Name: Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et dautres pathologies liées à lâge ou les maladies métaboliques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Découvrez comment modéliser la rigidité de la membrane basale pour étudier le comportement cellulaire invasif dans le cancer de la prostate métastatique. Cette méthode combine chimie, physique et biologie pour reproduire les conditions tumorales.

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Nous remercions Simon Hayward (Centre médical de l’Université Vanderbilt) pour les cellules BPH-1 ; ainsi que Thomas Cox et Janine Erler (Centre de recherche et d’innovation en biotechnologie, Université de Copenhague) pour leur aide dans les mesures rhéologiques. MR-T a été financé par Worldwide Cancer Research, anciennement l’Association of International Cancer Research (subvention 08-0803 à JS), l’ambassade britannique à Montevideo et l’Agencia Nacional de Investigación e Innovación (UK_RH_2015_1_2 à MR-T). MC a été soutenu par Prostate Cancer UK (subvention S14-017 à JS et GS). KW a été financé par le China Scholarship Council. MAM a été financé par le Bureau culturel saoudien.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un protocole pour la génération d&#39;acini glandulaires 3D à partir de MECs dans des gels RBM purs 6 a été modifié dans une étude précédente par l&#39;addition de 4 mg / ml de type collagène à la matrice RBM. L&#39;addition de collagène a entraîné le module d&#39;élasticité du gel RBM passant de 175 ± 37 à 1589 ± 380 pascals. Cette augmentation de 9,1 fois la rigidité modulée de la croissance, la survie, la migration et la différenciation des MECs 21. Le protocole a été modifié à nouveau en incluant une étape de traitement avec la D - (-) - ribose pour favoriser la réticulation non-enzymatique du collagène de type I qui a été ajouté au gel GAR. L&#39;augmentation de 15 fois résultante de la rigidité a été trouvé à coopérer avec la transformation oncogénique de MECs pour promouvoir leur comportement invasif 22. L&#39;approche expérimentale de Type ajoutant collagène à des gels RBM facilite l&#39;interaction directe de MECs avec des fibres de collagène, ce qui ne se produit dans le tissu humain après la barrière physique entre le stromaet de l&#39;épithélium fourni par le BM subit une dégradation protéolytique. En générant acini glandulaires 3D à partir de Pécs en gels RBM purs pré-traités avec GLA, le protocole actuel ouvre la voie à étudier la façon dont BM rigidité en soi peut déclencher leur comportement invasif (Figure 3). Les niveaux de rigidité BM induites dans ce protocole ont une pertinence physiologique. L&#39; incubation avec mM GLA 50 pendant 6 h et 14 h respectivement augmenté les modules élastiques du gel FrP pur à 175 ± 90 et 322 ± 160 par rapport à 122 ± 55 Pascals dans des gels RBM traités avec du PBS (tableau 1). Cette augmentation de 1,7 à 3,2 fois la rigidité FrP récapitule le 2.5- à 3,4 fois-augmentation de la rigidité observée dans maligne par rapport à la prostate normale ou le tissu de BPH 23-26. Comme il est indiqué dans une publication récente 13 , les changements morphologiques induits par l&#39;accumulation d&#39;AGE et FrP raideur dans PEC acini peuvent être quantifiés pour un changement statistiquement significative par rapport arondée de forme polygonale, une diminution de luminal / zone acineuses totale, et les cellules en saillie qui migrent du acina dans le ÂGE riche RBM (Figure 3). Immunotransfert peut également être utilisé pour évaluer les marqueurs de EMT (par exemple perte de E-cadhérine 13) et le comportement contractile (par exemple , la lumière de la myosine phosphorylée chaîne 2, pMLC2 13) à Pécs cultivées dans des conditions normales par rapport à raide FrP (Figure 3). Une évaluation plus poussée en utilisant une coloration immunofluorescente et la microscopie confocale peut être utilisé pour visualiser le BM (par exemple , la laminine, le collagène IV et AGE accumulation 13), la polarité apicale à base cellulaire (par exemple la localisation apicale ROE1: antigène endosomique précoce 1 et GM130: 130 kDa cis-Golgi marqueur 13) et des modèles cellulaires de molécules d&#39;adhésion (par exemple E-cadhérine localisation aux jonctions cellule-cellule 13) (figure 3). <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3:. Vue d&#39; ensemble des différents protocoles présentés ici Le diagramme décrit comment préparer et raidir la membrane basale reconstituée (RBM) avec glycolaldéhyde (réaction de Maillard), comment semer des cellules sur le FrP raide, comment analyser l&#39;FrP rigide ( étendue de la réaction de Maillard) et des procédures qui peuvent être utilisées pour analyser les changements cellulaires et moléculaires induits par AGE riches RBM. AGE, produits de glycation avancée; BM, la membrane basale; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole; EEA1, antigène précoce endosomal 1; GAPDH, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase; GLA, glycolaldéhyde; GEE, l&#39;ester éthylique de la glycine; GM130, 130 kDa marqueurs cis-Golgi; chaîne légère 2 p-MLC2 (Thr18 / SER19), myosine phosphorylée sur des sites thréonine 18 et la sérine 19; RBM, membrane basale reconstituée; SDS-PAGE, électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium. Pour bar RWPE1 acini échelle = 10 pm; pour les cellules tumorales PC3sphéroïdes Barre d&#39;échelle = 100 um. Ce chiffre a été modifié par la référence 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Les étapes de dépannage seront nécessaires si D - (-) - ribose est choisi comme agent de réticulation pour RBM. Au cours de l&#39; élaboration du protocole , il a été constaté que le traitement avec 1 M de D - (-) - ribose pendant 72 heures, comme décrit précédemment pour les gels RBM / 22 de collagène, conduit à la déshydratation et le retrait des gels GAR. L&#39;évaluation des concentrations plus faibles de D - (-) - ribose de courte durée de traitement peut aider à surmonter cette limitation. Une limitation potentielle dans des applications futures du protocole pourrait être rencontré où des niveaux plus élevés de la GAR rigidité sont souhaitées. Si de plus longues durées d&#39;incubation et des concentrations plus élevées de GLA sont utilisées pour induire des niveaux plus élevés de rigidité de gel FrP il sera nécessaire de<html> déterminer si les conditions de traitement ont un impact sur ​​la survie et la prolifération cellulaire, comme décrit précédemment 13. Il convient également de noter que l&#39;incubation des cellules RWPE-1 avec du sérum provoque une transition EMT analogue phénotypiques et l&#39;exposition à du sérum ou des matériaux contenant du sérum doit être évitée. Par exemple, si des expériences impliquent la transfection de petits ARN interférents (siARN) oligonucléotides, la procédure doit être optimisée en utilisant des cellules RWPE-1 cultivées en KSFM, sans changer les cellules à faible milieu de transfection de sérum. Cet inconvénient pourrait compromettre le niveau de silençage génique réalisé lors de l&#39;utilisation de siRNA transitoire approches dans le modèle. Pour certaines protéines cibles, il serait conseillé d&#39;employer des vecteurs inductibles shRNA pour le silençage génique accordable et la diminution souhaitée des taux de protéines. Adaptations qui incorporent la réticulation enzymatique par des cellules stromales ou de cellules tumorales associées lysyl oxydase (LOX) 17 peuvent également être incorporés dans les futurs modèles. jove_content &quot;&gt; Ce protocole facilitera la future étude des mécanismes pro-invasives déclenchées par AGE-dépendante BM raideur dans Pécs (RWPE-1, BPH-1) et l&#39;évaluation des cibles anti-métastatiques dans PTCs envahissantes (PC3). Étant donné que l&#39;HBP est considéré comme un trouble métabolique 27, ce protocole ouvre également la voie à l&#39; amélioration de notre compréhension du lien entre les troubles métaboliques et un risque accru de cancer de la prostate. Étant donné que BM rigidité induite par son exposition aux AGEs peut être un déclencheur pour invasivité dans d&#39; autres cancers types, il sera intéressant d&#39;utiliser le protocole à mettre en place des modèles similaires qui intègrent des cellules épithéliales normales et les cellules tumorales d&#39;autres organes (par exemple , du sein, du côlon, des ovaires, du pancréas). Les étapes critiques au sein du protocole, ainsi que leurs horaires, sont résumés dans la figure 4. Au cours de l&#39;étape initiale , il est essentiel de maintenir la solution mère de la GAR à 4 ° C alors qu&#39;il dégèle pour empêcher sa polymerization. Pointes de pipettes ne doivent pas être placés dans la solution rM des stocks jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient été refroidi à 4 ° C. Pour l&#39;étape suivante, il est également important d&#39;assurer que les diapositives de chambre ont équilibré à 4 ° C avant d&#39;être revêtus de la solution RBM. Dès que la température de la solution GAR est augmentée au-dessus de 4 ° C, il va subir une polymérisation irréversible pour former un gel. Il est essentiel que ces mécanismes ne soit pas perturbé pendant l&#39;étape de polymérisation pour s&#39;assurer qu&#39;il forme une surface plane appropriée pour la culture cellulaire et l&#39;analyse microscopique. La durée d&#39;incubation avec GLA avec ou sans inhibiteurs de la réaction de Maillard (de cyanoborohydrure de sodium et amingoguanidine) déterminera la raideur du gel FrP devient. Il est recommandé d&#39;utiliser une incubation de 6 h avec GLA si les conditions semi-rigides sont nécessaires, et 14 heures d&#39; incubation , si les conditions rigides sont nécessaires (tableau 1). Autres temps d&#39;incubation ou concentrations de GLA peuvent être utilisées si différents niveauxde la rigidité sont souhaitées. Dans ce cas, l&#39;analyse rhéologique des gels RBM doivent être incorporés comme une étape essentielle. Après l&#39;étape de trempe de la réaction de Maillard par incubation avec GEE et les étapes ultérieures de lavage avec du PBS, les gels GAR peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 48 heures avant leur utilisation pour la culture cellulaire. Une fois que les cultures cellulaires sont mis en place, il est important de changer le milieu de culture (y compris les traitements), tous les deux jours. Il est recommandé de maintenir les cultures de cellules 3D pendant 3-12 jours en fonction des paramètres étudiés. Pour la 3D PEC Acini il est recommandé d&#39;analyser les cultures au bout de 6 jours, et 3D PTC sphéroïdes analyse est recommandée après 3 jours de culture en première instance. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figure 4:. Simple Aperçu du protocole avec les étapes et les synchronisations critiques Indiqué Le flow diagramme montre comment préparer et raidir la membrane basale reconstituée (RBM) avec glycolaldéhyde (réaction de Maillard) avec des étapes critiques et les horaires indiqués. Points où le protocole peut être arrêté, et les gels RBM stockés, sont également indiqués. RBM, membrane basale reconstituée; GLA, glycolaldéhyde; GEE, l&#39;ester éthylique de la glycine; ON, durant la nuit; PBS, solution saline tamponnée phosphate; RT, la température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La membrane basale (BM) est une feuille de matrice extracellulaire (ECM) spécialisée qui maintient des frontières tissulaires stables en séparant les couches de cellules épithéliales du stroma1. La réticulation covalente entre les trois hélices adjacentes de collagène IV dans le BM stabilise leur association latérale en établissant un réseau irrégulier d’hélices super-torsadées2. Ces réseaux IV de collagène agissent comme un échafaudage pour son interaction avec la laminine et d’autres composants BM1. La disposition structurelle du BM lui confère la résistance mécanique et la rigidité nécessaires au développement normal des épithéliums glandulaires3. 
Au cours du vieillissement et de la maladie, la BM s’épaissit et se raidit progressivement3,4. Par exemple, une multiplication par 3 du module d’élasticité (E) de la BM oculaire se produit entre 50 et 80 ans dans la population normale, et ce raidissement est encore exacerbé dans les troubles métaboliques comme le diabète5. Les changements structurels et biomécaniques de la BM qui entraînent une rigidité accrue se produisent lorsque ses composants ECM, le collagène IV et la laminine, deviennent réticulés de manière non enzymatique après leur exposition à des produits finaux de glycation avancée (AGE).
Le but de la méthode décrite ici était d’établir un modèle pour l’étude de la façon dont la rigidité de la BM, due à l’exposition à l’AGE, favorise l’invasivité des cellules épithéliales de la prostate (PEC) et des cellules tumorales de la prostate (PTC) dans le contexte du passage au cancer de la prostate métastatique (PCa). Pour ce faire, une méthode précédente utilisée pour générer des acini glandulaires 3D à partir de cellules épithéliales mammaires (CEM) dans des gels rBMreconstitués 6 a été adaptée pour inclure une étape supplémentaire où les gels rBM sont prétraités avec du glycolaldéhyde (GLA). Plusieurs techniques d’évaluation de la réticulation et du raidissement induits par le GLA des gels rBM prétraités sont décrites, notamment l’analyse photométrique, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS PAGE), la microscopie confocale et l’analyse rhéométrique. Les types de cellules prostatiques sélectionnés pour la culture sur la rBM pré-rigidifiée comprennent : RWPE-1, CEE dérivées d’une prostate normale7 ; BPH-1, CEE dérivées d’une glande prostatique affectée par l’HBP8 ; et PC3, des PTC métastatiques dérivées d’une tumeur secondaire située dans l’os vertébral d’un patient atteint d’un cancer de la prostate (PCa)9. 
En plus de faire progresser l’étude de la pathologie de la glande prostatique, le protocole de raidissement des gels de BM par leur traitement avec du GLA peut être adapté pour étudier comment la rigidité de la BM contribue à d’autres pathologies liées à l’âge et à des troubles métaboliques. Par exemple, le modèle peut être directement appliqué pour étudier comment le cancer métastatique est induit par la rigidité de la BM dans des organes tels que le sein, le côlon, l’ovaire et le pancréas par l’incorporation de types de cellules appropriés. De plus, le protocole peut être adapté pour étudier comment la rigidité corporelle favorise les mécanismes biomécaniques de progression de la maladie dans les maladies microvasculaires liées au diabète, la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie.

<table><tbody><tr><td>I - Matériel pour la culture monocouche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP Cell Line Database</td><td>PCaCL-132</td><td>Contact : simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Milieu complet sans sérum de kératinocytes&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>Ne pas chauffer à 37 &ordm ; C avant l’utilisation</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Magasin à -20 &ordm ; C dans les aliquotes</td></tr><tr><td>PC3&nbsp ;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de phosphate salin (Dulbecco A) comprimés</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>chaud en 37 &ordm ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp ;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>II - Matériel pour la culture 3D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’aminoguanidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau</td></tr><tr><td>Lames de chambre, 8 puits&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Matrice de culture Extrait de facteur de croissance réduit à membrane basale reconstituée (rBM)&nbsp ;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Store Membrane basale (BM) à -80 &ordm ; C dans aliquotes Bromure de</td></tr><tr><td>cyanogène&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Toxique par contact cutané et par inhalation</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’ester éthylique glycine (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Irritant pour les yeux</td></tr><tr><td>Dimère de glycolaldéhyde (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoborohydrure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Hautement inflammable ; Toxique par contact cutané et par inhalation</td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0,22 microns</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>III - Matériel pour quantifier la réaction de Maillard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>sensible à la lumière et se conserve à -20 &ordm ; C en aliquotes</td></tr><tr><td>Cylindres de clonage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>photosensible</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>sensible à la lumière</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Stocker à -20 &ordm ; C en aliquotes</td></tr><tr><td>Supports de montage Vectashield&nbsp ;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Magasin à -20 &ordm ; C dans aliquotes</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal IV anti-collagène humain de lapin&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Anticorps Acris</td><td>R1041</td><td>Se conservent à -20 &ordm ; C dans aliquotes</td></tr><tr><td>Lapin anti-laminine A/C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Stocker à -20 &ordm ; C en aliquotes</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol tert-octylphényléther (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de dialyse Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>IV - Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 rhéomètre rotationnel à déformation contrôlée</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100 (grossissement 20X) microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr> Chambre <tr><td>d’incubation humidifiée contrôlée au CO2 pour microscope Zeiss Axio S100</td>Microscope confocal <td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M (grossissement 40X, 63X)</td> Microscope <td>Zeiss</td> Olympus LH50A équipé d’un <td></td><td></td></tr><tr><td>appareil photo numérique utilisant le contraste de phase.</td><td>Olympe&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre à lecteur de plaques PHERAstar Plus</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>V - Logiciel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>Institut national de la santé, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr>: <td>Services moléculaires</td><td></td><td></td> <td>MetaXpress</td></tr></tbody></table>

comment étudier la membrane basale rigidité comme biophysical trigger dans le cancer de la prostate et d&#39;autres pathologies liées à l&#39;âge ou les maladies métaboliques

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour étudier le microenvironnement biophysiques liés à l&#39; augmentation de l&#39; épaisseur et la rigidité de la membrane basale (BM) au cours de pathologies liées à l&#39; âge et les troubles métaboliques (par exemple , le cancer, le diabète, la maladie microvasculaire, la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie) . La prémisse du modèle est la réticulation non enzymatique de la matrice BM reconstituée (RBM) par traitement avec glycolaldéhyde (GLA) pour promouvoir avancée glycation produit final (AGE) génération par la réaction de Maillard. Des exemples de techniques de laboratoire qui peuvent être utilisés pour confirmer la production d&#39;AGE, réticulation non enzymatique et une rigidité accrue dans GLA traitées FrP sont décrites. Ceux-ci comprennent la préparation de la GAR native (traitée avec un tampon phosphate salin, PBS) et raide RBM (traité avec GLA) pour la détermination de: sa teneur en AGE par analyse photométrique et de la microscopie par immunofluorescence, sa réticulation non enzymatique par le sulfate de dodécyle sodium polyacrylamideune électrophorèse sur gel (SDS PAGE), ainsi que la microscopie confocale, et sa rigidité augmentée à l&#39;aide rhéométrie. La procédure décrite ici peut être utilisée pour augmenter la rigidité (module élastique, E) de la GAR jusqu&#39;à 3,2 fois, en accord avec les mesures effectuées en bonne santé par rapport à un tissu malade de la prostate humaine. Pour recréer le microenvironnement biophysique associé au vieillissement et de la prostate malade glande trois types de cellules de la prostate ont été introduites sur FrP native et raide RBM: RWPE-1, les cellules épithéliales de la prostate (CBV) provenant d&#39;une glande de la prostate normale; BPH-1, Pecs dérivés d&#39;une glande de la prostate affectée par l&#39;hyperplasie bénigne de la prostate (HBP); et PC3, des cellules métastatiques dérivées d&#39;une tumeur osseuse secondaire provenant d&#39;un cancer de la prostate. Plusieurs paramètres peuvent être mesurés, y compris la taille, la forme et les caractéristiques invasives du acini glandulaires 3D formé par RWPE-1 et BPH-1 sur native par rapport raide FrP, et la longueur moyenne des cellules, la vitesse de migration et de la persistance du mouvement des cellules de Spher 3DOID formés par des cellules PC3 dans les mêmes conditions. voies et la localisation subcellulaire des protéines de signalisation cellulaire peut également être évaluée.

3D Prostate Acini Cultured sur Stiff FrP Après 6 jours de culture, PECs dérivées d&#39; un tissu normal de la prostate (RWPE-1) (figure 1A) et le tissu de BPH (HBP-1) (figure 1B) forme acini sur native (PBS traité) FrP qui sont organisés en sphéroïdes uniformes épithéliales cellules. Ces acini ont aussi les caractéristiques de PECs hautement organisées avec apical à base de polarité et un luminal visible l&#39; espace 13,20. Le acini formé par PECs dérivées de tissus de la prostate normale (RWPE-1) (figure 1A) et le tissu de BPH (HBP-1) (figure 1B) sur raidi RBM (AGE-riche) (traité avec GLA) ont une architecture perturbée (décalage de sphéroïde à forme polygonale et les cellules en saillie / migration de l&#39;acini dans l&#39;AGE riche RBM) (figure 1A). Ces<html> acini sont également caractérisés par PECs très désorganisés qui ont perdu leur polarité apicale à base d&#39;une petite ou inexistante espace luminal 13. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figure 1:. Les cellules de la prostate épithéliales Grown comme 3D glandulaire Acini sur autochtone et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) (A) images fond clair de RWPE-1 des cellules cultivées pendant 12 heures jusqu&#39;à 6 jours sur des gels RBM traités avec du PBS (native) ou 50 mM glycolaldéhyde pendant 14 heures (AGE-riche, raide); Barre d&#39;échelle = 50 pm. (B) HBP-1 cellules, cultivées comme décrit dans la partie A; Barres d&#39;échelle = 50 pm; données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> Tableau 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tableau 1:. Caractéristiques de la prostate épithéliale RWPE-1 acini Cultivé sur Native, semi-rigide et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) RWPE-1 acini ont été cultivées sur FrP pré-traitée avec du PBS pendant 14 heures (native), glycolaldéhyde (GLA ) pendant 6 h (semi-rigide) ou GLA pendant 14 heures (raide). Pour la forme acineuses, le pourcentage (%) ± écart-type (SD) du tour, acini semi-polygonale et polygonale ont été calculées à partir de 5 expériences indépendantes (50 acini quantifiées par condition). Taille acineuses relative a été calculée (natif FrP = 100%) à partir de 3 expériences indépendantes. Pour invasivité,% ± écart-type acini avec une ou plusieurs cellules en saillie ont été calculées à partir de 3 expériences indépendantes. Fold changement est calculé en divisant la valeur moyenne obtenue dans des conditions de semi-rigides ou rigides par la valeur correspondante pour les conditions natives. Les valeurs de P calculées en utilisant le test t de Student (α = 0,05). ontenu &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE dépend plus de rigidité FrP favorise PC3 la prostate migration des cellules tumorales Cellules PC3 cultivées sur natif FrP migrent en maintenant un contact continu de cellule à cellule, tandis que les cellules PC3 cultivées sur AGE riche (raide) FrP se déplacent indépendamment les uns des autres (figure 2A). Après 72 h en culture des cellules PC3 forment des foyers (sphéroïdes) sur natif (PBS traité) FrP, tandis que les cellules PC3 sur rigide (AGE-riche) FrP ne le font pas de sphéroïdes et migrent indépendamment (figure 2B). Cellules PC3 sur rigide (AGE-riche) FrP sont plus allongées que les cellules PC3 cultivées sur FrP native (figure 2C). Cellules PC3 sur raide FrP migrent plus rapidement que les cellules PC3 cultivées sur FrP native (figure 2D). Cellules PC3 sur raides FrP affichent une diminution de la persistance par rapport aux cellules PC3 cultivées sur FrP native (Figure 2F). <img alt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2:. Prostate Migration des cellules tumorales sur les autochtones et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) (A) images fond clair de cellules PC3 cultivées sur des gels RBM traités avec du PBS (native) ou 50 mM glycolaldéhyde pendant 14 heures (AGE-riche, raide) . Les cellules ont été imagées en utilisant un microscope à fond clair (objectif 10X) et un taux d&#39;acquisition de 1 image par heure pendant 12 heures suivie de suivi pour générer des trajectoires cellule. Les images présentées correspondent aux points de temps après 0, 3, 6, 9 et 12 heures. Trajectoires de cellules uniques sont présentées pour le point de temps de 12 heures. Barre d&#39;échelle = 100 um. Cellules (B) PC3 cultivées sur FrP native ou raide pendant 72 heures, et imagés comme décrit dans le panneau (A). Barre d&#39;échelle = 100 um. Détail montre la zone sélectionnée à 2X grossissement. (C) moyenne ± SD longueur de la cellule (um); différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) moyenne ± vitesse (um / h) calculée à partir de trajectoires de cellules; différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 0,004). (E) moyenne ± persistance du mouvement cellulaire (rapport D / T, où D = distance du début à la fin de la trajectoire de la cellule, T = longueur totale de la trajectoire de la cellule); différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 0,0007). Pour les panneaux CE&gt; 10 cellules ont été analysées, les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous expliquons ici un protocole pour la modélisation du micro-environnement biophysique où la réticulation et une plus grande rigidité de la membrane basale (BM) induite par les produits de glycation avancée (AGE) ont une pertinence pathologique.

Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et d&#39;autres pathologies liées à l&#39;âge ou les maladies métaboliques

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

L'objectif général de ce modèle est d'étudier comment la rigidité et l'épaisseur de la membrane basale, dues à une exposition avancée aux produits de glycation, peuvent moduler le comportement invasif des cellules correspondant aux stades précoces et avancés du cancer de la prostate métastatique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des pathologies liées à l'âge, telles que la manière dont l'augmentation de la rigidité et de l'épaisseur de la membrane basale contribue à la progression du cancer, ainsi qu'à des troubles métaboliques comme le diabète.L'avantage principal de cette technique est qu'elle fournit une méthode simple pour imiter le degré de rigidité mesuré dans les tumeurs prostatiques humaines en milieu clinique. L'implication de cette technique s'étend à notre traitement et diagnostic du cancer de la prostate en améliorant notre compréhension de la manière dont la rigidité de la membrane basale favorise des changements moléculaires et cellulaires. Les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car le modèle est pluridisciplinaire.Association de techniques issues des domaines de la chimie, de la physique et de la biologie. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons émis l'hypothèse que la rigidité de la membrane basale dans la glande prostatique pouvait favoriser un comportement invasif de novo chez des cellules épithéliales transformées connues. Une démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car les étapes interdisciplinaires doivent être décrites.Inclure la réticulation de la membrane basale, suivie d'une culture cellulaire en 3D. Commencez par préparer une surface plane de glace et utilisez-la pour refroidir une lame en verre à huit puits à quatre degrés Celsius. Ensuite, coupez l'extrémité d'une pipette de 200 microlitres et refroidissez également cette extrémité à quatre degrés Celsius.Une fois refroidi, placer l'embout sur une pipette de 200 microlitres. Puis l'utiliser pour transférer 40 microlitres de solution matricielle BM glacée dans chaque puits de la lamelle-chambre en verre huit puits prérefroidie. Ensuite, placer la lamelle-chambre à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de favoriser la polymérisation de la membrane basale.Fermer très soigneusement la porte de l’incubateur afin d’éviter de perturber la membrane basale reconstituée liquide. Après exactement 30 minutes, ajouter 250 microlitres d’une solution préparée de glycolaldéhyde pour recouvrir la membrane basale reconstituée polymérisée. Ensuite, préparer un témoin négatif en ajoutant 250 microlitres de PDS stérile à un gel de membrane basale reconstituée native.Préparez également deux contrôles supplémentaires en ajoutant soit du cyanoborohydrure de sodium à 50 millimolaire, soit de l’aminoguanidine à 250 millimolaire à la solution de glycolaldéhyde avant de l’ajouter au gel de membrane basale. Incubez ensuite les gels à 37 degrés Celsius pendant six heures pour obtenir un gel semi-rigide, ou pendant 14 heures pour obtenir un gel rigide.Après l'incubation, retirez soigneusement les solutions des gels et ajoutez 250 microlitres d'ester éthylique de glycine à un molaire dans chaque gel. Incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez chaque gel 10 fois dans 500 microlitres de PBS afin d'éliminer toute trace de la solution de glycolaldéhyde et de l'ester éthylique de glycine.Ensuite, ajouter 400 microlitres de PBS pour éviter la déshydratation et incuber les gels de membrane basale reconstitués toute la nuit à 37 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à poursuivre, retirer le PBS des gels de membrane basale reconstitués, puis ajouter 250 microlitres d'eau glacée et doublement distillée dans chaque puits. Incuber les gels à quatre degrés Celsius pendant 16 à 24 heures afin de s'assurer que la matrice est complètement liquéfiée.Ensuite, transférez la membrane basale liquéfiée dans un tube de 1,5 millilitre et mesurez l'émission fluorescente de la solution à l'aide d'un spectrophotomètre. Puis centrifugez la solution et retirez le surnageant obtenu. Resuspendez le culot dans 500 microlitres d'une solution contenant 20 milligrammes par millilitre de bromure de cyanogène et 70 % d'acide formique.Incuber les échantillons toute la nuit à température ambiante. Ensuite, utiliser une seringue jetable d'un millilitre pour transférer le gel de membrane basale remis en suspension dans une cassette de dialyse ayant une coupure de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons. Plonger la cassette dans un bécher en verre de 500 millilitres contenant 500 millilitres d'eau doublement distillée.Et agiter l'eau avec un barreau magnétique. Laisser ce montage toute la nuit à quatre degrés Celsius pour éliminer toutes les traces de bromure de cyanogène et d'acide formique. Utiliser une seringue jetable d'un millilitre pour transférer la solution dialysée de la cassette dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, analyser la solution en la faisant migrer sur un gel de polyacrylamide à 12 %. Colorer le gel avec une coloration argent pour visualiser le profil électrophorétique des peptides matriciels obtenus par clivage au bromure de cyanogène. À partir des gels de membrane basale recouverts de PBS, rincer les gels deux fois supplémentaires avec 300 microlitres de PBS contenant 0,1 millimole de chlorure de calcium.Et 0,5 millimole de chlorure de magnésium. Pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, éliminer le PBS et ajouter 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pour recouvrir chaque gel de membrane basale reconstituée.Incuber les gels pendant 30 minutes à température ambiante afin de fixer les composants de la membrane basale reconstituée. Ensuite, éliminer le fixateur et ajouter 300 microlitres d'une solution de blocage contenant 75 millimoles de chlorure d'ammonium et 0,5 millimole de chlorure de magnésium. Incuber la solution pendant cinq minutes à température ambiante, puis éliminer la solution et répéter le rinçage quatre fois supplémentaires.Après le rinçage final, ajouter 300 microlitres de tampon d'immunofluorescence aux gels de membrane basale reconstitués afin de prévenir les réactions non spécifiques. Incuber les gels dans la solution pendant deux heures à température ambiante sur une plateforme agitée. Puis, retirer le tampon bloquant d'immunofluorescence.Ajouter 300 microlitres d'anticorps primaire dilué dans le tampon de blocage. Incuber les gels de membrane basale reconstitués à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Le jour suivant, retirer l'anticorps primaire et laver les gels trois fois avec 300 microlitres de tampon d'immunofluorescence.Agiter les gels à température ambiante sur une plateforme agitée pendant 10 minutes après chaque ajout de tampon. Ensuite, retirer le tampon et ajouter 300 microlitres d'anticorps secondaire marqué de manière fluorescente, dilué dans le tampon de blocage. Placer les échantillons sur une plateforme agitée et incuber les gels pendant deux heures à température ambiante.Éliminer l'anticorps secondaire. Rincer l'échantillon dans un tampon d'immunofluorescence, puis dans du PBS, et fixer ainsi que bloquer les échantillons une deuxième fois. Enfin, monter les gels et utiliser un microscope pour analyser la formation de faisceaux denses.Pour former des acini de glande prostatique, diluer 5&nbsp;000 cellules RWPE-1 dans 300 microlitres de KSFM complet, supplémenté avec 2&nbsp;% de la solution de membrane basale. Pour les agrégats de cellules tumorales prostatiques, diluer 2&nbsp;500 cellules PC3 dans 300 microlitres de milieu de culture RPMI-1640, supplémenté avec 2&nbsp;% de la solution de membrane basale. Après une incubation nocturne des gels de membrane basale reconstitués dans du PBS, rincer deux fois avec 500 microlitres de milieu de culture.Avant de semer les cellules. Sémez délicatement les cellules sur les membranes basales reconstituées natives et rigidifiées par les produits finaux de glycation avancée. Puis placez soigneusement les cultures dans un incubateur afin d'assurer une répartition uniforme des acini et des sphéroïdes en croissance.Pour les cellules formant des acini, changer le milieu tous les deux jours avec du milieu de culture frais contenant 2 % de la solution de membrane basale. Cela permet de s'assurer que les cellules disposent des facteurs de croissance nécessaires à l'homéostasie normale des acini. Après six jours en culture, les cellules épithéliales prostatiques forment des acini sur la membrane basale reconstituée native.Et sont organisés en sphéroïdes uniformes de cellules épithéliales. Ces acini présentent également les caractéristiques de cellules épithéliales polarisées hautement organisées, avec une polarité apico-basale et un espace luminal visible. Lorsqu'elles sont cultivées pendant six jours sur la membrane rigidifiée, les cellules présentent une architecture perturbée.Et changent de forme, passant de sphéroïdales à polygonales. De plus, ces acini sont fortement désorganisés et ont perdu leur polarité apico-basale, avec un espace luminal petit ou inexistant.Cela est également vrai pour les cellules provenant d'une glande prostatique affectée par une hyperplasie bénigne de la prostate. Lorsque la longueur des cellules tumorales prostatiques a été mesurée, celles-ci se sont révélées plus allongées sur la membrane basale réconstituée rigide, et présentaient également une migration plus rapide ainsi qu'une persistance cellulaire accrue. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de modéliser les effets de la rigidité de la membrane basale sur le comportement des cellules épithéliales et tumorales.Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler que le degré souhaité de rigidité de la membrane basale est induit et que les acini individuels ou les s-sphéroïdes sont correctement formés. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de l'oncologie d'étudier l'induction de l'invasion des cellules cancéreuses par la rigidité de la membrane basale dans la glande prostatique. À la suite de ce protocole, d'autres méthodes, comme le immunoblotting d'un lysat cellulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives aux voies de signalisation modulées par la rigidité de la membrane basale.N'oubliez pas que le travail avec le cyanoborohydrure de sodium, le bromure de cyanogène et l'acide formique peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'une blouse de laboratoire, de gants, d'un écran facial et d'un respirateur doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure dans une hotte aspirante.

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Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour mesurer la rigidité cellulaire. Le principe général de cette approche consiste à mesurer déformation de la membrane en réponse à bien défini pression négative appliquée par le biais d'une micropipette à la surface cellulaire. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier les propriétés biomécaniques du substrat-jointes cellules.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D.

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

Nous présentons des protocoles détaillés pour l’isolement des aortes de la souris et la mesure de leur module d’élasticité à l’aide de la microscopie à force atomique.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Présenté ici est le protocole de la technique Conpokal, qui combine la microscopie confoccale et de force atomique en une seule plate-forme d’instrument. Conpokal fournit la même cellule, la même région, l’imagerie confocale presque simultanée et la caractérisation mécanique des échantillons biologiques vivants.

À proximité de Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Nous avons récemment identifié le raidissement capillaire rétinien comme un nouveau paradigme pour le dysfonctionnement rétinien associé au diabète. Ce protocole détaille les étapes d’isolement des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à partir de cultures endothéliales rétiniennes, suivi d’une description de la technique de mesure de la rigidité par microscopie à force atomique.

Isolement de capillaires rétiniens de souris et de matrice sous-endothéliale pour la mesure de la rigidité à l’aide de la microscopie à force atomique

Ce protocole visualise comment préparer des cryosections de tissu pulmonaire murin, effectuer des expériences de carte de force de microscopie à force atomique et analyser les données pour déterminer le module de Young de la membrane basale pulmonaire murine native.

Extraction du module de Young des membranes basales pulmonaires murines natives à partir de cartes de force dérivées de la microscopie à force atomique

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

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Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et dautres pathologies liées à lâge ou les maladies métaboliques (Vidéo) | JoVE Journal

Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et d'autres pathologies liées à l'âge ou les maladies métaboliques

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