Name: Cultures placentaire et déciduale organe humain pour létude des infections à linterface materno-fœtale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez comment établir des cultures d'organe placentaire et déciduale humaine pour étudier les infections à l'interface materno-fœtale. Cette méthode préserve la structure tissulaire tridimensionnelle et permet d'observer l'invasion par Listeria monocytogenes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous sommes reconnaissants à Cristina Faralla et David Lowe pour les discussions utiles. Nous remercions Mark Weinstein et le département de pathologie de l’Hôpital général de San Francisco pour leurs conseils d’experts. Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health R01AI084928 et du Burroughs Wellcome Fund 41259 à A.I.B ; G.A.R. a été soutenu par F32AI108195, la subvention de recherche pour jeunes chercheurs de la Society for Pediatric Pathology et la bourse postdoctorale du président des partenariats pour la diversité du corps professoral de l’Université de Californie.

Des expériences ont été menées conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d&#39;Helsinki. Cette étude a été approuvée par le comité d&#39;examen institutionnel à l&#39;Université de Californie, San Francisco (CHR # 11-05530). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit pour la collecte des échantillons et une analyse ultérieure. Le tissu a été recueilli sous forme d&#39;échantillons dépersonnalisées. NOTE: Le chercheur doit obtenir l&#39;approbation de leur sujets humains commission d&#39;examen institutionnel. L&#39;exclusion des spécimens sur la base de l&#39;histoire ou placentaires anomalies de gestation varie en fonction des besoins de toute étude spécifique. NOTE: Les conditions de sécurité appropriées (niveau de biosécurité 2) devraient être utilisés pour toutes les étapes de ce protocole 12. 1. Préparation, Avant le jour Collection <ol><li> crépines autoclaves / pince pour la collecte et ciseaux / pince pour micro-dissection. </li><li> Préparer un volume adéquat (500 ml par échantillon) de tampon de lavage (refert au tableau 1 pour la recette). </li><li> Préparer un volume adéquat (100 ml par échantillon) de 0,22 uM médias Collection stérilisée par filtration (voir le tableau 1 pour la recette). </li><li> Aliquoter matrice extracellulaire (ECM, reportez - vous à la table des réactifs pour les détails) pour le stockage à long terme. </li><li> ECM de magasin sous forme solide à -20 ° C. Pour des performances optimales, éviter la répétition de gel dégel. bouteille Thaw à une solution visqueuse à 4 ° C, et de préparer 300 aliquotes dans la chambre froide avec des embouts de pipette réfrigérés. aliquotes de conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. Collecte des tissus frais ATTENTION: Lorsque vous travaillez avec le tissu humain frais, les chercheurs doivent suivre les précautions universelles (OSHA) pour prévenir la transmission par le sang, et doivent avoir reçu une formation institutionnelle adéquate. équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de protection et des blouses de laboratoire sont nécessaires. <ol><li> Transport-crépines autoclavées (un par échantillon), forceps-autoclavés, tampons de lavage (bombonne), les médias de la collection (25 ml par échantillon dans un tube conique de 50 ml), bouteille de pulvérisation, 10% l&#39;eau de Javel, 70% d&#39;éthanol, bac de collecte de tissu, sharpie et seau à glace / refroidisseur à l&#39;hôpital / clinique. NOTE: Les échantillons sont reçus dans un espace de recherche désigné situé dans une chambre près de la salle d&#39;opération. Une hotte de culture tissulaire stérile est pas nécessaire, mais la collecte devrait se produire rapidement et le chercheur doit désinfecter correctement les surfaces, comme décrit ci-dessous. </li><li> Lieu bombonne de tampon de lavage adjacente à l&#39;évier, et pulvériser robinet avec 10% de l&#39;eau de Javel et de 70% d&#39;éthanol. Poser le verre bac de collecte de tissu sur la source de lumière (bloc optique ou de la boîte de lumière), et désinfectez avec 10% de l&#39;eau de Javel et de 70% d&#39;éthanol. Laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Avoir les spécimens portent des cliniciens de la salle d&#39;opération à la salle de préparation des échantillons. A l&#39;évier, versez l&#39;échantillon au sommet de la crépine à main stérile, rincer le tissu à plusieurs reprises dans Wash tampon, et le transfert échantillon entier dans un tampon au plateau de verre aseptisée au sommet de la source de lumière. NOTE: L&#39;évaluation des tissus par le clinicien est de la plus haute priorité, donc les étapes suivantes ne sont exécutées après que le clinicien a indiqué verbalement qu&#39;il / elle a terminé l&#39;évaluation. </li><li> Utilisez des pinces stériles pour sélectionner villosités placentaires et decidua (Figures 2A et 3A) pour la collecte et le transfert de séparer 50 ml tubes coniques. Etiqueter les tubes avec l&#39;âge gestationnel. NOTE: Préféré âge gestationnel est inférieur à 9 semaines et moins de 16 semaines pour le placenta et decidua, respectivement. A l&#39;institution, seule une fraction de chaque échantillon est procuré à des fins de recherche, que le tissu adéquat doit rester pour le diagnostic pathologique clinique. </li><li> Stockez et de transport des échantillons sur la glace au laboratoire de recherche. </li><li> Pour recueillir plus d&#39;un spécimen, assainir le plateau en verre comme décrit ci-dessus avec 10% de l&#39;eau de Javel et de 70% d&#39;éthanol entre la collection de chaque spécimen. </li></ol> 3. Préparation de la culture d&#39;organes Plaques REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées en utilisant une technique stérile dans une hotte de culture de tissus. Il est idéal pour le microscope à dissection pour être situé dans un champ stérile. Cependant, ce ne soit pas absolument nécessaire tant que micro-dissection est effectuée rapidement, et les instruments sont plongés fréquemment dans 70% d&#39;éthanol. <ol><li> flacon Thaw ECM (s) sur la glace. Diluer l&#39;ECM 1: 1 avec les médias Collection glacées, mélanger par pipetage. Pipette lentement pour éviter d&#39;introduire des bulles. Chaque puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 6 puits requiert 100 ul de cette suspension et pourra accueillir des cultures d&#39;organes 3-4. </li><li> inserts Lieu Transwell (taille des pores 0,4 uM) dans chaque puits de 6 puits plaque de culture de tissus. </li><li> Enrober chaque Transwell insert avec une couche mince (100 pi) de l&#39;ECM / suspension des médias. </li><li> Placer la plaque sur la glace et procéder immédiatement à establishment des cultures d&#39;organes. Vous pouvez également préparer la plaque avant la collecte des tissus, dans ce cas, l&#39;envelopper en para-film et de conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Stockage de plus de 6 heures est pas recommandée car l&#39;ECM va sécher. </li></ol> 4. Mise en place des cultures d&#39;organes REMARQUE: Cette étape décrit comment placer des cultures d&#39;organes déciduales et des cultures d&#39;organes villeux dans transwell séparés. Les tissus ne sont pas en contact. Les chercheurs intéressés par une technique de co-culture où decidua et villosités sont en contact direct les uns avec les autres, peuvent se référer à la littérature avant 9,10. <ol><li> Rincer les échantillons à deux reprises dans les médias de la collection, et centrifuger à 1000 xg entre chaque rinçage. Transfert tissu à une boîte de Pétri stérile et place sur la scène d&#39;un microscope à dissection. Gardez plaque de 6 puits sur la glace adjacente au microscope. </li><li> tissu Micro-disséquer avec springer disséquer des ciseaux et des pinces stériles, pour établir la culture d&#39;organes villous 2-3 mms (figure 2A). NOTE: Les cultures d&#39;organes villosités sont de petits «arbres», bien vascularisées avec 2 ou 3 branches, et avec trophoblaste extravillositaire (EVT) colonnes de cellules de premier plan 11. Il est important d&#39;utiliser seulement tissu villeux de &lt;9 semaine spécimens du premier trimestre, comme l&#39; invasion des trophoblastes extravilleux dans ECM est le plus prononcé à ces jeunes âgés de 13 ans. </li><li> Sélectionnez villosités bien vascularisé avec des colonnes de cellules EVT de premier plan. Colonnes de cellules EVT sont visualisées sous forme de bulbe, &quot;floue&quot;, extrémités &quot;moelleuses&quot; (voir flèches sur la figure 2A). </li><li> Utilisez des pinces stériles pour transférer 3 ou 4 arbres villeux dans chaque Transwell. Ajuster branches pour arbre est positionné à plat au sommet d&#39;ECM et branches agglomérées séparées. </li><li> Micro-disséquer les tissus déciduale avec springer disséquer des ciseaux et des pinces stériles, pour établir 3 mm 3 cultures d&#39;organes déciduales (Figure 3A). NOTE: Les échantillons contiennent deux distypes tinctes de tissus déciduales, parietalis decidua et decidua capsularis (fragments de droite tissus, respectivement, la figure 3A gauche et). </li><li> Coupez avec des ciseaux pour créer 3 mm 3 morceaux de decidua parietalis. Decidua capsularis est pas utilisé pour ces cultures. Utilisez une pince pour taquiner loin du sang maternel coagulé. </li><li> Utilisez des pinces stériles pour transférer 3-4 morceaux de decidua dans chaque Transwell. </li><li> Ajouter 1ml de Collection médias à fond du puits. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2 </li><li> Pour les expériences dans lesquelles il est important d&#39;imiter la tension d&#39;oxygène du placenta premier trimestre de grossesse normale, maintenir des cultures d&#39;organes villeux hypoxie relative (3% de O 2). REMARQUE: Les options de laboratoire comprennent de petites chambres hypoxie de l&#39; incubateur qui correspondent à l&#39; intérieur des incubateurs existants, ou un incubateur tri-gaz qui introduit le gaz N 2 externe pour abaisser la concentration en oxygène. </li><li> Ajouter 1 ml de Villous ou moyenne déciduale (Table 1) vers le haut de Transwell après 12-16 heures de culture. NOTE: L&#39;absence de médias au cours de la première nuit dans la culture permet aux colonnes de cellules de trophoblastes extravilleux d&#39;envahir (culture villeux), et pour le tissu (à la fois des villosités et déciduale) pour devenir solidement ancré dans l&#39;ECM. Dans notre expérience, des cultures d&#39;organes déciduales restent viables pendant 72 h et organes villous cultures pour 96 h. Nous recommandons paramètres expérimentaux qui tombent dans ce délai. Voir le tableau 1 pour la composition du milieu Villous et déciduale. Moyen Villous a un pourcentage élevé de FBS, tandis que le milieu déciduale est complété par des hormones de grossesse (progestérone, 17ß-estradiol) qui maintiennent l&#39;état decidualized (tableau 1). </li></ol> 5. Préparation de L. monocytogenes cultures NOTE: Pour le protocole détaillé sur le stockage à long terme de L. monocytogenes, et la culture et la croissance des this organisme en infusion cerveau - coeur (BHI) et l&#39; agar, s&#39;il vous plaît se référer à Wang et al. 14 <ol><li> Choisissez un seul L. monocytogenes colonie strié plaque de gélose BHI et ensemencer 3 ml de bouillon BHI. </li><li> Incuber L. monocytogenes culture de la nuit (16 h), dans une position inclinée, à 30 ° C. . REMARQUE: Ces conditions de culture permettent la croissance bactérienne pour atteindre la phase stationnaire L. monocytogenes est flagellé à 30 ° C, ce qui augmente l&#39; invasion de la cellule hôte 15. </li></ol> 6. Infection des cultures d&#39;organes avec L. monocytogenes <ol><li> Chaud PBS et Villous ou moyenne déciduale (tableau 1) à 37 ° C. </li><li> Utilisez des pinces stériles pour enlever les morceaux de culture d&#39;organes qui n&#39;envahissent dans l&#39;ECM, et sont donc flottant dans le puits. </li><li> Aspirer soigneusement les médias de bas de Transwell. Rincer transwell supérieure et inférieure à deux reprises par un léger pipetage 1 ml de guerrem PBS dans le puits, et aspirer soigneusement entre les deux. pipette doucement 1 ml de sans antibiotique Villous ou déciduale médias à Transwell supérieure et inférieure. Veillez à ne pas perturber la culture d&#39;organe. </li><li> Laissez le tissu incuber dans des milieux sans antibiotiques pendant au moins une heure pour assurer que les antibiotiques ont été enlevés. NOTE: A la phase stationnaire de la densité du L. la culture monocytogenes est d&#39; environ 1 x 10 9 unités formant colonie (UFC) par ml. Le nombre de bactéries utilisées pour infecter des cultures d&#39;organes doit être déterminée de manière empirique pour répondre aux besoins expérimentaux. </li><li> Pour type sauvage L. monocytogenes expériences d&#39;infection de routine montrent une invasion robuste avec une dilution au 1:50 de la nuit (4 x 10 7 L. monocytogenes dans 1 ml de milieu par puits). Resuspendre le nombre approprié de bactéries dans Villous ou déciduale milieu sans antibiotiques. </li><li> Aspirer le milieu du haut de transwell. ajouter doucement 1 ml d&#39;inoculum. Incuber les plaques à 37° C dans 5% de CO2 pour permettre une invasion bactérienne. </li><li> Éliminer les bactéries extracellulaires par aspiration média à partir transwell supérieure et inférieure. Rincer les puits deux fois avec du PBS chaud. Ajouter 1 ml de villosités ou un support déciduales supplémenté avec 50 pg ml - 1 de gentamicine. Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO2. NOTE: L. monocytogenes est une bactérie intracellulaire facultative qui peut se développer dans un milieu extracellulaire, développer à l&#39; intérieur des cellules, et la propagation de la cellule à cellule sans accéder à l&#39;espace extracellulaire. Gentamicine a un effet bactéricide sur extracellulaire L. monocytogenes, et permet ainsi la mesure de intracellulaire L. monocytogenes croissance et la propagation à travers la culture d&#39;organes 16. NOTE: Reproductible L. l&#39; infection par le monocytogenes des cultures d&#39;organes villeux et decidua se produit avec 5 h temps d&#39;incubation. Le temps d&#39;incubation avant l&#39;addition de gentamicine peut être modifié en fonction des besoins expérimentaux et abilité de l&#39;organisme à envahir les tissus. Pour mieux comprendre les sites anatomiques les plus vulnérables à l&#39; infection, la réduction des temps d&#39;incubation peuvent être utilisés 2. </li><li> Maintenir les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant toute la durée de l&#39;expérience. Changer les médias ensemble dans chaque puits par jour. NOTE: Dans notre expérience, L. monocytogenes cultures d&#39;organes déciduales infectés par le restent viables pendant 48 h et organes villous cultures pendant 72 heures. </li></ol> 7. Récolte des cultures d&#39;organes pour histopathologie <ol><li> Préparer une nouvelle solution de paraformaldéhyde 4% en diluant 10 ml d&#39;une 16% actions ampoule dans 30 ml de PBS. Magasin paraformaldéhyde 4% à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière, et d&#39;utiliser moins d&#39;une semaine. Porter à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Aspirer le milieu de Transwell supérieure et inférieure. Rincer délicatement les puits deux fois avec du PBS à la température ambiante. Ajouter délicatement 1ml paraformaldéhyde 4% à Transwell haut pour couvrir complètement la culture d&#39;organe. </li><li> Incuberdans 4% de paraformaldehyde à la température ambiante pendant 20 min. Évitez de plus longues durées d&#39;incubation, car cela pourrait conduire à une fixation du tissu. </li><li> Aspirer le paraformaldehyde et le puits de rinçage deux fois avec du PBS à la température ambiante. Intégrer les cultures d&#39;organes fixes en milieu OPO, gel, et de l&#39;article sur un cryostat ( &quot;fixe gelé&quot;). En général, le tissu congelé fixe est plus facile à la section de tissu congelé sans fixation préalable. NOTE: Pour le protocole complet sur ​​octobre plongement et tronçonnage congelé, s&#39;il vous plaît accéder à des sections pertinentes des protocoles publiés 17,18. En fonction des besoins expérimentaux et matériel de laboratoire disponibles et le stockage, le tissu peut plutôt être inclus dans la paraffine et sectionnés sur un microtome 19. </li><li> Préparer d&#39; autres lames de tissu pour hématoxyline &amp; éosine routine, immunofluorescence, ou immunohistochimie 18,20,21. </li></ol>

<ol><li>Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+host+specificity+in+human+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+microbes+%26+infections%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria.</a> Emerging microbes & infections. 3, e23(2014).</li>
<li>Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+syncytiotrophoblast+constitutes+a+major+barrier+to+vertical+transmission+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes.</a> PLoS pathogens. 6, e1000732(2010).</li>
<li>Zhang, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymeric+immunoglobulin+receptor+translocates+pneumococci+across+human+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells.</a> Cell. 102, 827-837 (2000).</li>
<li>Ngampasutadol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+C4b-binding+protein+selectively+interacts+with+Neisseria+gonorrhoeae+and+results+in+species-specific+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).</li>
<li>Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+barriers+of+the+human+placenta+to+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii.</a> Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Hazan, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-leukocyte+interactions%3A+mechanisms+of+human+decidual+spiral+artery+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro.</a> The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).</li>
<li>Dunk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+trophoblast-mediated+decidual+blood+vessel+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).</li>
<li>Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunkapiller%2C+NM+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 445, 281-302 (2008).</li>
<li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+safe+work+practices+in+human+and+animal+medical+diagnostic+laboratories.+Recommendations+of+a+CDC-convened%2C+Biosafety+Blue+Ribbon+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22+MMWR+Surveill+Summ%22%5BJournal%5D)">Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel.</a> MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).</li>
<li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentrations+inhibit+trophoblast+cell+invasion+from+early+gestation+placental+explants+via+alterations+in+levels+of+the+urokinase+plasminogen+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system.</a> Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).</li>
<li>Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+load+and+immune+responses+in+mice+infected+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+degeneration+and+regeneration+of+syncytiotrophoblast+in+first+trimester+placental+villi+during+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture.</a> Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).</li>
<li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCroy%2C+BA+%22The+Guide+to+Investigation+of+Mouse+Pregnancy%2C+1st+Edition%22">The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition</a>. , (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Laboratory+Techniques.+Histological+Sample+Preparation+for+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy.</a> JoVE. , (2016).</li>
<li>Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+paraffin+sections+of+mouse+epidermis+using+fluorescent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e308(2007).</li>
<li>Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defense+and+tolerance%3A+unique+challenges+in+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta.</a> PLoS pathogens. 8, e1002804(2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515, 355-364 (2014).</li>
<li>Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+the+placental+fortress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Pathogens and the placental fortress.</a> Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+anti-listerial+responses+in+deciduoma+of+pseudopregnant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice.</a> The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).</li>
<li>Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+functions+are+regulated+by+the+substratum+of+murine+decidual+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells.</a> The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).</li>
<li>Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+traffics+from+maternal+organs+to+the+placenta+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back.</a> PLoS pathogens. 2, e66(2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

, les souches transgéniques et knockout souris consanguines peuvent servir dans des systèmes expérimentaux pour tester robuste mécanismes. Cependant, en dépit de la conservation générale du matériel génétique de base, les génomes fonctionnels de souris et les humains montrent des différences significatives dans les éléments régulateurs 23. Il est donc pas surprenant, que les études précliniques prometteurs dans des modèles animaux ne sont parfois pas récapitulé chez des patients humains. Le placenta montre la diversité interspécifique très élevé, rendant ainsi les modèles animaux moins de idéal pour l&#39;étude des maladies humaines 24. Reconnaissant à la fois les différences notables en immunologie humaine et de la souris 25, et l&#39;évolution divergente prononcée dans l&#39; anatomie du placenta, il est prudent d&#39;envisager l&#39;utilisation des ex vivo des cultures d&#39;organes de tissus gestationnels humains aux fins d&#39; enquête expérimentale. Les descriptions, images photographiques et vidéo d&#39;enseignement dans ce protocole instruisent chercheurs surcomment établir des villosités et des cultures d&#39;organes déciduales sur tissu Transwell inserts de culture ECM-enduit. Les avantages de cette technique sont la simplicité relative de la micro-dissection mécanique et système de support de Transwell, en particulier par rapport à d&#39;autres méthodes telles que les matrices 3D intégrées ou des cultures de tranche d&#39;organes. Suspension de la culture d&#39;organes sur le soutien de la membrane permet l&#39;échange d&#39;éléments nutritifs à toutes les surfaces de tissus et de la viabilité est maintenue pour la culture à court terme (96 h pour les cultures villeux, 72 h pour les cultures déciduales) technique .Cet permet d&#39;étudier la biologie placentaire humaine au niveau du tissu niveau, indéniablement plus biologiquement pertinente que les modèles de culture cellulaire monocouche. L&#39;étape la plus critique dans ce protocole est le micro-dissection des pièces villeux et déciduales appropriées pour la culture d&#39;organes. Morceaux de tissu optimales sont mises en évidence photographiquement (figure 2A et la figure 3A) pour aider les chercheurs pour lesquelsvisualisation des spécimens de gestation est nouveau. Il est particulièrement important de choisir des arbres villosités dont les branches se terminent par des colonnes de EVT, car ces cellules vont migrer dans l&#39;ECM et aider à ancrer les villosités de la membrane. Pour les deux types de cultures d&#39;organes est utile pour réduire au minimum les perturbations du tissu lors des changements de médias par pipetage d&#39;une manière prudente et sans hâte. Cette technique présente des difficultés minimes. À l&#39;occasion, les échantillons montrent une contamination. La contamination bactérienne est habituellement (parfois poly-microbienne), et ne devient évidente après 1-2 jours de culture. Une fois que la contamination est observée, l&#39;eau de Javel doit être appliquée, la culture mis au rebut, et l&#39;incubateur de culture de tissu stérilisé pour éviter un problème à long terme. Il existe plusieurs façons possibles de contamination peut survenir: l&#39;infection in utero, pendant l&#39;intervention chirurgicale, au cours de spécimen récolte / transformation, ou lors de l&#39;entretien de la culture d&#39;organes. Les étapes de récolte et de transformation sont le moment le plus probableet le lieu de la contamination à introduire. Ainsi, il est important de réduire la durée pendant laquelle l&#39;échantillon est manipulé lors de la collecte et de la micro-dissection. Cela permettra de réduire l&#39;exposition de l&#39;échantillon à la température ambiante, l&#39;environnement non stérile. Selon la configuration du laboratoire, le microscope de dissection peut être situé à l&#39;intérieur de la hotte de culture tissulaire stérile. L&#39;analyse histopathologique des cultures d&#39;organes après l&#39; infection par l&#39;agent pathogène pertinent L. médicalement monocytogenes, est montré ici comme une application possible du protocole. Immunofluorescence localisation des bactéries et des cellules immunitaires de l&#39;hôte après les rendements de l&#39;infection de nouvelles connaissances sur la réponse de l&#39;hôte humain à des agents pathogènes. Cultures d&#39;organes déciduales pourraient servir ex vivo technique d&#39;expérience complémentaire pour examiner les données générées par les infections in vivo de souris, y compris les rapports intrigants présentant des défauts dans les fonctions de défense des macrophages murins déciduales 26,27. En outre, l&#39;homme orgune culture peuvent être utilisées dans des stratégies mixtes infection, comme un inoculum compétitif composé de plusieurs souches isogéniques de L. monocytogenes. infection concurrentielle des cultures d&#39;organes est une manière sensible à tester la pertinence des facteurs de virulence chez l&#39;hôte humain. Une contrainte de cette méthode est la viabilité des tissus, qui est limitée à la culture à court terme (96 h pour les cultures villeux, 72 h pour les cultures déciduales). Ceci est idéal pour l&#39; infection par des microbes à croissance rapide tels que L. monocytogenes, mais plus les cultures peuvent être nécessaires pour les agents pathogènes qui prennent plus de temps pour établir et diffuser à travers les tissus. Afin de réduire le fardeau mondial des complications de la grossesse, la recherche doit se concentrer sur la compréhension de la physiopathologie de l&#39;interface materno-fœtale humaine. Bactérienne, fongique, et des agents pathogènes viraux qui traversent la mère au fœtus cause de complications dévastatrices de la grossesse et de l&#39;infection fœtale. Contrôlée dans l&#39; infection in vivo de laboratoire animals est généralement considéré comme l&#39;étalon-or pour aborder la façon dont les agents pathogènes colonisent et de transit entre les organes 28. Parce que l&#39;anatomie du placenta varie considérablement entre les espèces de mammifères, il est de la plus haute importance d&#39;incorporer les tissus humains dans les stratégies de recherche. cultures d&#39;organes villeux et déciduales humains sont des systèmes modèles très pertinents pour enquêter sur les interactions hôte-pathogène. Pour étudier cet organe encore mal compris vital, les chercheurs peuvent profiter de l&#39;abondance de placenta humain jetés autrement et spécimens déciduales, en utilisant des stratégies de culture d&#39;organes tels que décrits ici.

L&#39;infection et l&#39;inflammation à l&#39;interface materno-fœtale représente une source majeure de morbidité et de mortalité chez les femmes et les enfants. Comprendre comment les agents pathogènes infectent ces tissus est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies pour prévenir et traiter des maladies telles que le travail prématuré et la mort du fœtus. Cependant, haute variabilité interspécifique de l&#39;interface materno-fœtale complique étude expérimentale. En outre, la plupart des pathogènes microbiens montrent la spécificité d&#39;hôte, ainsi de nombreux modèles animaux ne peut pas récapituler complètement les maladies infectieuses humaines. Certains organismes (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholera, et de nombreux autres) sont strictement pathogène chez l&#39; homme, tandis que d&#39; autres, tels que Listeria monocytogenes, montrent un niveau plus intermédiaire de la spécificité d&#39;hôte 1. La spécificité de l&#39; hôte a été documentée dans de nombreux aspects de la pathogenèse, y compris la colonisation 2, la diffusion 3, l&#39; évasion immunitaire 4 </sup&gt;, et l&#39; acquisition des éléments nutritifs 5. Ainsi, il est d&#39;une importance capitale pour sélectionner des systèmes modèles d&#39;accueil optimales. Composé de cellules fœtales et le sang maternel, le placenta est un organe qui se développe rapidement au cours de la gestation 6. En termes plus simples, le placenta humain est constitué de structures fœtales &quot;villeux&quot; arborescentes baignées dans le sang maternel. Gaz et l&#39;échange des éléments nutritifs se produit à travers des couches de cellules foetales spécialisées appelées trophoblastes qui tapissent la surface des arbres villeux. La doublure maternelle utérine de la muqueuse, appelée endomètre chez la femme non enceinte, transforme structurellement et fonctionnellement dans le decidua pour accueillir l&#39;unité foeto-placentaire. arbres villosités sont ancrés dans l&#39;utérus par trophoblastes extravilleux (EVT) qui migrent de l&#39;ancrage des colonnes de cellules dans le decidua. L&#39;interface materno-fœtale, par conséquent, se compose de decidua et le placenta. La technique de culture d&#39;organe décrit ci-a été utilisé pour examiner où et comment cliniquement pathogènes humains pertinents, y compris L. et s monocytogenes Toxoplasma gondii, traversent la barrière placentaire 2,7. Ces cultures ex vivo d&#39;organes répliquent dans l&#39; architecture des tissus in vivo, et sont des systèmes modèles sans doute physiologiquement très pertinents pour la placentation humaine. Les techniques de culture supplémentaires comprennent des explants entiers d&#39;orgue, des tranches d&#39;organes et de tissus ou de cellules souches organites intégrés en 3D-matrice. Pour plus de détails sur ces options, s&#39;il vous plaît se référer à un récent examen exhaustif 8. S&#39;il vous plaît noter que ce protocole est pour la culture distincte des decidua et villosités placentaires. Pour étudier l&#39;interaction entre les cellules du placenta et les cellules déciduales, une technique de co-culture peut être préférée. Nous renvoyons le lecteur intéressé à la technique de co-culture villous-déciduale décrit précédemment, utilisé par les chercheurs qui étudient trophoblaste médiée decidual remodelage vasculaire 9-11.

<table><tbody><tr><td>Sachets de stérilisation</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td>Pour l’autoclave Outils de dissection individuels</td></tr><tr><td>Passoire à mailles fines</td><td>Cuisinart (Amazon.com)</td><td>NA</td><td>Envelopper complètement dans une feuille d’aluminium et un autoclave avant le prélèvement des tissus. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Tourie avec embout</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-647</td><td>Pour la préparation de grands volumes de tampon de lavage.</td></tr><tr><td>Blocs réfrigérants</td><td>Nortech labs</td><td>GB8818</td><td>Il n’est pas nécessaire de les acheter, mais ils peuvent être recyclés/réutilisés à partir de tout envoi de laboratoire de routine qui les inclut dans l’emballage.</td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td>Solution à 70 % obtenue en ajoutant du dH20 à 190 ou 200 degrés d’alcool de qualité recherche. &nbsp ;</td></tr><tr><td>10 % Bleach</td><td>Waxie Sanitary Supply</td><td>CLO 30966</td> Solution <td>à 10 % obtenue en ajoutant dH20.</td></tr><tr><td>Caisson lumineux</td><td>Litebox Lumina (dickblick.com)</td><td>55305-2009&nbsp ;</td><td>Notez les ampoules de rechange également achetées sur Blick (55305.0100)</td></tr><tr><td>Micro pince à dissection&nbsp ;</td><td>Stoelting&nbsp ;</td><td>52102-43</td><td>4 pouces, 1 x 2 x 0,5 mm3, Légère Courbe</td></tr><tr><td>Micro pince de dissection</td><td>Stoelting</td><td>52102-06</td><td>4 pouces, Droit Fin, Tranchant</td></tr><tr><td>Micro dissection vannes ciseaux à ressort</td><td>Stoelting&nbsp ;</td><td>52130-01P</td><td>McPherson-Vannas Ciseaux à ressort, 8,5 cm, pointe 0,33, légère courbe</td></tr><tr><td>Microscope à dissection</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16 ou M60</td><td>Nous avons eu du succès avec les modèles énumérés.&nbsp ; Les sources lumineuses externes flexibles en col de cygne sont utiles mais pas nécessaires.</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS4558</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10010023</td><td>Nous achetons auprès de notre plateforme de culture tissulaire universitaire, d’autres options comme celle-ci sont disponibles. &nbsp ;</td></tr><tr><td>10x Saline tamponnée au phosphate</td><td>Teknova</td><td>P0195</td><td>Pour la préparation du tampon de lavage, nous utilisons 10x mélange de nutriments PBS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (Jambon) avec GlutaMAX</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10565-018</td><td>Nous achetons cette formulation de milieu spécifique, contenant 2,438 g / L de bicarbonate de sodium, 55 mg / L de pyruvate de sodium et 4,5 g / L de glucose</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710072</td><td>1 000x stock. Il est recommandé de préparer et de conserver les aliquotes à -20 &deg ; C pour éviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100x stock.&nbsp ; Il est recommandé de préparer et de conserver les aliquotes à -20 &deg ; C pour éviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15290-018</td><td>500x stock.&nbsp ; Il est recommandé de préparer et de conserver les aliquotes à -20 &deg ; C pour éviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>progestérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Une solution mère de 1 mM est obtenue en reconstituant 15,7 mg de poudre de progestérone dans 15,7 ml d’éthanol et en ajoutant 34,3 ml de PBS. La solution est filtrée stérilement, aliquote et stockée à -20 °C.</td></tr><tr><td>17&bêta ;-œstradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>A 10 &mu ; La solution mère M est obtenue en reconstituant 13,5 mg de poudre d’œstradiol dans 10 ml d’éthanol et en ajoutant 40 ml de PBS. La solution est filtrée stérilement, aliquote et stockée à -20 °C.</td></tr><tr><td>Filtre sous vide pour bouteille (0,22 &mu ; m)</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430769</td><td>Pour la filtration stérile des milieux de collecte après préparation</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353224</td><td>Polystyrène, Puits à 6 puits traités pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Insert PICM03050 Millipore</td><td></td><td>- 30 mm de diamètre, 0,4 & Matrice</td></tr><tr><td>extracellulaire (par exemple, matrice Matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Nous avons utilisé la matrice Matrigel dans nos études. C’est un solide à température ambiante et à -20 °C. Évitez de geler/dégeler à nouveau. Décongeler la bouteille dans une solution visqueuse à 4 &deg ; C, et préparer ~ 300 &mu ; L aliquotes dans la chambre froide avec pointes de pipette réfrigérées. Stocker les aliquotes à -20 °C &nbsp ;</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, solution aqueuse à 16 % p/v.</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Pour la fixation des tissus, une préparation fraîche de 4 % de paraformaldéhyde est obtenue en diluant cette substance dans du PBS.</td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire, maintenu à 37 &deg ; C, 5 % CO2, 3 % d’oxygène (facultatif pour les cultures d’organes villeux)</td><td></td><td></td><td>Pour certaines expériences, l’hypoxie peut être préférée. Cela peut être établi de plusieurs façons, y compris l’ajout d’azote exogène via une bouteille de gaz, un tube Tygon et un régulateur. &nbsp ;</td></tr><tr>Centrifugeuse <td></td><td></td><td></td><td>de paillasse</td></tr></tbody></table>

cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Le placenta montre un grand degré de variabilité anatomique interspécifique. Pour mieux comprendre la biologie et la physiopathologie du placenta humain, il est impératif de concevoir des expériences utilisant des cellules et de tissus humains. Un avantage de culture organotypique est le maintien de trois dimensions (3D) de l&#39;organisation structurelle et de la matrice extracellulaire. L&#39;objectif de la méthode décrite ici est mise en place réussie des ex vivo des cultures d&#39;organes de tissus humains gestationnel et leur entretien de culture sain pour 72-96 h. Le protocole détaille le traitement immédiat de la recherche objet du consentement, du placenta et des spécimens déciduales frais de la salle d&#39;opération. Ceux-ci sont des spécimens abondants qui autrement seraient mis au rebut. Des instructions détaillées sur la collecte stérile de ces échantillons, y compris les détails morphologiques sur la façon de choisir les tissus appropriés pour établir des cultures d&#39;organes 3D, est fourni. Tissus villeux et déciduales placentaires sont microdisséquées en 2-3 mm 3 pièceset placés séparément sur des filtres Transwell matrice doublée et mises en culture pendant plusieurs jours. Villous et cultures d&#39;organes déciduales sont bien adaptés à l&#39;étude des interactions hôte-pathogène humain. Par rapport à d&#39;autres organismes modèles, ces cultures humaines sont particulièrement avantageux d&#39;examiner le mécanisme d&#39;infection pour les agents pathogènes qui démontrent des modèles variables de spécificité d&#39;hôte. A titre d&#39;exemple, nous démontrons l&#39; infection des cultures d&#39;organes placentaires et déciduales avec les, facultatifs intracellulaires pathogènes bactériens Listeria monocytogenes cliniquement pertinentes.

Figure 1 (modifié de Zeldovich &amp; Bakardjiev 22) schématise la barrière placentaire pertinente et l&#39; anatomie utérine. La figure 2 montre brute représentative et images histologiques de villosités placentaires, tandis que la figure 3 montre les tissus déciduale. Ce protocole décrit d&#39;abord la collecte des placentaire frais et de tissus déciduale à l&#39;hôpital ou à la clinique. Le spécimen récolté est un mélange de placentaire fœtal (villosités) et des composants de l&#39;utérus maternel (decidua). Après rinçage avec un tampon contenant des antibiotiques à large spectre et antifongiques, l&#39;ensemble de l&#39;échantillon est inspecté par l&#39;oeil en utilisant une boîte à lumière. Villi et decidua sont placés dans des tubes séparés et transportés sur la glace au laboratoire. Au laboratoire, un microscope de dissection est utilisé pour apprécier les caractéristiques morphologiques fines de tissus sains. photographies représentatifs devillosités (figure 2A) et les tissus déciduales (Figure 3A) qui ont été acquises avec un microscope à dissection avec deux sources lumineuses externes du col de cygne sont présentés pour référence. cultures d&#39;organes villosités sont générés à partir des premiers échantillons de trimestre. Les cultures se composent de petits arbres villosités terminales avec 2-6 branches. Il est important de disséquer les branches villosités qui se terminent dans les colonnes du trophoblaste extravilleux et sont bien vascularisé. Ces caractéristiques sont considérées comme &quot;pelucheux&quot; ou &quot;floue&quot; extrémités de branche (pointes de flèche), et la faible linéaire teinte rose à rouge que les cours à travers les branches de l&#39;arbre sur la gauche de la figure 2A. En revanche, la vascularisation et trophoblastes extravilleux ne sont pas facilement visualisées pour l&#39;arbre sur la droite de cette image, qui serait optimale pour la culture. Au cours de la première journée de la culture, les trophoblastes extravilleux migrent dans l&#39;ECM, thus ancrage des arbres villosités dans la matrice sur le Transwell. cultures d&#39;organes déciduales sont générés à partir des premiers et au début du deuxième trimestre de spécimens. La muqueuse utérine entière se transforme en decidua très peu de temps après l&#39;implantation. Plus précisément, déciduale basal définit la muqueuse utérine sous-jacente directement sur le site du placenta / implantation, déciduale capsularis définit la muqueuse recouvrant le foetus et la caduque pariétale se réfère au reste de la muqueuse utérine. Visualisation sous un microscope de dissection montre que l&#39;échantillon gestationnel précoce se compose essentiellement de parietalis decidua et decidua capsularis ( de gauche et de fragments de tissus à droite, respectivement, sur la figure 3A). La caduque ovulaire se distingue facilement par sa mince nature membraneuse. Pour les cultures d&#39;organes, decidua parietalis est coupé à 3 mm 3 fragments avec des ciseaux micro-dissection et adhélocation sang coagulé est retiré avec une pince. Après une nuit d&#39; incubation, les tissus sont infectés par L. monocytogenes. Le protocole d&#39;infection décrit ci - dessus est basée sur l&#39;essai de protection contre la gentamicine utilisée pour étudier la croissance intracellulaire et la propagation des bactéries intracellulaires facultatives à 16. Cultures d&#39;organes dans un milieu sans antibiotiques sont incubés avec L. monocytogenes pendant 5 heures. Les cultures sont lavées avec du PBS stérile pour éliminer les bactéries du milieu. Par la suite, la gentamicine est ajouté pour éliminer les organismes extracellulaires. Avant la littérature de notre laboratoire a utilisé immunofluorescence et la microscopie confocale pour déterminer la localisation tissulaire bactérienne à différents moments après l&#39; infection 2. des cultures d&#39;organes sont rincées dans du PBS, fixées dans du paraformaldéhyde 4%, et soit congelé enrobé dans un milieu octobre et stocké à -80 ° C, soit inclus dans la paraffine et on conserve à la température ambiante. Des sections de tissu peuvent être stained pour immunofluorescence (IF) ou immunohistochimique (IHC) analyse des bactéries et de la localisation des cellules eucaryotes. Figure 2B est un représentant IF image d&#39;une section gelée préparée à partir d&#39; une culture d&#39;organes villous 8.3 d&#39; une semaine à 72 heures après l&#39; infection. Notez le lourd fardeau bactérienne (fluorescence verte) dans les EVTS aux extrémités des branches des villosités, et le manque relatif de bactéries dans l&#39;arbre-lining syncytiotrophoblaste (fluorescence rouge) couche. Dans des travaux antérieurs, nous avons utilisé la même IF coloration pour localiser L. monocytogenes dans les cultures d&#39;organes villeux à différents timepoints après l&#39; infection. Plus de 72 heures, l&#39;infection propagation de EVT dans cytotrophoblastes sous-syncytial et stroma villositaire sous-jacent. Notamment, la couche de synyctiotrophoblast est résistante à l&#39; infection par deux. images microscopiques lumière représentatifs de coupes de tissus déciduales H &amp; E-tachés paraffine préparés à partir de 14,3 semaines specimens sont représentés sur les figures 3B et 3C. Cette membrane Transwell ECM revêtu a été incorporé pour montrer la culture d&#39;organes in situ (figure 3B). L&#39;image montre les glandes épithéliales bordées (astérisque) et vascularisation endothéliale doublé (diamant) positionnées de manière hétérogène dans le compartiment des cellules stromales déciduale. En outre, il existe des cellules du système immunitaire maternel dispersés à travers le stroma déciduale à une densité variable. IHC et IF coloration peut être utilisée pour déterminer la localisation des bactéries micro-anatomiques, par rapport aux cellules immunitaires résidentes spécifique. A titre d&#39;exemple, les macrophages CD14 + (fluorescence verte) localisent à la paroi du système vasculaire et sont dispersés à l&#39; intérieur du stroma (figure 3D), tandis que les gros agrégats de L. monocytogenes (fluorescence rouge) sont observées principalement dans le stroma decidual à 48 heures après l&#39; infection (Figure 3D). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"fo: keep-with-next.within page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Le tampon de lavage </td><td> Milieu de Collection </td><td> moyen villous </td><td> moyen déciduale </td></tr><tr><td> PBS </td><td> DMEM / F-12 avec GlutaMAX </td><td> DMEM / F-12 avec GlutaMAX </td><td> DMEM / F-12 avec GlutaMAX </td></tr><tr><td> Pénicilline 100 Ul / ml </td><td> Sérum fœtal bovin 2,5% </td><td> Sérum fœtal bovin 20% </td><td> Sérum fœtal bovin 2,5% </td></tr><tr><td> Streptomycine 100 pg / ml </td><td> Pénicilline 100 Ul / ml </td><td> Pénicilline 100 Ul / ml </td><td> 17β-estradiol 300 pg / ml </td></tr><tr><td> Gentamicine 50 ug / ml </td><td> Streptomycine 100 pg / ml </td><td> Streptomycine 100 pg / ml </td><td> Progestérone 20 ng / ml </td></tr><tr><td> Amphotéricine B 1,25 pg / ml </td><td> Gentamicine 50 ug / ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;<html> / Td&gt; <td> Amphotéricine B 1,25 pg / ml </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Média recettes Composants et concentrations pour la préparation du tampon de lavage, moyenne Collection, moyenne Villous, et moyen déciduale. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig1.jpg" /> Figure 1. placentaire structure. (A) Structure de l&#39; unité foeto-placentaire dans l&#39; utérus maternel, (B) Agrandissement de la case dans (A) souligne que trophoblaste fœtal (T) bordée villosités placentaires sont baignées dans le sang maternel et ancrées dans la decidua par trophoblastes extravilleux (EVT). Villosités sont contenus dans les vaisseaux foetaux (FV), les fibroblastes, les macrophages et les foetus. Modifié à partir de Zeldovich &amp; Bakardjiev 22.<html> &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig2.jpg" /> Figure 2: des cultures d&#39;organes villosités - brute représentant et images microscopiques (A) Deux arbres villosités terminales avec un âge gestationnel de 6 semaines, comme vu sous un microscope à dissection.. Notez les extrémités &quot;moelleuses&quot; (pointes de flèche) et vascularisation fœtale importante qui parcourent les branches de l&#39;arbre sur la gauche qui font de ce morceau adapté à la culture d&#39;organes. (B) La microscopie en immunofluorescence de la culture d&#39;organes (âge gestationnel 8,3 semaines) après l&#39; infection 72 h par la bactérie Listeria monocytogenes, mettant en évidence la charge bactérienne lourde [vert] dans trophoblastes extravilleux. DAPI est représenté en bleu, et ßhCG + syncytiotrophoblastes en rouge. Barres d&#39;échelle = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig3.jpg" /> Figure 3:. Culture d&#39;organes déciduale - brute représentant et images microscopiques [gauche] et decidua capsularis parietalis (A) decidua [droit] à l&#39; âge gestationnel 6 semaines, vue sous un microscope de dissection. Section (B) H &amp; E teinté de culture d&#39;organe de 14,3 semaines l&#39; âge gestationnel decidua montre glandes et vasculature organisés tout au long hétérogène stroma déciduale. Le (diamant, ◆) et l&#39;astérisque (*) soulignent navire représentant et de la glande, respectivement. ligne Brown au bord inférieur est Transwell membrane, sur le bord. (C) H &amp; E tachés section de 14,3 semaines decidua âge gestationnel parietalis culture d&#39;organes au plus haut grossissement demonstrates artérioles spiralées musculaire à parois intégrées dans stroma déciduale. les cellules immunitaires maternelles sont petites et rondes noyaux sombres, et sont irrégulièrement réparties tout au long du stroma. (D) de la microscopie par immunofluorescence de la culture d&#39;organes post - infection 48 h avec L. monocytogenes, mettant en évidence les grandes zones de bactéries [rouges] dans stroma déciduale et CD14 maternelle + macrophages [vert] alignant un espace vasculaire tortueux et dispersés dans le stroma. Barres d&#39;échelle = 1 mm (A), 250 um (B), 50 um (C et D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54237/54237fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Une méthode simple pour établir placentaire primaire humain (villosités) et des cultures d&#39;organes déciduales est décrit. cultures d&#39;organes villosités et déciduales sont des outils précieux pour l&#39;étude de la pathogenèse à l&#39;interface materno-fœtale humaine. L&#39; infection par la bactérie Listeria monocytogenes intracellulaire facultative est démontrée.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

L'objectif général de cette procédure est d'établir des cultures organotypiques primaires humaines du placenta et des décidualis pour l'étude de l'infection à l'interface mère-fœtus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie placentaire et des maladies infectieuses, telles que : où les agents pathogènes franchissent-ils l'interface mère-fœtus pendant la grossesse ? Les principaux avantages de cette technique simple et efficace sont l'utilisation de prélèvements humains frais et le maintien de la structure tissulaire tridimensionnelle dans la culture organique.Cette méthode peut être utilisée pour étudier les infections à l'interface materno-fœtale. Elle peut également être appliquée à d'autres domaines de recherche, comme le développement placentaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le choix du tissu approprié pour la culture est difficile sans connaissance préalable de la micro-anatomie, et c'est le Dr Gabrielle Rizzuto qui présentera cette méthode.En utilisant une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire, remplir les vials de matrice extracellulaire sur de la glace, puis diluer la matrice extracellulaire préalablement réchauffée au ratio un pour un avec du milieu de collecte glacé. Mélanger la suspension à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas induire de bulles. Ensuite, placer des inserts transwell dotés de pores de 0,4 micron dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits, et recouvrir chaque insert de 100 microlitres de la suspension de matrice extracellulaire.Placer la plaque sur de la glace et rincer les échantillons deux fois dans le milieu de collecte, en transférant le tissu vers une boîte de Pétri stérile sous un microscope stéréoscopique après le deuxième lavage. Les échantillons contiennent deux types distincts de tissus déciduaux : la décidue pariétale et la décidue capsulaire. À l’aide de ciseaux et de pinces stériles pour dissection, microdisséquer la décidue pariétale en morceaux de 3 millimètres cubes, en utilisant les pinces pour séparer tout sang maternel coagulé, puis utiliser les pinces pour transférer trois ou quatre morceaux de décidue dans chaque compartiment de transwell.Identifier les villosités bien vascularisées, présentant des colonnes proéminentes de cellules trophoblastiques extravillositaires, et utiliser une pince pour transférer trois ou quatre arbres villositaires dans chaque insert. Ajuster les branches afin que les arbres soient positionnés à plat sur la matrice extracellulaire, et séparer les branches agglomérées. Ajouter ensuite un millilitre de milieu de collecte au fond de chaque puits et incuber les cultures toute la nuit à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone.12 à 16 heures plus tard, ajouter un millilitre du milieu de culture approprié au-dessus de chaque insert transwell. Avant de commencer l'infection, ensemencer une colonie unique de L. monocytogenes provenant d'une boîte de gélose au bouillon cerveau-cœur ensemencée dans trois millilitres de bouillon cerveau-cœur. Incuber la culture toute la nuit en position inclinée à 30 degrés Celsius afin de permettre à la croissance bactérienne d'atteindre une phase stationnaire.Le lendemain matin, utilisez des pinces stériles pour retirer les échantillons de culture d'organes flottants qui ne se sont pas infiltrés dans la matrice extracellulaire et aspirez soigneusement le milieu du fond de chaque insert. Ensuite, pipetez doucement un millilitre de PBS chaud dans les compartiments supérieurs et inférieurs de l'insert, deux fois, en éliminant chaque lavage par aspiration attentive. Après le deuxième lavage, pipetez délicatement un millilitre du milieu approprié dans les compartiments supérieurs et inférieurs de l'insert, en prenant soin de ne pas perturber les cultures d'organes, puis remettez les cultures à l'incubateur pendant une heure.À la fin de l'incubation, remplacez le milieu dans la partie supérieure des inserts par un millilitre d'inoculum, puis replacez les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire afin de favoriser l'invasion bactérienne, en renouvelant quotidiennement tout le milieu de chaque puits. Pour les cultures d'organes villositaires, il est essentiel de disséquer uniquement les branches villositaires placentaires qui se terminent par des colonnes de cytotrophoblaste extravillositaire bien vascularisées, de type duveteux ou flou. En revanche, les arbres villositaires dont la vascularisation et les cytotrophoblastes extravillositaires ne sont pas facilement visibles sont suboptimaux pour la culture.L'analyse d'une culture d'organes villositaires 72 heures après infection par Listeria monocytogenes montre une charge bactérienne importante dans les cytotrophoblastes extra-villositaires, ainsi qu'une relative absence de bactéries au sein de la couche de syncytiotrophoblastes tapissant l'arbre villositaire. Pour les cultures d'organes déciduaux, il est important de savoir que les échantillons provenant du début de la grossesse consistent principalement en décidue capsulaire, facilement identifiable par sa nature mince et membraneuse, et en décidue pariétale, qui est éliminée par découpage comme indiqué et utilisée pour les cultures. La coloration HES de cultures organoïdes déciduales incluses en paraffine révèle des glandes bordées d'épithélium et une vascularisation bordée d'endothélium, positionnées de manière hétérogène au sein du compartiment stromal décidual.48 heures après l'infection, les macrophages positifs pour le CD-14 se localisent près de la vascularisation et se dispersent dans tout le stroma décidual, tandis que de grands agrégats de Listeria monocytogenes s'accumulent principalement au sein du stroma. Une fois maîtrisée, la mise en place des cultures d'organes peut être réalisée en moins de 60 minutes par prélèvement, si elle est correctement préparée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir l'asepsie dans la hotte de culture cellulaire et lors du travail au microscope stéréoscopique.Après leur préparation, ces cultures d'organes peuvent être infectées par les agents pathogènes bactériens, fongiques ou viraux pertinents d'intérêt, afin de répondre à des questions supplémentaires sur les types cellulaires les plus vulnérables à l'infection. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux microbiologistes pour explorer la pathogenèse des infections placentaires causées par des agents pathogènes cliniquement pertinents tels que Listeria monocytogenes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'établir des cultures organotypiques déciduales et villositaires sur des inserts de culture tissulaire en transwell, recouverts de matrice extracellulaire.

human-placental-decidual-organ-cultures-to-study-infections-at

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre l’établissement de cultures primaires d’organes placentaires, villositaires et déciduals humains dans des conditions ex vivo. Ces modèles sont bien adaptés à l’étude de la pathogenèse à l’interface mère-fœtus humain.

Établissement de cultures d’organes villeux et déciduals en tant que modèles ex vivo de l’interface mère-fœtus humaine

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir un modèle d’infection dans les tissus placentaires pour étudier la propagation de l’infection. Une culture d’organe placentaire ex vivo est infectée par Listeria monocytogenes, un parasite intracellulaire facultatif. Les bactéries envahissent les trophoblastes extravilleux (TEV) pour pénétrer dans le tissu placentaire, puis se propagent à d’autres cellules par propagation de cellule à cellule.

Technique permettant d’établir un modèle d’infection bactérienne dans une culture d’organe ex vivo

décrit ici un protocole pour isoler et approfondir l’étude des leucocytes infiltrants de la décidua basalis et de la decidua parietalis - l’interface mère-fœtus humaine. Ce protocole maintient l’intégrité des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, comme le prouve l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

décrit ici est un protocole permettant d’isoler et d’analyser les leucocytes infiltrants des tissus à l’interface mère-fœtus (utérus, décidua et placenta) des souris. Ce protocole maintient l’intégrité de la plupart des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, y compris l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.

Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

Voici un protocole pour la culture d’explants placentaires dans des conditions de débit constant. Cette approche améliore les systèmes traditionnels de culture de villes statiques en permettant la réplication d’environnements physiologiques dynamiques.

Ex Vivo Culture en flux d’explants placentaires - Imiter les conditions dynamiques in utero

Ce protocole décrit la préparation d’explants de tissu placentaire humain cultivés à une interface air-liquide pour l’étude des infections virales.

Ex vivo Culture d’explants placentaires humains pour l’étude de la transmission virale à travers l’interface mère-fœtale

La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection.

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei</i

Neisseria meningitidis est un agent pathogène humain spécifique qui infecte les vaisseaux sanguins. Dans ce protocole, les microvaisseaux humains sont introduites dans une souris par greffage de peau humaine sur les souris immunodéprimées. Les bactéries adhèrent largement aux navires humains, entraînant des dommages et le développement vasculaire du purpura généralement observée dans des cas humains.

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Découvrez comment établir des cultures d'organe placentaire et déciduale humaine pour étudier les infections à l'interface materno-fœtale. Cette méthode préserve la structure tissulaire tridimensionnelle et permet d'observer l'invasion par Listeria monocytogenes.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l'étude des infections à l'interface materno-fœtale

Explorer plus de vidéos