Purification de l'ensemble du génome de l'ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Purification à l'échelle du génome de l'ADN circulaire extrachromosomique à partir de cellules eucaryotes. Bonjour, je suis Rasmus. Ici, je vais présenter l'ensemble du plan de la méthode de purification de l'ADN circulaire.

Dans la première partie, les cellules de levure sont cultivées et récoltées. Ensuite, l'ADN circulaire est purifié et amplifié en trois étapes. Premièrement, par séparation sur colonne, au cours de laquelle les cercles d'ADN sont purifiés et enrichis.

Ensuite, par traitement de l'ADN avec une exonucléase afin de dégrader tout l'ADN linéaire restant, puis finalement par amplification des cercles d'ADN à l'aide de la polymérase phi-29. Dans la cinquième partie de ce protocole, les cercles d'ADN sont séquencés et les lectures sont alignées sur le génome de référence de Saccharomyces cerevisiae. À la fin de cette vidéo, nous vous montrerons quelques résultats représentatifs.

Nous discuterons des perspectives pour les études futures et des avantages liés à l'utilisation de cette méthode. Partie un, récolte des cellules. La culture initiale est cultivée à 30 degrés sous agitation jusqu'à la densité maximale, soit environ 200 millions de cellules par millilitre, atteinte après 24 à 48 heures.

Le culot issu de la culture est transféré dans un tube Falcon et centrifugé pendant trois minutes. Le surnageant est éliminé. Le gros culot est vortexé dans du tampon TE et re-centrifugé.

Deuxième partie, purification sur colonne. Dans cette étape, nous utilisons un kit de purification sur colonne disponible dans le commerce, qui permet d'obtenir des plasmides hautement purifiés à partir d'ADN bactérien génomique. Avant d'utiliser ce kit avec des levures, il est nécessaire de rompre la paroi cellulaire.

Cela se fait en resuspendant le culot cellulaire lavé dans le tampon L-1 du kit. La suspension cellulaire est transférée dans un tube de microcentrifugeuse et des billes de verre sont ajoutées jusqu'à un tiers du volume total. L'échantillon est vortexé à vitesse maximale pendant 10 minutes, puis les billes sont éliminées par centrifugation à 2 000 tours par minute pendant 30 secondes.

Le surnageant est transféré dans un nouveau tube. Dans cette méthode, nous ajoutons des plasmides fortement dilués au surnageant selon trois rapports différents. Nous proposons d'inclure le plasmide fortement dilué dans le cycle.

Cela peut servir de guides de référence internes. Vous pouvez utiliser cela pour vérifier la qualité de votre purification et amplification d'ADN, ainsi que pour effectuer une estimation semi-quantitative des ADN non circulaires par cellule à l'aide de ces plasmides d'ajout. Seuls des plasmides fortement dilués doivent être ajoutés, car ils pourraient nuire à la résolution de séquence des autres ADN circulaires.

La suspension cellulaire contenant les plasmides ajoutés est traitée avec la solution L-2 du kit et le protocole du kit est suivi. Après chargement sur la colonne, les protéines, les lipides et l'ADN chromosomique sont éliminés par deux lavages de la colonne. L'ADN circulaire extrachromosomique est fortement enrichi dans la fraction éluée.

Partie trois, digestion de l'ADN linéaire. Dans cette étape, nous utilisons une exonucléase pour digérer l'ADN linéaire restant. Une exonucléase dépendante de l'ATP cible spécifiquement l'ADN double brin et simple brin linéaire sans digérer l'ADN circulaire.

La spécificité de l'exonucléase pour l'ADN linéaire a été confirmée par électrophorèse sur gel après 29 heures de traitement par la DNase. Les résultats montrent que l'ADN génomique est digéré tandis que l'ADN plasmidique reste intact, comme indiqué par la flèche rouge. La levure contient 16 chromosomes, pouvant atteindre 1 500 kilobases de longueur.

Afin de faciliter la digestion par l'exonucléase, une endonucléase à site de coupure rare est utilisée pour obtenir un nombre accru d'extrémités d'ADN accessibles. Lorsqu'on utilise l'enzyme de restriction NotI, chaque chromosome est coupé jusqu'à sept fois, comme indiqué. L'ADN purifié par colonne est traité avec NotI à 37 degrés dans un bloc chauffant pendant toute la nuit.

Après l'inactivation thermique de NotI, l'ADN coupé est traité avec des exonucléases à 37 degrés selon le protocole du fabricant. Après le traitement par exonucléase, les enzymes sont inactivées thermiquement à 70 degrés pendant 30 minutes. Plusieurs jours peuvent être nécessaires pour digérer tout l'ADN chromosomique linéaire grâce à un supplément d'ATP et d'exonucléase. Afin de s'assurer que tout l'ADN linéaire est complètement digéré, les échantillons sont analysés par des méthodes de PCR ou de qPCR en utilisant un gène de référence interne tel que ACTI.

Quatrième partie, amplification de l'ADN. À cette étape, nous enrichissons et amplifions l'ADN circulaire à l'aide de la polymérase phi-29. La réaction a lieu à 30 degrés en utilisant des oligonucléotides hexamères aléatoires et la polymérase phi-29.

La polymérase possède une grande fidélité et une activité de correction, assurant une amplification de l'ADN sans biais. Chaque polymérase peut, par la réplication en cercle roulant, synthétiser jusqu'à 100 kilobases d'ADN. La polymérase est également très processive, amplifiant l'ADN jusqu'à 10 puissance 9 fois.

Partie cinq, séquençage. Conformément au protocole d'une plateforme de séquençage haut débit de nouvelle génération, l'ADN est soniqué jusqu'à une taille moyenne de 300 paires de bases et séquencé en lectures simples de 141 nucléotides. Les lectures de séquence sont alignées sur le génome de référence de Saccharomyces cerevisiae à l'aide de la base de données gratuite Galaxy.

Les données séquencées sont téléchargées vers Galaxy et les lectures sont alignées à l'aide de l'aligneur de courtes lectures Bowtie2, qui permet l'alignement de lectures partielles. Partie six, résultats représentatifs. Après le séquençage et l'alignement sur le génome de référence de Saccharomyces cerevisiae, les lectures peuvent être visualisées dans le navigateur de génome intégré au logiciel Galaxy.

L'ADN d'origine circulaire peut, par exemple, être comptabilisé comme des régions contenant des lectures cohérentes supérieures à un kilobase, tel qu'indiqué à l'écran. Un exemple de région sur le chromosome quatre contenant des lectures cohérentes s'étendant sur plus d'un kilobase est la région comprenant les gènes des transporteurs d'hexose six et sept. Lorsque cette méthode est appliquée à une population de cellules de levure, des lectures cartographiées sont fréquemment observées à ce locus, et la couverture des lectures suggère clairement la formation d'un cercle d'ADN entre les gènes paralogues des transporteurs d'hexose.

En raison de la forte homologie de séquence entre les gènes des transporteurs d'hexoses, nous proposons que la recombinaison homologue illicite entraîne la circularisation de cet ADN. Le modèle de mutation de l'ADN circulaire se produit lorsque le processus de réparation de l'ADN fonctionne de manière imparfaite. Par exemple, si une cassure double brin survient dans un élément répétitif, la séquence homologue située sur le même chromatide peut être utilisée comme matrice pour la réparation de l'ADN par recombinaison homologue.

Après la résection, l'insertion de brin, la synthèse d'ADN et la résolution de toutes les jonctions, un cercle d'ADN peut se former à partir du génome, entraînant une délétion d'ADN sur le chromosome. Les effets du traitement de l'ADN par les exonucléases et la polymérase phi-29 peuvent être visualisés à l'aide de la coloration par iodure de propidium. Les témoins colorés de l'ADN génomique apparaissent comme sur l'image de gauche, tandis que l'ADN plasmidique apparaît comme sur l'image de droite.

Après 29 heures de traitement par exonucléase de 400 nanogrammes d'ADN génomique, la majorité de l'ADN est digérée, comme indiqué sur l'image de gauche. Ce résultat est confirmé par électrophorèse sur gel, tel que montré sur l'image du gel à droite. Après 72 heures de traitement par exonucléase suivies de la synthèse d'AD par la polymérase phi-29, des millions de copies d'ADN peuvent encore être identifiées.

De même, après 29 heures de traitement par exonucléase de 400 nanogrammes d'ADN génomique, additionnés de 100 nanogrammes supplémentaires d'ADN plasmidique, la majorité de l'ADN génomique est digérée. Toutefois, l'ADN plasmidique n'est pas digéré, comme l'indique l'image sur gel. Après traitement par la polymérase phi-29 de l'échantillon soumis à 72 heures de traitement exonucléase, la majeure partie de l'ADN amplifié apparaît sous forme de plasmides colorés.

Nous avons donc d'abord criblé les gènes à la recherche d'ADN circulaire et nous avons été très surpris de découvrir plusieurs centaines de types différents d'échantillons d'ADN. Oui, il était vraiment surprenant de constater à quel point les ADN circulaires sont courants dans la population de levures, et nous pensons que cette méthode peut être utilisée pour de nombreux types d'études. Évidemment, l'une d'elles consisterait à examiner des tissus humains.

Nous savons que des gènes peuvent être amplifiés sur des éléments acirculaires, chez la levure bien sûr, mais aussi dans les cellules tumorales. Je pense qu'il sera en général intéressant d'examiner les cellules somatiques et d'analyser quel type d'ADN circulaire nous allons y découvrir, ainsi que la manière dont cet effet pourrait intervenir. Lors du vieillissement cellulaire, nous observons une accumulation de cercles à mesure que l'âge avance, et nous nous attendons à trouver davantage de gènes localisés sur l'ADN circulaire.

En outre, nous souhaitons examiner les mécanismes moléculaires de la circularisation de l'ADN. Une approche évidente consiste à étudier la levure, où nous disposons de mutants présentant des défauts dans la recombinaison homologue et la recombinaison non homologue. En analysant ces mutants, nous nous attendons à ce que le profil de circularisation de l'ADN diffère selon les types de mutants. Espérons-le, grâce à ces études sur la levure, nous pourrons approfondir nos connaissances sur la circularisation de l'ADN. Par rapport à d'autres méthodes, celle-ci est nettement plus sensible et pourrait permettre de détecter effectivement un cercle d'ADN dans environ une cellule sur 10 000.

Et pour autant que je sache, d’après des études issues d’un essai mené de façon approfondie, les allèles mutants doivent normalement atteindre une proportion comprise entre 1 et 10 % de la population avant de pouvoir être détectés. Exactement, et grâce à cette technique, vous n’avez pas besoin de connaissances préalables sur les cercles d’ADN formés, contrairement à d’autres méthodes où les cercles d’ADN doivent être partiellement liés, ce qui permet ensuite de les détecter facilement comme des amplifications par séquençage ou par coloration chromosomique.

Oui, donc je suppose que le principal avantage réside vraiment dans la sensibilité, et j'espère que nous pourrons faire beaucoup de choses intéressantes avec cette méthode.