Comment étudier la membrane basale Rigidité comme Biophysical Trigger dans le cancer de la prostate et d'autres pathologies liées à l'âge ou les maladies métaboliques

L’objectif global de ce modèle est d’étudier comment la rigidité et l’épaisseur de la membrane basale, dues à la glycation avancée et à l’exposition au produit, peuvent moduler le comportement cellulaire invasif correspondant aux stades précoces et avancés du cancer de la prostate métastatique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des pathologies liées à l’âge. Par exemple, l’augmentation de la rigidité et de l’épaisseur de la membrane basale contribue à la progression du cancer, ainsi qu’aux troubles métaboliques comme le diabète.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode simple pour imiter le niveau de rigidité mesuré dans les tumeurs de la prostate humaine en milieu clinique. L’implication de cette technique s’étend à notre traitement et au diagnostic du cancer de la prostate en améliorant notre compréhension de la façon dont la rigidité de la membrane basale favorise les changements moléculaires et cellulaires. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car le modèle est multidisciplinaire.

Combinaison de techniques des domaines de la chimie, de la physique et de la biologie. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons émis l’hypothèse que la rigidité de la membrane basale de la prostate peut favoriser un comportement invasif de novo dans les cellules épithéliales transformées connues. La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car des étapes interdisciplinaires doivent être décrites.

Y compris la réticulation de la membrane basale, suivie d’une culture cellulaire 3D. Commencez par préparer une surface plane de glace et utilisez-la pour refroidir une lame de verre à huit chambres à quatre degrés Celsius. Ensuite, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres et refroidissez également la pointe à quatre degrés Celsius.

Une fois refroidi, placez l’embout sur un outil de pipetage d’une capacité de 200 microlitres. Et utilisez-le pour transférer 40 microlitres de solution matricielle BM glacée dans chaque puits de la lame de verre réfrigérée à huit puits. Placez ensuite la lame de chambre à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour favoriser la polymérisation de la membrane basale.

Fermez très soigneusement la porte de l’incubateur pour ne pas perturber la membrane basale reconstituée liquide. Après exactement 30 minutes, ajoutez 250 microlitres d’une solution de glycolaldéhyde préparée pour couvrir la membrane basale polymérisée et reconstituée. Ensuite, préparez un contrôle négatif en ajoutant 250 mircoliters de PDS stérile à un gel natif et reconstitué de la membrane basale.

Préparez également deux témoins supplémentaires en ajoutant soit 50 millimolaires de cyanoborohydrure de sodium, soit 250 millimolaires d’aminoguanidine à une solution de glycolaldéhyde avant de l’ajouter au gel de la membrane basale. Ensuite, incubez les gels à 37 degrés Celsius pendant six heures pour produire un gel semi-ferme. Ou pendant 14 heures pour produire un gel ferme.

Après l’incubation, retirez soigneusement les solutions des gels et ajoutez 250 microlitres d’un ester éthylique molaire de glycine à chaque gel. Et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez chaque gel 10 fois dans 500 mircolitres de PBS pour éliminer toute trace de la solution de glycolaldéhyde et de l’ester éthylique de glycine.

Ajoutez ensuite 400 microlitres de PBS pour éviter la déshydratation et incubez les gels de membrane basale reconstitués pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à continuer, retirez le PBS des gels de membrane basale reconstitués et ajoutez 250 microlitres d’eau glacée doublement distillée dans chaque puits. Incuber les gels à quatre degrés Celsius pendant 16 à 24 heures pour s’assurer que la matrice est complètement liquéfiée.

Transférez ensuite la membrane basale liquéfiée dans un tube de 1,5 millilitre et mesurez l’émission fluorescente de la solution à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, centrifugez la solution et retirez le surnageant obtenu. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres d’une solution contenant 20 milligrammes par millilitre de bromure de cyanogène et 70 % d’acide formique.

Incuber les échantillons pendant la nuit à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre, transférez le gel de la membrane basale remis en suspension dans une cassette de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons. Immergez la cassette dans un bécher en verre de 500 millilitres contenant 500 millilitres d’eau distillée.

Et remuez l’eau avec un barreau d’agitation magnétique. Placez cette installation pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour éliminer toute trace de bromure de cyanogène et d’acide formique. À l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre, transférez la solution numérotée de la cassette dans un tube de 1,5 millilitre.

Analysez ensuite la solution en l’appliquant sur un gel de polyacrylamide à 12 %. Teindre le gel avec une coloration à l’argent pour visualiser le motif électrophorétique des peptides de la matrice de bromure de cyanogène. En commençant par les gels de la membrane basale recouverts de PBS, rincez les gels deux fois de plus, avec 300 microlitres de PBS contenant 0,1 millimole de chlorure de calcium.

Et 0,5 millimole de chlorure de magnésium. Pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pour couvrir chaque gel de membrane basale reconstitué.

Incuber les gels pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer les composants reconstitués de la membrane basale. Ensuite, retirez le fixateur et ajoutez 300 microlitres d’une solution de trempe contenant 75 millimoles de chlorure d’ammonium et 0,5 millimoles de chlorure de magnésium. Incuber la solution pendant cinq minutes à température ambiante, puis retirer la solution et répéter le rinçage quatre fois de plus.

Après le rinçage final, ajoutez 300 microlitres de tampon d’immunofluorescence aux gels de membrane basale reconstitués pour éviter les réactions non spécifiques. Incuber les gels dans la solution pendant deux heures à température ambiante sur une plate-forme agitante. Retirez ensuite le tampon bloquant l’immunofluorescence.

Et ajoutez 300 microlitres d’anticorps primaires qui sont dilués dans le tampon de blocage. Incuber les gels de membrane basale reconstitués à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Le lendemain, retirez l’anticorps primaire et lavez les gels trois fois avec 300 microlitres de tampon d’immunofluorescence.

Agitez les gels à température ambiante sur une plate-forme d’agitation pendant 10 minutes après chaque ajout de tampon. Retirez ensuite le tampon et ajoutez 300 microlitres de l’anticorps secondaire marqué fluorescentement, dilué dans le tampon de blocage. Placez les échantillons sur une plate-forme agitante et incubez les gels pendant deux heures à température ambiante.

Retirez l’anticorps secondaire. Rincez l’échantillon dans un tampon d’immunofluorescence, suivi de PBS, puis fixez et trempez les échantillons une deuxième fois. Enfin, montez les gels et utilisez un microscope pour analyser la formation de faisceaux denses.

Pour former des acini de la glande prostatique, diluez 5 000 cellules RWPE-1 dans 300 microlitres de KSFM complet, complété par 2 % de la solution de membrane basale. Pour les agrégats de cellules tumorales de la prostate, diluer 2 500 cellules PC3 dans 300 microlitres de milieu de culture RPMI-1640, complété par 2 % de la solution de membrane basale. Après l’incubation pendant la nuit des gels de membrane basale reconstitués dans du PBS, rincez-les deux fois avec 500 microlitres de milieu de culture.

Avant d’ensemencer les cellules. Ensemencez doucement les cellules sur les membranes basales reconstituées rigidifiées du produit final de glycation native et avancée. Et placez soigneusement les cultures dans un incubateur pour assurer une répartition uniforme des acini et des sphéroïdes en croissance.

Pour les cellules formant des acini, changer le milieu tous les deux jours avec un milieu de culture frais, contenant 2 % de la solution de membrane basale. Pour s’assurer que les cellules ont les facteurs de croissance nécessaires à l’homéostasie normale des acini. Après six jours de culture, les cellules épithéliales de la prostate forment des acini sur la membrane basale native reconstituée.

Et sont organisés en sphéroïdes uniformes de cellules épithéliales. Ces acini ont également les caractéristiques d’une CEE très organisée avec une polarité apicale à basale et un espace luminal visible. Lorsqu’elles sont cultivées pendant six jours sur la membrane raidie, les cellules ont une architecture perturbée.

Et passer de la forme sphéroïdale à la forme polygonale. De plus, ces acini sont très désorganisés. Et ont perdu leur polarité apicale à basale, avec un espace luminal petit ou inexistant.

Cela est également vrai pour les cellules dérivées d’une prostate affectée par l’hyperplasie bénigne de la prostate. Lorsque les cellules tumorales de la prostate ont été mesurées, les cellules se sont avérées plus longues sur la membrane basale rigide et reconstituée, et ont également migré plus rapidement et ont eu une persistance cellulaire accrue. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modéliser les effets de la rigidité de la membrane basale sur le comportement des cellules épithéliales et tumorales.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le niveau souhaité de rigidité de la membrane basale est induit et que les acini ou les s-sphéroïdes individuels sont correctement formés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’oncologie pour explorer l’induction de l’invasion des cellules cancéreuses par la rigidité de la membrane basale de la prostate. En suivant ce protocole, d’autres méthodes, comme l’immunobuvardage du lysat cellulaire, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires relatives à la voie de signalisation, modulée par la rigidité de la membrane basale.

N’oubliez pas que travailler avec du cyanoborohydrure de sodium, du bromure de cyanogène et de l’acide formique peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire, de gants, d’un écran facial et d’un respirateur pendant le travail dans la hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.