Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l'étude des infections à l'interface materno-fœtale

L’objectif global de cette procédure est d’établir des cultures primaires de placenta humain et d’organes déciduals pour l’étude de l’infection de l’interface mère-fœtus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie placentaire et des maladies infectieuses, telles que : où les agents pathogènes traversent-ils l’interface mère-fœtus pendant la grossesse ? Les principaux avantages de cette technique simple et efficace sont l’utilisation d’échantillons humains frais et le maintien de la structure tissulaire tridimensionnelle dans la culture d’organes.

Cette méthode peut être utilisée pour étudier les infections à l’interface mère-fœtus. Il peut également être appliqué à d’autres domaines de recherche, tels que le développement placentaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la sélection des tissus appropriés pour la culture est difficile, sans connaissance préalable de la micro-anatomie, et la démonstration de cette méthode sera faite par le Dr Gabrielle Rizzuto.

À l’aide d’une technique stérile dans une hotte de culture de tissus, remplissez des flacons de matrice extracellulaire sur de la glace, puis diluez la matrice extracellulaire réchauffée à l’aide d’un milieu de collecte glacé. Mélangez la suspension avec le pipetage, en prenant soin de ne pas induire de bulles. Ensuite, placez des inserts trans-puits avec des pores de 0,4 micron dans les puits individuels d’une plaque de culture tissulaire à six puits, et enduisez chaque insert de 100 microlitres de suspension de matrice extracellulaire.

Placez la plaque sur de la glace et rincez les échantillons deux fois dans un milieu de collecte, en transférant le tissu dans une boîte de Pétri stérile sous un microscope de dissection après le deuxième lavage. Les spécimens contiennent deux types distincts de tissus déciduals, le decidua parietalis et le decidua capsularis. À l’aide de ciseaux de dissection à ressort stérile et de pinces, micro-disséquez le decidua parietalis en morceaux de 3 millimètres cubes, en utilisant les forcepts pour extraire tout sang maternel coagulé, et utilisez des pinces pour transférer trois ou quatre morceaux de decidua dans chaque puits trans.

Identifiez les villosités bien vascularisées, avec des colonnes de cellules trophoblastiques extra-villositaires proéminentes et utilisez des pinces pour transférer trois ou quatre villositaires dans chaque puits trans. Ajustez les branches de manière à ce que les arbres soient positionnés à plat au sommet de la matrice extracellulaire et séparez les branches agglomérées. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de collecte au fond de chaque puits et incubez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

12 à 16 heures plus tard, ajoutez un millilitre du milieu de culture approprié au sommet de chaque puits trans. Avant de commencer l’infection, inoculez une seule colonie de L. monocytogenes à partir d’une plaque de gélose de perfusion cerveau-cœur striée dans trois millilitres de bouillon de perfusion cerveau-cœur. Incuber la culture pendant la nuit dans une position inclinée à 30 degrés Celsius pour permettre à la croissance bactérienne d’atteindre une phase stationnaire.

Le lendemain matin, utilisez une pince à épiler stérile pour retirer tous les morceaux de culture d’organe flottants qui n’ont pas envahi la matrice extracellulaire et aspirez soigneusement le milieu du fond de chaque puits trans. Ensuite, pipetez doucement un millilitre de PBS chaud dans les puits supérieurs et inférieurs deux fois, en retirant chaque lavage avec une aspiration soigneuse. Après le deuxième lavage, pipetez doucement un millilitre du milieu approprié vers les puits supérieurs et inférieurs, en prenant soin de ne pas perturber les cultures d’organes et remettez les cultures dans l’incubateur pendant une heure.

À la fin de l’incubation, remplacez le milieu dans le haut des trans-puits par un millilitre d’inoculum, et replacez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pour faciliter l’invasion bactérienne, en remplaçant tout le milieu dans chaque puits tous les jours. Pour les cultures d’organes villeux, il est essentiel de disséquer uniquement les branches villeuses placentaires qui se terminent par des colonnes trophoblastiques extra-villeuses bien vascularisées et duveteuses ou floues. En revanche, les arbres villeux avec une vascularisation difficile à visualiser et des trophoblastes extra villeux sont sous-optimaux pour la culture.

L’analyse d’une culture d’organe villeux 72 heures après l’infection à Listeria monocytogenes révèle une forte charge bactérienne dans les trophoblastes extra-villeux et une absence relative de bactéries dans la couche syncytiotrophoblastique du revêtement de l’arbre. Pour les cultures d’organes déciduals, il est important de savoir que les spécimens de gestation précoce sont en grande partie constitués de decidua capsularis, qui se distingue facilement par sa nature mince et membraneuse, et de decidua parietalis, qui est taillé comme démontré et utilisé pour les cultures. La coloration H et E de la culture d’organes déciduals intégrés à la paraffine révèle des glandes épithéliales doublées et un système vasculaire endothélial positionnés de manière hétérogène dans le compartiment des cellules stromales déciduales.

48 heures après l’infection, les macrophages CD-14 positifs se localisent près du système vasculaire et se dispersent dans le stroma décidual, tandis que de grands agrégats de Listeria monocytogenes se regroupent principalement dans le stroma. Une fois maîtrisées, les cultures d’organes peuvent être établies en moins de 60 minutes par spécimen si elles sont préparées correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la stérilité dans le capuchon de culture tissulaire et pendant le travail au microscope de dissection.

Après leur préparation, ces cultures d’organes peuvent être infectées par les agents pathogènes bactériens, fongiques ou viraux d’intérêt pertinents, afin de répondre à des questions supplémentaires sur les types de cellules les plus vulnérables à l’infection. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux microbiologistes pour explorer la pathogenèse des infections placentaires avec des agents pathogènes cliniquement pertinents tels que Listeria monocytogenes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir des cultures d’organes déciduales et villeuses sur des inserts trans-puits de culture tissulaire recouverts de matrice extracellulaire.