culture primaire en complétant DMEM-HG avec 10% en volume / volume de sérum de fœtus bovin (FBS), 25 mM d&#39; acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% en volume / volume d&#39; antibiotiques (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) et conserver à 4 ° C. médias chauds à 37 ° C avantutilisation. </li><li> Préparer 4 L de solution saline (0,9% de chlorure de sodium en poids / vol). </li><li> Prepare modifié une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) en y ajoutant 25 mM de HEPES à 1x HBSS (pH 7,4). </li><li> Préparer une solution fraîche, quatre bouteilles de solution de digestion avec du HBSS modifiée (préparée 1.1.4), le sulfate de magnésium (MgSO 4), du chlorure de calcium (CaCl 2), la trypsine, la désoxyribonucléase IV (désoxyribonucléase IV) et 1% vol / vol antibiotique ( 10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) , comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Préparer gradient de densité de milieux de centrifugation <ol><li> Préparer la solution de support de centrifugation de densité en complétant les médias de centrifugation de densité avec 10% vol / vol HBSS 10x. </li><li> Préparer 14 des tubes à essai avec une solution de milieu de centrifugation de densité et HBSS modifiée, telle que décrite dans le tableau 2. </li><li> Mélanger chaque solution de densité (étape 1.1.6.2) vigoureusement avant d&#39;ajouter son contenu au gradient. Doucementajouter les solutions de densité dans un tube à centrifuger en verre de 50 ml avec une pompe péristaltique (1 ml / min), en commençant par la plus forte concentration (70%). Éviter des gouttelettes en drainant les solutions contre la paroi du tube pour maintenir la bonne séparation de chaque couche de gradient. <ol><li> En l&#39;absence d&#39;une pompe péristaltique, appliquer les couches très doucement avec des pipettes Pasteur. </li></ol></li></ol></li><li> Préparer finale tampon en cours d&#39;exécution en complétant le tampon en cours d&#39; exécution (voir le tableau des matériaux) avec 2% vol / vol antibiotique / antimycosique (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine). Conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> isolement cytotrophoblaste villeux Remarque: L&#39; utilisation stérile chirurgical équipement, verrerie, pipettes, flacons, etc. <ol><li> Le jour de l&#39;isolement du cytotrophoblaste villeux, dans un bain-marie à 37 °, de chauffer les solutions de digestions (étape 1.1.5) et 70 ml de FBS. Remarque: Utilisez 50 ml de FBS pour interrompre les digestions et larestante 20 ml pour l&#39;étape de congélation (1.2.22) qui peut être placé sur la glace une fois décongelé. </li><li> Après l&#39;accouchement, amener le placenta au laboratoire dans un milieu de transport glacé (de l&#39;étape 1.1.1) aussi rapidement que possible (moins de 1 h). </li><li> moyen de transport Jeter et le sang placentaire poubelle liquide. Peser le placenta et plonger dans une solution saline froide. </li><li> Mesurer et analyser les caractéristiques suivantes: longueur du cordon ombilical; localisation du cordon ombilical; longueur placentaire, la largeur, la forme (ovale, discoïde); la couleur de la membrane; des pathologies de la structure de cotylédons. Note: Les données sont présentées dans la section des résultats. </li><li> Couper le cordon ombilical aux côtés de son insertion placentaire (ie, à sa base avec un 1 cm cercle de rayon supplémentaire autour du cordon). Immerger dans 300 ml de solution de fixation de tissu histologique (formaline 10%) pour une analyse histologique ultérieure. </li><li> Couper le placenta entier en cubes de 5 x 5 x 5 cm. Laver à fond (4 fois x ~ 1 min) dans une solution saline solution (0,9%) pour éliminer les cellules de sang jusqu&#39;à ce que la solution saline est claire. Jeter le liquide de rinçage. </li><li> Dans un verre de montre, retirer les membranes placentaires et les tissus hachis pour enlever les vaisseaux sanguins et calcifications. Tenir les vaisseaux sanguins fermement avec une pince et retirer les tissus en utilisant le dos de ciseaux Metzenbaum. <ol><li> Placez le placenta émincé dans un entonnoir Büchner. Rinçage avec environ 100 ml de tampon salin. Continuer émincer jusqu&#39;au 30 - on obtient 35 g de tissu haché (plastique à usage bateau et balance). Si nécessaire, émincer le reste du placenta pour obtenir jusqu&#39;à trois 30 supplémentaires - 35 g préparations. Pendant ce temps, mettre le tissu émincé dans un bateau pesant sur la glace. Remarque: Cette étape dure environ 45 min à 1 h. </li></ol></li><li> Ajouter le 30 - 35 g de tissu placentaire haché dans un flacon de trypsinisation. Transfert 150 ml de la digestion préparée solution 1 (Tableau 1) dans le flacon de trypsinisation et bien mélanger. </li><li> Placer le ballon dans trypsinisationun bain-marie agitateur pendant 30 mn à une vitesse de pas plus de 50 cycles / min et mélanger manuellement le flacon trypsinisation toutes les 5 minutes pour la digestion homogène. </li><li> A la fin de la première digestion, enlever le ballon trypsinisation du bain d&#39;eau et de l&#39;incliner (45 ° C) pendant 1 min pour sédimenter le tissu placentaire. Avec un 10 ml pipette stérile, enlever et jeter environ 80 ml de surnageant. Éviter l&#39;aspiration du tissu. </li><li> Verser 100 ml d&#39; une solution de digestion 2 (tableau 1) dans le ballon de trypsinisation; bien mélanger et répéter l&#39;étape 1.2.9. </li><li> A la fin de la deuxième digestion, enlever le ballon trypsinisation du bain d&#39;eau et de l&#39;incliner à 45 ° C pendant 1 min. Avec une pipette de 10 ml stérile, enlever 80 ml de surnageant et le transfert en douceur vers un tube centrifuge avec un tamis cellulaire (100 um de maille). Transférer le surnageant filtré dans un bêcher contenant 2 ml de FBS à chaque fois que le tube de centrifugeuse est pleine. </li><li> Effectuer la troisième digestion comme décrit pour ladeuxième digestion (1.2.11 et 1.2.12) en utilisant 75 ml de solution de digestion 3. En parallèle, effectuez les étapes 1.2.15 à 1.2.16.1 pour la digestion 2. </li><li> Effectuer la quatrième digestion exactement comme la troisième digestion en utilisant la solution de digestion 4 (75 ml), mais collecter un maximum de surnageant. Effectuer les étapes 1.2.15 à 1.2.16.1 en parallèle pour la digestion 3, et enfin pour la digestion 4. </li><li> Aliquoter le surnageant (de digestions 2, 3 et 4) dans 13,5 ml parties, chaque partie en un seul 15 ml tube de centrifugeuse. Avec un 22,8 cm de long pipette Pasteur en verre, très doucement et placez lentement 1,5 ml de FBS au bas de chaque tube afin de créer une couche séparée. Ne pas mélanger FBS et surnageant. Centrifuger les tubes sans frein pendant 20 min à 1.250 xg à la température ambiante. Nota: Après la centrifugation, 4 couches sont visibles dans le tube, comme représenté sur la figure 1 La séparation des cellules à la trypsine et trophoblastiques évite la digestion cellulaire excessive.. </li><li> Avec une pompe à vide, aspirmangé et jeter le surnageant (solution de digestion) et des couches de FBS, y compris le film blanchâtre entre les deux couches. Remettre en suspension le culot (les trophoblastes et les couches de cellules sanguines rouges) avec 1 ml de milieu de culture cellulaire chaude (étape 1.1.2, sans FBS et non HEPES). <ol><li> Collecter les cellules remises en suspension de tous les tubes et les combiner dans 1 tube. Laissez le tube reposer à température ambiante jusqu&#39;à ce que la fin de toutes les digestions. Note: Après tous les digestions, le rendement habituel est de 3 tubes de cellules remises en suspension (un par digestion). </li></ol></li><li> Compléter le volume à 15 ml avec chaud milieu de culture cellulaire. Centrifuger à 1250 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant avec une pompe à vide. Évitez aspirer le culot. </li><li> Resuspendre doucement le culot obtenu à partir des 3 tubes avec 1 ml de chaleur du milieu de culture cellulaire. En commun leur contenu dans 1 tube. Pour obtenir 8 ml, compléter le volume avec chaud milieu de culture cellulaire. </li><li> Très couche doucement la suspension cellulaire sur un grad de séparationient avec une pipette Pasteur. Centrifugeuse sans frein pendant 30 min à 507 xg à la température ambiante. </li><li> Après centrifugation, identifier les différentes couches de cellules dans le gradient avec rétro-éclairage. Repérez les couches contenant trophoblaste et contaminantes cellules entre 40 - 50% du milieu de centrifugation de densité. Avec une pompe à vide, enlever les couches supérieures (&gt; 50%). </li><li> Recueillir les cellules situées dans les couches d&#39;intérêt à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur et les transférer dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Compléter le volume à 50 ml avec du milieu de culture cellulaire. Centrifuger pendant 10 min à 1.250 xg à la température ambiante. </li><li> Dans des conditions stériles, jeter le surnageant, resuspendre le culot avec 20 ml de FBS et de compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Sur la glace, ajouter 2,22 ml de diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) et mélanger doucement en retournant. Aliquote de 1,5 ml de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques, le gel pendant une nuit à -80 ° C et on transfère vers un réservoir d&#39;azote liquide. </li></ol></li> &lt;li&gt; Purification de Trophoblast <ol><li> Installez le rinçage et des tampons en cours d&#39;exécution et une nouvelle colonne de filtre sur l&#39;instrument de purification magnétique selon les instructions du fabricant. Effectuer le «programme de nettoyage&quot; pour nettoyer les ports négatifs 1, positif 1 et positive 2, puis introduire les tubes de 50 ml dans chaque port selon les instructions du fabricant. </li><li> Décongeler les cellules qui ont été gelés à l&#39;étape 1.2.22 rapidement dans un bain d&#39;eau C 37 °. Transfert des cellules à un tube de 50 ml et les cellules doucement avec 20 ml de solution tampon froide de resuspendre. Centrifuger le tube pendant 5 minutes à 450 xg et 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant. Répétez l&#39;étape de lavage avec un tampon froide. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre pour déterminer la viabilité. Répéter la centrifugation (5 min, 450 x g à 4 ° C). Retirez délicatement le surnageant. Ajouter 1 ml de tampon froid contenant 1 roulement% en volume / volume de souris d&#39; anticorps anti-HLA-ABC. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, mixing doucement toutes les 5 min. </li><li> Ajouter 6 ml de tampon courante froide. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et répéter cette étape. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon courante froide contenant 10% en volume / volume de billes magnétiques secondaires couplées à des anticorps anti-souris. Incuber à 4 ° C pendant 15 minutes, en mélangeant doucement toutes les 5 min. </li><li> Ajouter 6 ml de tampon courante froide. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de tampon courante froide. </li><li> Séparer les cellules trophoblastiques en utilisant l&#39;instrument de purification magnétique. Recueillir les cellules au port négatif et ajouter 20 ml de tampon courante froide. Nota: Les cellules du trophoblaste ne contiennent pas le complexe HLA-ABC, et sont ainsi séparées des autres types de cellules et dirigés vers le négatif 1 port. </li><li> Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre doucement les cellules dans 20 ml chaud milieu de culture primaire. Compter les cellules USINga hémocytomètre pour déterminer la viabilité. </li><li> Plaque les cellules à des densités suivantes: 0,15 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 96 puits, 1,6 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 24 puits et 4,5 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 6 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Confirmer la pureté des cellules trophoblastiques par cytométrie de flux 16,17 et / ou par immunocytochimie 18. Remarque: La pureté des cellules immunopurifiés a été déterminée en utilisant des anticorps monoclonaux conjugués à FITC contre-cytokératine 7 et 17 à 19 vimentine. Ce protocole est bien détaillé dans Lanoix et al., 2008 7. </li><li> Après au moins 4 heures, rincer les cellules deux fois avec un milieu de culture chaude pour éliminer les cellules seules et ensuite transférer les plaques à la chambre de normoxie, qui est composé de 8% O 2 (voir la figure 2 et à la section 2). </li></ol></li></ol> 2. in vitro induction de normoxie et hypoxie / réoxygénation <ol><li> Fonctionnement de la chambre de l&#39; incubateur (voir Figure 2A pour set-up). <ol><li> Dans une hotte à flux laminaire, placer une boîte de Pétri contenant de l&#39;eau stérile, au fond de la chambre de l&#39;incubateur pour éviter la sécheresse; puis placer les plaques ou flacons (étape 1.3.10) culture de cellules préalablement préparées sur les étagères supérieures de la chambre. </li><li> À l&#39; extérieur du capot, fixer la chambre (orifice d&#39; entrée) au tuyau de gaz (Figure 2A: 5a, b et c) pour atteindre le tube de gaz (8% d&#39; O 2 , soit 0,5% de O 2) (figure 2A: 7). Ouvrez les deux ports de la chambre d&#39;entrée et de sortie. A ce moment, le régulateur de gaz (Figure 2A: 4) doit rester fermé. </li><li> Ouvrir la vanne de régulation de gaz (Figure 2A: 4). Flush pendant 4 min avec un débit d&#39;air de 25 L / min pour remplacer complètement l&#39;air dans la chambre. </li><li> Après le rinçage de la chambre, fermer le régulateur de gaz, puis l&#39;entrée et ousports tlet de la chambre. </li><li> Débrancher le tuyau de sortie du débitmètre (figure 2A: 5c) de l&#39;orifice d&#39;entrée de la chambre et à mettre la chambre dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C. </li><li> Remplacer l&#39;air actuellement présent dans les assiettes, flacons et dissous dans le milieu de culture en remplissant la chambre avec le gaz 1 h après l&#39;étape 2.1.3. </li><li> Répéter les étapes 2.1.1 à 2.1.6 pour les autres compositions de gaz (par exemple, 2% d&#39; O 2 pour le premier trimestre de la grossesse trophoblaste culture 9). </li></ol></li><li> Confirmer le pourcentage d&#39;oxygène (figure 2B-C) <ol><li> Pour confirmer que la concentration d&#39;oxygène dans le milieu de culture cellulaire (sans cellules) à l&#39;intérieur de la chambre, en utilisant une électrode d&#39;oxygène relié à un adaptateur d&#39;oxygène. Connecter l&#39;électrode d&#39;oxygène à un voltmètre. </li><li> Créer une courbe d&#39;étalonnage dans la même solution ( par exemple, la culture cellulaire moyenne) en exposant la solution à gaz avec des teneurs en oxygène connues (par exemple, 0% et21% d&#39;oxygène). Une fois que les valeurs se stabilisent pour chaque concentration, d&#39;introduire l&#39;électrode dans le milieu dans la chambre. Remarque: Prenez toutes mesures à la même profondeur afin d&#39;éviter tout biais de la concentration en oxygène 10. </li></ol></li><li> Induction de normoxie et hypoxie / réoxygénation dans trophoblastes. <ol><li> Après avoir ajouté les cellules trophoblastiques primaires dans les flacons de culture cellulaire appropriés, des plaques ou des boîtes de Petri, effectuer des traitements selon les besoins. </li><li> En parallèle, à l&#39; intérieur de la chambre, exposer les cellules au mélange de gaz désiré pour reproduire une condition spécifique à chaque 24 heures (figure 3). </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Chez les mammifères, le développement du foetus est directement dépendante de la fonction placentaire adéquate. Les origines développementales des troubles de santé sont fondées sur l&#39;hypothèse que la cause des maladies qui se manifestent plus tard dans la vie peut être retracée au développement précoce et que le placenta a un rôle mécanique dans la programmation fœtale 30-32. Le placenta est le médiateur clé de la croissance et le développement du fœtus: il régule le transfert des nutriments, protège con...

Tout au long de la grossesse humaine, les cellules placentaires cytotrophoblaste, qui sont des cellules souches mononucléées, prolifèrent rapidement et se différencient en cellules soit de cytotrophoblaste villeux ou extravilleux. cytotrophoblastes extravillositaire envahissent et remodeler les artères spiralées de la paroi utérine. Cytotrophoblastes villeux, d&#39;autre part, continuent à proliférer, se différencient et fusionnent pour former syncytiotrophoblaste multinucléés (le syncytium) 1. Le maintien de l&#39;homéostasie villous trophoblaste est essentiel pour le bien-être du fœtus et la grossesse en bonne santé. En fait, trophoblaste villeux permettent l&#39;échange d&#39;oxygène et de nutriments materno-fœtale, et produisent des hormones essentielles pour la grossesse. Par ailleurs, le syncytiotrophoblaste est le seul type de cellule en contact direct avec la circulation sanguine maternelle et fournit une barrière physique et immunologiques essentielles. Par conséquent, le syncytiotrophoblaste doit subir l&#39;apoptose et de remplacement pour l&#39;entretien homéostatique et Avoid placentaire pathologies 2-5. La technique développée par Kliman et al. , 6 en 1986 pour isoler cytotrophoblastes villosités primaires de placentas humains a provoqué une révolution dans la recherche placentaire en permettant l&#39;étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation du trophoblaste villeux. Cette technique classique, sur la base des digestions enzymatiques séquentielles avec de la trypsine et de l&#39;ADNase, suivie d&#39;un isolement en milieu de centrifugation de densité (particules de silice colloïdale revêtue par de la polyvinylpyrrolidone ou de Percoll) est maintenant reconnu comme l&#39;étalon-or pour isoler des cellules du cytotrophoblaste villeux. La technique peut être optimisée par immunopurification magnétique, une procédure qui sépare cytotrophoblastes villeux des cellules non trophoblastiques basées sur l&#39;expression différentielle des antigènes spécifiques sur les surfaces de ces cellules. Nous avons choisi le leucocyte humain antigène ABC (HLA-ABC) en raison de l&#39;absence de son expression sur le Membran cellulaire trophoblastiquee 7,8. Le placenta est un organe qui subit des variations considérables dans les niveaux d&#39;oxygène au cours de la grossesse. Au cours du premier trimestre de la grossesse, le taux d&#39;oxygénation est physiologiquement très faible (2% d&#39; O 2) , mais augmente à des niveaux d&#39;oxygénation légers (8% O 2) dans le deuxième et le troisième trimestre de la grossesse. Tuuli et al. 9 décrit que la reproduction in vitro de l&#39;environnement à l&#39; intérieur du trophoblaste villosités placentaires est un défi et des variations dans les niveaux d&#39;oxygénation peuvent même conduire à des changements phénotypiques. Il est donc suggéré d&#39;adopter 8% d&#39; oxygène en normoxie pour imiter la tension d&#39;oxygène trouvé dans villosités placentaires au cours du troisième trimestre de la gestation 8,9. Chen et al. 10 longuement étudié plusieurs variables liées à la tension d&#39;oxygène dans la culture de cellules de trophoblaste et ont démontré l&#39;importance de la détermination des niveaux d&#39;oxygène dans un environnement péricellulaire. Les niveaux d&#39;oxygène dans les villosités tendent à accroîtreen raison de la vasculogenèse. Le flux sanguin dans les villosités placentaires augmente constamment et le niveau de peroxyde d&#39;hydrogène (une espèce d&#39;oxygène réactif abondant) est un signal important qui contrôle la vasculogenèse 11,12. Dans complications de la grossesse, un manque de vasculogenèse génère l&#39;hypoxie, et plus important encore, les variations intermittentes de l&#39;oxygénation (appelé hypoxie / réoxygénation). Ces conditions conduisent à une augmentation anormale du stress oxydatif, ce qui compromet la viabilité fœtale placentaire et 13,14. Les modifications que les cellules trophoblastiques subissent in vivo au cours des épisodes d&#39;hypoxie / réoxygénation peuvent être imitées in vitro comme suit: cytotrophoblastes villosités sont maintenues dans des conditions normoxiques (8% de O 2) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se différencient en syncytiotrophoblaste. Elles sont ensuite soumises à des conditions hypoxiques (0,5% O 2) pendant 4 heures, suivie d&#39;une 18 heure supplémentaire normoxie (réoxygénation). En utilisant cette approche hypoxie / réoxygénation, trophoblastes exHiBit déréglementé état ​​redox et des niveaux accrus d&#39;apoptose intrinsèque 8, comme cela a été observé dans certaines complications de la grossesse. Par conséquent, cela est un utile dans le modèle in vitro pour évaluer de nouvelles approches préventives et thérapeutiques pour lutter contre les complications de la grossesse associés à placentaire hypoxie / réoxygénation. Les cellules placentaires produisent la mélatonine, qui a plusieurs fonctions importantes telles que la capacité à prévenir le stress oxydatif et à un dysfonctionnement placentaire 15. Ici, nous présentons les modèles d&#39;approche et de cellules expérimentales utilisées pour démontrer les effets protecteurs de la mélatonine dans les cellules trophoblastiques placentaires au niveau moléculaire, cellulaire et fonctionnelle 8.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux incurvés Metzenbaum</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>matériel chirurgical (isolation cellulaire) (2 unités)</td></tr><tr><td>Pince à échardes fine 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>matériel chirurgical (isolation cellulaire) (2 unités)</td></tr><tr><td>Ciseaux 4.5 Str Dissection</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>matériel chirurgical (isolation cellulaire) (2 unités)</td></tr><tr><td>Éponge de gaze 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>Plat de cuisson en verre oblong</td><td>Verrerie</td><td>1105397</td><td>Pyrex (2,8 L)</td></tr><tr><td>Entonnoir Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Verrerie (114 mm de diamètre)</td></tr><tr><td>Verre de montre&nbsp ;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Verrerie</td></tr><tr><td>Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>solution fixatrice tissulaire histologique</td></tr><tr><td>Flacons trypsinisants</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>Verrerie (1 unité)</td></tr><tr><td>Tubes de culture jetables</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Verrerie</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté Pasteur Pipet (22,8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>verrerie</td></tr><tr><td>250 ml Béchers en verre</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>Glassware</td></tr><tr><td>Bouteilles en verre avec bouchon</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Glassware (8 unités)</td></tr><tr><td>Tube Corex de 50 ml&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 unité)</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger en polystyrène de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger en polystyrène</td><td>de 50 ml Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &mu ; m Nylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Absorbant</td><td>Liner Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp ; ml Bouteilles Filtre supérieur</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore : 0.22&nbsp ; et micro ; m / medium et HBSS préparation</td></tr><tr><td>2 ml Flacons criogéniques</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur de congélation, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 modèle</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau agitée</td><td>Fisher</td><td>modèle 127</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Solution saline 0,9 %</td></tr> <tr><td>Hank' s Solution saline tamponnée (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Quantité : 9,25 (un flacon) pour 1 L de solution de digestion</td></tr><tr><td>Acide hydroxypipérazinéthansulfonique (Hepes)</td><td><a name="GAMME ! B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) pour 1 L de solution de digestion</td></tr><tr><td>Trypsine de type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9 888 U</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase de type IV</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402 000</td></tr><tr><td>U Chlorure</td><td>de calcium Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine Sulfate</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Densité gradient de milieu de centrifugation. Contenance : 36 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr> Séparateur magnétique <tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Modèle 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp ; Colonnes&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fonctionnement Automacs&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Solution de rinçage Automacs&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Clone Purifié Hla Abc Anti-Humain W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>Anticorps anti-souris</td></tr><tr><td>Microbilles Igg</td><td>de souris Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr> Plaque à puits <tr><td>multiples -&nbsp ; 6 Puits Avec Couvercle</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Surface de liaison</td></tr><tr><td>cellulaire Plaque à puits multiples -&nbsp ; 24 Puits avec couvercle</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Surface de liaison</td></tr><tr><td>cellulaire Plaque à puits multiples -&nbsp ; 96 Puits avec couvercle</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Surface de liaison de cellule</td></tr><tr><td>Chambre d’incubation modulaire&nbsp ;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Un jeu de deux est nécessaire pour générer simultanément des conditions de normoxie et d’hypoxie/réoxygénation</td></tr><tr><td>Débitmètre unique</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Filtre en ligne</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, pores : 1.0 &micro ; m</td></tr><tr><td>Régulateur de gaz</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>Un ensemble de deux est nécessaire pour générer simultanément des conditions de normoxie et d’hypoxie/réoxygénation</td></tr><tr><td>Tuyau de gaz Classe Vi Clair 5/16&nbsp ;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 pièces avec ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Collier de serrage de tuyau de gaz réglable</td><td>Attaches</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Normoxia Cylindre&nbsp ;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Taille K (3rd Composition du trimestre : 5 % CO2, 8 % O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Normoxia Gas Cylinder&nbsp ;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Taille K (3rd Composition du trimestre : 5 % CO2, 0,5 % O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Microélectrode à oxygène Mi-730</td><td>Microélectrodes INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>Microélectrodes adaptateurs d’oxygène</td><td>INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>ROS Réactif de détection : CM-H2DCFDA&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-hCG Kit ELISAnbsp ;</td><td>DRG international</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps purifié anti-Vimentine</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Hôte : souris</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cytokératine 7 (FITC)&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Hôte : souris</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-mousse IgG H& Anticorps L</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

human trophoblast primaire culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l&#39;hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Ce protocole décrit comment les cellules cytotrophoblastes villeuses sont isolées à terme du placenta par digestions enzymatiques successives, suivies d’une centrifugation par densité, d’un isolement par gradient de milieu et d’une purification immunomagnétique. Comme observé in vivo, les cellules de cytotrophoblaste villeux mononucléées en culture primaire se différencient en cellules syncytiotrophoblastes multinucléées après 72 heures. Par rapport à la normoxie (8 %O2), les cellules cytotrophoblastes villeuses qui subissent une hypoxie/réoxygénation (0,5 % / 8 %O2) subissent un stress oxydatif accru et une apoptose intrinsèque, similaires à celles observées in vivo dans les complications de la grossesse telles que la prééclampsie, l’accouchement prématuré et le retard de croissance intra-utérin. Dans ce contexte, les trophoblastes villeux primaires cultivés dans des conditions d’hypoxie/réoxygénation représentent un système expérimental unique pour mieux comprendre les mécanismes et les voies de signalisation qui sont altérés dans le placenta humain et faciliter la recherche de médicaments efficaces qui protègent contre certains troubles de la grossesse. Les trophoblastes villeux humains produisent de la mélatonine et expriment ses enzymes et récepteurs synthétisants. La mélatonine a été suggérée comme traitement de la prééclampsie et du retard de croissance intra-utérin en raison de ses effets antioxydants protecteurs. Dans le modèle primaire de cellules cytotrophoblastes villeuses décrit dans cet article, la mélatonine n’a aucun effet sur les cellules trophoblastiques à l’état normoxique mais rétablit l’équilibre redox des cellules syncytiotrophoblastes perturbées par l’hypoxie/réoxygénation. Ainsi, les cellules trophoblastiques villeuses humaines en culture primaire constituent une excellente approche pour étudier les mécanismes à l’origine des effets protecteurs de la mélatonine sur la fonction placentaire pendant l’hypoxie/réoxygénation.

Isolement et immunopurification des cellules cytotrophoblaste villeux à partir d&#39; un placenta à terme normaux obtenus par voie vaginale ont donné 1 x 10 8 cellules viables. Le placenta pesait 350 g, était de 19 cm de diamètre, 4 cm de haut avec forme discoïde et membranes transparentes. Aucune cotylédons malformation n&#39;a été détectée. Le cordon ombilical avait localisation paracentral et une longueur de 56 cm. La pureté a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant...

Ce manuscrit présente un modèle in vitro unique de cellules cytotrophoblastes villositaires humaines immunopurifiées cultivées sous hypoxie/réoxygénation. Ce modèle est adapté pour étudier les effets protecteurs de traitements prometteurs, tels que la mélatonine, sur les complications de la grossesse associées à une augmentation du stress oxydatif et à une altération de la fonction placentaire.

Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l&#39;hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les effets protecteurs de la mélatonine à l'aide de cellules primaires humaines de cytotrophoblaste villositaire immuno-purifiées, cultivées en conditions d'hypoxie ou de réoxygénation. Cette méthode peut aider à comprendre les mécanismes et les voies de signalisation associés aux complications de la grossesse liées au placenta soumis à l'hypoxie et à la réoxygénation. Le principal avantage de cette technique est qu'elle convient à l'étude de traitements prometteurs, tels que la mélatonine, dans les troubles de la grossesse associés à un stress oxydatif accru.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés avec les étapes d'isolement des cytotrophoblastes villiques, telles que la mince découpe des tissus et la préparation du gradient médian pour la centrifugation de densité. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les trophoblastes du troisième trimestre, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme le placenta du premier trimester ou le placenta d'autres espèces. La démonstration visuelle de cette méthode est importante, car de nombreuses étapes sont difficiles

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Traditionnel, en deux dimensions techniques de culture cellulaire entraînent souvent des caractéristiques modifiées par rapport aux marqueurs de différenciation, de cytokines et de facteurs de croissance. Culture cellulaire en trois dimensions dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) rétablit l'expression de plusieurs de ces facteurs comme montré ici avec une lignée de cellules trophoblastiques extravilleux.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.

Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta

Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.

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Les effets distincts des différents degrés d’hypothermie sur la protection myocardique n’ont pas été soigneusement évalués. L’objectif de la présente étude était de quantifier les niveaux de mort cellulaire à la suite de différents traitements d’hypothermie dans un modèle humain à base de cardiomyocytes, jetant les bases d’une recherche moléculaire approfondie future.

Évaluation in vitro de la protection myocardique après hypothermie-préconditionnement dans un modèle de myocytes cardiaques humains

Cette étude vise à développer un nouveau modèle de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) qui empêche de compromettre l’intégrité rétinienne lors de la manipulation des explants. Ceci est réalisé en cultivant la rétine avec le vitré sous-jacent et le pigment rétinien sous-jacent épithélium-choroïde (RPE-choroïde) et la sclérotique.

Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine

Ici, nous décrivons un protocole in vitro pour modéliser les dommages hypoxiques/réoxygénations dans les cellules épithéliales tubulaires proximales très métaboliques. Ce modèle est conçu pour induire des lésions métaboliques induites par le stress, mesurées par l’expression de marqueurs de lésions des tubules proximaux et l’évaluation de la fonction respiratoire mitochondriale.

Modélisation de l’hypoxie/lésion par réoxygénation dans les cellules épithéliales tubulaires proximales

Les organoïdes cardiaques humains auto-assemblants (hCOs) sont un système émergent pour modéliser le développement et les maladies cardiaques humaines. Ici, une méthodologie pour générer et blesser les hCOs avec hypoxie-réoxygénation ainsi que des détails des résultats histologiques et fonctionnels attendus après une blessure sont fournis.

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Cultures embryonnaires de cellules rétiniennes chiches constituent des outils précieux pour l'étude de la biologie photorécepteur. Nous avons mis au point une technique de transfert de gène efficace sur la base de plasmide électroporation ex ovo de la rétine antérieure à la culture. Cette technique augmente considérablement les efficacités de transfection sur des protocoles actuellement disponibles, ce qui rend possible une manipulation génétique pour ce système.

Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un Ex-ovo Approche d'électroporation

Découvrez la culture de trophoblastes villosités humains primaires pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre le stress oxydatif induit par l'hypoxie-réoxygénation. Ce modèle in vitro aide à comprendre les complications de grossesse liées au placenta.

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Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l'hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

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