Name: Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez la microinjection de néphrotoxines chez le zebrafish pour modéliser les lésions rénales aiguës. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des dommages cellulaires et de la régénération rénale chez Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu en partie par la subvention DP2OD008470 NIH. En outre, la RAM a été soutenu en partie par des fonds fournis par l&#39;Université de Graduate School Notre-Dame. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques, le Centre de recherche Zebrafish, et le Centre pour les cellules souches et la médecine régénérative à l&#39;Université de Notre Dame. Nous remercions tout particulièrement les membres du laboratoire pour engager des discussions sur les reins biologie et leurs commentaires utiles sur ce travail.

Les procédures pour travailler avec des embryons de poisson zèbre décrits dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux à l&#39;Université de Notre Dame. 1. Préparation des solutions <ol><li> Faire une solution 50x stock de E3 médias d&#39;embryons en mélangeant 73,0 g NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl 2, et 9,95 g MgSO 4 à 5 litres d&#39;eau distillée, et conserver à la température ambiante. </li><li> Pour la culture des embryons de poisson zèbre, diluer la solution 50x stock de E3 médias d&#39;embryons disponibles à une solution de travail 1x avec de l&#39;eau distillée, puis ajouter 200 pi de 0,05% de bleu de méthylène à chaque 1 L de 1x E3 à agir comme un fongicide, et conserver à TA. </li><li> Faire une solution de pigmentation de blocage de l&#39;E3 médias d&#39;embryons avec 0,003% de 1-phényl-2-thiourée (PTU) en combinant 40 ml de 50x E3 actions avec 0,06 mg PTU. Ensuite, porter le volume à un total de 2 L avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Agiter le O E3 / PTU / N à la température ambiante pour obtenir la poudre PTU en solution. Puis stocker l&#39;E3 / PTU àTA. Note: L&#39;E3 / PTU a une durée de vie d&#39;environ une semaine, et des solutions plus âgés seront moins efficaces pour bloquer le développement de la pigmentation chez les larves de poisson zèbre. </li><li> Préparer une solution anesthésique de 0,2% tricaïne (MS-222) en ajoutant 1 g de tricaïne à 500 ml d&#39;eau distillée et d&#39;ajuster le pH à 7,2 avec 1 M de Tris, pH 9,5. </li><li> Préparer pour préparer une solution de méthylcellulose à 2% pour l&#39; imagerie en plaçant une solution de 1 x E3 (pas de bleu de méthylène), avec 1/10 volume de 0,2% Tricaine ajouté à 4 ° C. Remarque: La solution méthylcellulose est une solution épaisse, claire qui est utilisée pour stabiliser doucement embryons vivants pour la microscopie. Après les manipulations sont effectuées les embryons peuvent être lavés dans 1x E3 pour dissoudre le méthylcellulose sans blesser l&#39;animal et permettant la microscopie à des stades ultérieurs dans le même échantillon. </li><li> Une fois refroidi à 4 ° C, agiter la solution 1x E3 / Tricaine vigoureusement sur une plaque d&#39;agitation et ajouter graduellement la quantité appropriée de méthylepoudre de cellulose tout en continuant à remuer vigoureusement. ajouter graduellement la poudre à la solution pour empêcher la formation d&#39;agrégats insolubles de méthylcellulose. </li><li> Après tout, la poudre est mélangée dans la solution de méthylcellulose / E3 / tricaïne de 2%, agiter la solution composite dans le 4 ° C chambre froide O / N. Remarque: La température froide est préférable pour dissoudre complètement la poudre. Si la solution est pas claire après une nuit, agiter pendant une journée de travail supplémentaire et / ou une seconde O / N. </li><li> Pour éliminer les bulles d&#39;air de la méthylcellulose à 2% / solution / de tricaïne E3, aliquote le mélange dans 1,5 ml tubes et essorage à grande vitesse (12 000 xg) à 4 ° C pendant 30 min ou jusqu&#39;à 2 heures. </li><li> Placer la solution / E3 / Tricaine de méthylcellulose à 2% à 4 ° C pour une conservation à long terme. Note: Avant l&#39;utilisation, des aliquotes doivent être pré-chauffé à la température ambiante pour travailler avec les échantillons de poisson zèbre. </li></ol> 2. Préparation des outils <ol><li> Préparer un outil embryon manipulateur, utilisé pour popositionne- embryons pour la microinjection, en attachant une pointe de chargement de gel à l&#39;extrémité d&#39;une aiguille droite de dissection 5 &quot;, et le fixer avec du ruban adhésif ou superglue. </li><li> Préparer des aiguilles de microinjection à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguille, en plaçant d&#39;abord un feu brillant 10 cm en verre borosilicate avec des filaments dans l&#39;instrument et fixer le verre borosilicate en serrant les poignées. </li><li> Tirez le verre borosilicate à la mode des aiguilles fines effilées. Utilisez les paramètres suivants: la chaleur 540, tirer 245, vitesse 200, et le temps 125. </li><li> La place des aiguilles à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri, de les suspendre sur une bande de pâte à modeler pour protéger les pointes d&#39;aiguille, et de garder le plat couvert pour éviter l&#39;accumulation de poussière. </li><li> Pour terminer la préparation de l&#39;aiguille pour microinjections, utilisez un bord de lame de rasoir ou une pince fine pour couper l&#39;extrémité tirée de l&#39;aiguille pour créer une pointe d&#39;injection angulaire forte avec un diamètre d&#39;environ 0,05-0,1 mm. </li><li> Pour rendre le plateau de micro-injection, préparer une solution à 1,5% d&#39;agarose / E3 dans un 100 ml Erlenmeyer de et dissoudre l&#39;agarose en chauffant l&#39;E3 à ébullition dans un four micro-ondes puis laisser refroidir à température ambiante pendant environ 10 min. </li><li> Verser la solution d&#39;agarose / E3 refroidi dans une boîte de Pétri pour faire une fondation avec une profondeur d&#39;environ 0,5 cm. Lorsque cela est solidifiée verser une seconde couche ayant une profondeur d&#39;environ 0,3 cm et insérer le moule préfabriqué embryon de puits et permettre l&#39;agarose se solidifie à température ambiante. Remarque: Lors de l&#39;introduction du moule dans la couche / E3 supérieure d&#39;agar, en plaçant le moule dans la gélose à un angle pour diminuer le nombre de bulles d&#39;air. </li><li> Lorsque l&#39;ensemble du plateau de microinjection a mis, soulever l&#39;embryon préfabriqué et la moisissure lentement et avec précaution en utilisant un scoopula, puis remplir le plat avec une solution E3 et conserver à 4 ° C. </li></ol> 3. Embryo Préparation <ol><li> Mettre en place des réservoirs d&#39;accouplement de poisson zèbre en plaçant des séparateurs dans des chambres d&#39;accouplement et remplir avec de l&#39;eau du système. </li><li> Placer un poisson de chaque côté du diviseur deuch que chaque chambre d&#39;accouplement contient une femelle et un poisson mâle, et couvrir chaque chambre d&#39;accouplement. </li><li> Le lendemain matin, enlever les diviseurs pour permettre la ponte. </li><li> Vérifiez le poisson au bout d&#39;environ 30 minutes, et après le retour des adultes à l&#39;aquarium, de recueillir leurs embryons en faisant passer l&#39;eau du réservoir d&#39;accouplement à travers un outil de crépine fil-maille fine. </li><li> Inversez la crépine sur une boîte de Pétri et rincer à l&#39;E3 pour recueillir les embryons. </li><li> Incuber les embryons à 28,5 ° CO / N. </li><li> Lorsque les embryons ont atteint le stade 24-26 somites 26, transvaser la plupart des médias E3 puis dechorionate en ajoutant 100 pi de 50 mg / ml de pronase à chaque plat d&#39;embryons et l&#39; incubation du plat à température ambiante (23 ° C) pendant environ 15 min. Remarque: Il faudra environ 24-25 heures à partir du moment de la fécondation pour les embryons atteignent le stade 24-26 somites si elles sont recueillies de la manière décrite et incubé O / N à 28,5 ° C. </li><li> Remplissez le plat avecE3 puis agiter doucement pour déloger les chorions des embryons. </li><li> Décanter le E3 / pronase et rincer le plat avec 25 ml d&#39;E3 frais. Répétez l&#39;étape de rinçage pour éliminer tous les pronase. </li><li> Pour bloquer le développement de la pigmentation, transvaser l&#39;E3 et le remplacer par 25 ml de frais E3 / PTU lorsque les embryons ont atteint 24 heures après la fécondation. Remarque: Pour des expériences sur plusieurs jours, remplacer la solution E3 / PTU avec un milieu frais une fois par jour pour garder le plat propre. </li></ol> 4. microinjection de Solution néphrotoxine <ol><li> Le jour de l&#39;injection, la préparation de la solution de néphrotoxine souhaitée avec la commande d&#39;un véhicule approprié. </li><li> Vortex ou mélanger doucement pour assurer la drogue (s) est / sont en solution, en vérifiant les côtés du tube et le haut de la colonne d&#39;eau. Remarque: Les solutions de néphrotoxine peuvent être préparés pour contenir des quantités infimes de dextran conjugué fluorescence pour surveiller l&#39;efficacité de microinjection et également évaluer la clairance rénale au subseqsouligne le temps uent 20,28. </li><li> Chargez une aiguille de microinjection garnie de ~ 2-3 pi du néphrotoxine en enfilant une pointe de chargement de gel fine dans le dos de l&#39;aiguille et de suspendre l&#39;aiguille verticalement avec un morceau de ruban adhésif pour permettre à la solution pour remplir la pointe de l&#39;aiguille taillée par gravité. </li><li> Une fois que la pointe de l&#39;aiguille est plein, fixer l&#39;aiguille chargée dans le micromanipulateur. </li><li> Tester le volume de micro-injection en plaçant une goutte d&#39;huile minérale sur un micromètre et injecter dans l&#39;huile pour évaluer la taille des gouttelettes. Un volume d&#39;injection de 500 pl a un diamètre de 0,1 mm. </li><li> Retirer le plat d&#39;embryons de l&#39;incubateur, et anesthésier en ajoutant environ 5 ml de 0,2% Tricaine à l&#39;antenne de l&#39;embryon. </li><li> Pour assurer une anesthésie complète, toucher doucement l&#39;embryon avec la pointe de l&#39;outil embryon manipulateur. Le manque de mouvement indique anesthetization suffisante. </li><li> Après anesthésie réussie, transférer les embryons dans le moule d&#39;injection avec un transfer pipette. </li><li> Manœuvrer chaque embryon dans un puits différent du moule placer la tête dans la zone la plus profonde du puits de telle sorte que le tronc repose le long de la dépression et la queue colle jusqu&#39;à sortir de la dépression. </li><li> Insérez l&#39;aiguille remplie dans le micromanipulateur et positionner la pointe de l&#39;aiguille à côté d&#39;un embryon. </li><li> Insérez délicatement l&#39;aiguille dans le récipient de queue en déplaçant la manette vers l&#39;avant et appuyer sur la pédale pour fournir la microinjection. Remarque: l&#39;injection réussie peut être mesurée en observant le liquide entrer circulation. En outre, la co-injection du dextran nephrotoxicant conjugué fluorescent permet au chercheur de vérifier l&#39;injection avec succès à la suite de la procédure. </li><li> Tirez doucement sur la manette pour retirer l&#39;aiguille de l&#39;embryon. </li><li> Après l&#39;injection, transférer les embryons à un plat propre et rincer pour enlever le Tricaine et remplacer avec des produits frais E3 / PTU. </li><li> Incuber l&#39;embryon jusqu&#39;au point de temps souhaité pour évaluers morphologie, qui peut être documenté par la photographie dans un milieu de montage de la méthylcellulose, ou un procédé pour l&#39;analyse expérimentale comme souhaité. Remarque: La récupération des embryons doit être évaluée afin de déterminer le pourcentage de personnes ayant un oedème, qui indique généralement une lésion rénale. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un nombre varié d&#39;agents thérapeutiques ont été associés à AKI 29. Il y a eu des progrès importants travaux de recherche dans la compréhension des dommages induits par de nombreux composés individuels, tels que la gentamicine aminoglycoside 30 et le cisplatine chimiothérapeutique largement utilisé 31,32. Certains changements pathologiques impliqués dans ces conditions, cependant, restent l&#39;objet d&#39;une étude en cours. Un défi émergent reste à comprendre comment de multiples mé...

AKI est une perte soudaine de la fonction rénale qui peut conduire à des conséquences dévastatrices sur la santé 1. AKI est un important problème de santé dans le monde entier en raison de sa forte incidence d&#39;environ 20% chez les patients hospitalisés, avec des taux encore plus élevés de 30-50% dans les cas de soins intensifs et les personnes âgées, et les taux de 50-70% 1-3 de mortalité. Malheureusement, la prévalence de l&#39;AKI a augmenté et devrait grimper encore au cours de la prochaine décennie, en partie à cause de la diversité des facteurs qui peuvent induire des AKI, qui comprennent le stress post-opératoire, l&#39;ischémie, et l&#39;exposition à néphrotoxines tels que les antibiotiques et des médicaments chimiothérapeutiques 4. Insuffisance rénale aiguë implique des lésions cellulaires soudaine dans le rein, se produisant fréquemment dans néphrons, qui sont les unités fonctionnelles essentielles, et sont constitués d&#39;un filtre à sang et un tube segmentée qui draine l&#39; urine dans les conduits collecteurs centraux 1. Quand un nombre important de néphrons sontendommagé pendant AKI, les effets immédiats comprennent une interruption de la clairance des déchets de la circulation, et l&#39; écoulement de fluide réduite ou abrogée par néphrons en raison de l&#39; obstruction de morts et mourants cellules 1. Au fil du temps, l&#39; obstruction tubulaire peut conduire à une dégénérescence des néphrons entières, ce qui réduit de façon permanente la fonction rénale 1. Altérations physiologiques dans le rein suivantes AKI impliquent également des événements inflammatoires complexes qui peuvent conduire à la cicatrisation chronique 1. En dépit de ces résultats, les néphrons ont une certaine capacité à subir la régénération après AKI qui reconstitue l&#39;épithélium tubulaire 5,6. Bien qu&#39;il y ait eu une compréhension moléculaire croissante des néphrons régénération, les mécanismes restent insaisissables à bien des égards et nécessitent la poursuite des recherches 7. Le degré auquel les résultats AKI dans les lésions rénales permanentes reste également inconnu. Les recherches actuelles suggèrent le potentiel de régénération pour le rein est lele plus élevé suivant les cas moins graves de AKI, alors que les épisodes plus prononcés ou répétées conduisent à une maladie rénale chronique (CKD) et aboutir à phase terminale de maladie rénale (STIR) qui nécessite une transplantation ou une dialyse 8,9 sauver la vie. En outre, les personnes souffrant déjà de CKD sont à un risque encore plus élevé de contracter un épisode sévère de AKI 8,9. Pris ensemble, il est clair que la poursuite de la recherche fondamentale et clinique est essentiel de comprendre, traiter et prévenir AKI. La recherche avec des modèles animaux a joué un rôle dans l&#39; appréciation de la progression des altérations locales et environnementales qui se produisent pendant AKI 10. Pour développer cette compréhension ainsi que de développer de nouvelles thérapies, le modèle animal zebrafish a été utilisé dans une variété de façons 11,12. Les néphrons du rein zebrafish, à la fois dans l&#39;embryon et l&#39; adulte, présentent un degré élevé de conservation des mammifères 13-16. En outre, une lésion épithéliale néphron dans zebrafish ressemble au processus chez les vertébrés supérieurs, de sorte que la destruction locale de cellules tubulaires est suivie par une prolifération intratubulaire et le rétablissement de l&#39; architecture des néphrons 17-19. Dans l&#39;embryon, cependant, d&#39; importants dégâts tubule des néphrotoxines comme le cisplatine est associé à létalité 20,21. Par comparaison, les adultes survivent AKI poisson zèbre et présentent des capacités de régénération de fond dans le rein. Par exemple, suite à une exposition à l&#39;antibiotique gentamicine aminoglycoside, zebrafish régénérer tubule lésions épithéliales et développer de nouvelles unités de néphrons ainsi 22-24. Bien que ces études AKI induite par la gentamicine ont fourni des renseignements précieux, la compréhension des lésions rénales à partir de divers néphrotoxines reste critique pour apprécier les effets et la réponse aux différents types de dommages 25. L&#39;embryon de poisson zèbre, en raison de sa taille, la transparence et la traçabilité génétique, présente de nombreux avantages pour les études de néphrotoxine &lt;sup&gt; 25, où la méthode de microinjection 20,21 est utilisé pour administrer la molécule (s) pour enquête. Néphrons sont formés par 24 heures après la fécondation (HPF) et commencent à filtrer le sang d&#39;environ 48 HPF 26,27. Ainsi, la formation rapide et la fonction du rein embryonnaire facilite l&#39;analyse expérimentale. Cependant, le processus de microinjection a des défis techniques et il peut y avoir une courbe d&#39;apprentissage abrupte à la maîtrise de la technique. Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment effectuer microinjections et de fournir des conseils de dépannage afin d&#39;améliorer le taux d&#39;injections réussies.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>American Bioanalytical AB00366</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes flamboyant/brun</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Boîtes de Pétri jetables, stériles, Corning :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;( plateau de micro-injection) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur basse température</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler micro-dissectrice</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>Micromètre <td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Référence 2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

néphrotoxine microinjection dans zebrafish au modèle lésion rénale aiguë

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Les reins sont susceptibles de nuire à l&#39;exposition aux produits chimiques qu&#39;ils filtrent de la circulation sanguine. Cela peut conduire à des blessures d&#39;organes associée à une diminution rapide de la fonction rénale et le développement du syndrome clinique connu comme l&#39;insuffisance rénale aiguë (IRA). Les agents pharmacologiques utilisés pour traiter des circonstances médicales allant de l&#39;infection bactérienne au cancer, lorsqu&#39;ils sont administrés seuls ou en combinaison avec d&#39;autres médicaments, peuvent initier AKI. Zebrafish sont un modèle animal utile pour étudier les effets chimiques sur la fonction rénale in vivo, car ils forment un rein embryonnaire composé d&#39;unités fonctionnelles du nephron qui sont conservés avec les vertébrés supérieurs, y compris les humains. En outre, le poisson zèbre peut être utilisé pour réaliser des écrans génétiques et chimiques, qui permettent d&#39;élucider les aspects cellulaires et moléculaires de AKI et élaborer des stratégies thérapeutiques telles que l&#39;identification de molécules néphroprotecteurs. Ici, nous montrons comment microinjection dans leembryon de poisson zèbre peut être utilisé comme un paradigme pour les études de néphrotoxine.

Une station de microinjection mis en place comprend un stéréomicroscope, micromanipulateur et régulateur de pression (figure 1A). Transillumination de la plaque d&#39;injection est préférable d&#39;afficher des échantillons au cours de cette procédure (figure 1B). Préparation de l&#39;aiguille d&#39;injection consiste à tirer le verre borosilicate approprié, suivie par la préparation de l&#39;arête de coupe et, enfin, avec chargement par l&#39;arrière de...

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l&#39;identification des mesures néphroprotecteurs.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser le poisson zèbre pour observer l'effet de néphrotoxines telles que la gentamicine ou le cisplatine afin de modéliser une lésion rénale aiguë. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le modèle de poisson zèbre permet une imagerie en temps réel des lésions cellulaires et de la régénération après une lésion rénale aiguë. Pour commencer cette procédure, préparez un outil de manipulation d'embryons destiné à positionner les embryons pour l'injection microscopique en fixant une pointe de chargement de gel à l'extrémité d'une aiguille de dissection droite de cinq pouces, puis fixez-la avec du ruban adhésif ou de la colle cyanoacrylate.Ensuite, préparez quelques fines micro-aiguilles effilées en tirant des verres borosilicatés polis à la flamme avec filament à l’aide d’un tireur de pipettes. Puis, utilisez un rasoir ou le bord de pinces fines pour couper les extrémités des aiguilles afin de créer des pointes d’injection angulaires et tranchantes. Par la suite, placez les aiguilles sur une bande d’argile à modeler dans une boîte de Pétri afin de protéger leurs extrémités.Pour fabriquer le plateau de micro-injection, préparez une solution d'agarose E3 à 1,5 % dans un ballon Erlenmeyer de 100 millilitres en dissolvant l'agarose avec du E3 au micro-ondes. Laissez ensuite le mélange refroidir à température ambiante pendant environ dix minutes. Versez la solution d'agarose E3 refroidie dans une boîte de Pétri afin d'obtenir un fond d'une épaisseur d'environ 0,5 centimètre.Une fois qu'il a durci, versez une deuxième couche de solution d'agarose E3. Ensuite, insérez le moule préfabriqué pour puits d'embryons dans l'agar, en inclinant pour éviter toute bulle d'air, et laissez l'agarose durcir à température ambiante. Une fois que tout le plateau de micro-injection est solidifié, retirez lentement et soigneusement le moule préfabriqué pour puits d'embryons, puis remplissez la boîte avec de la solution E3 et stockez-la à quatre degrés Celsius.Dans cette procédure, préparez les aquariums d'accouplement des zebrafish en insérant des séparateurs dans les compartiments d'accouplement et en les remplissant d'eau de système. Ensuite, placez un poisson de chaque côté du séparateur, de sorte que chaque compartiment d'accouplement contienne une femelle et un mâle, puis couvrez les deux compartiments. Le lendemain matin, retirez les séparateurs pour permettre la ponte.Après environ 30 minutes, vérifiez la présence d'embryons au fond du réservoir. Ensuite, remettez les poissons dans l'aquarium et récupérez leurs embryons en faisant passer l'eau du réservoir d'accouplement à travers un tamis fin en treillis métallique. Puis, retournez le tamis au-dessus d'une boîte de Pétri et rincez-le avec du milieu E3 pour recueillir les embryons.Incubez ensuite les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant la nuit. Lorsque les embryons atteignent le stade de 24 à 26 paires de somites, décantez la majeure partie du milieu E3. Ensuite, déchorionnez-les en ajoutant du milieu E3, puis 100 microlitres de pronase à 50 milligrammes par millilitre à chaque boîte d'embryons, puis en incubant les embryons à 28 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après 15 minutes, remplir la boîte avec du E3 puis agiter doucement pour détacher les chorio-allantoïdes des embryons. Ensuite, verser délicatement le E3 contenant la pronase et rincer la boîte avec 25 millilitres de E3 frais. Pour bloquer le développement de la pigmentation, remplacer le E3 par 25 millilitres de E3 frais contenant du PTU 24 heures après la fécondation. Pour les expériences s'étendant sur plusieurs jours, remplacer la solution de E3 PTU par du milieu frais une fois par jour afin de maintenir la boîte propre.Le jour de l'injection, préparez la solution de néphrotoxine désirée avec le contrôle véhicule approprié. Vortexez ou mélangez délicatement. Ensuite, vérifiez les parois du tube et le sommet de la colonne d'eau pour vous assurer que les médicaments sont bien dissous dans la solution.Chargez une aiguille de micro-injection taillée avec deux à trois microlitres de néphrotoxine en insérant une pointe fine de chargement pour gel à l’arrière de l’aiguille, puis suspendez l’aiguille verticalement à l’aide d’un morceau de ruban adhésif afin que la solution remplisse par gravité la pointe taillée de l’aiguille. Une fois la pointe de l’aiguille remplie, fixez solidement l’aiguille chargée dans le micromanipulateur. Testez le volume de micro-injection en déposant une goutte d’huile minérale sur une lame de micromètre et en injectant dans l’huile pour évaluer la taille de la goutte. Ensuite, retirez la boîte contenant les embryons de l'incubateur et anesthésiez-les en ajoutant cinq millilitres de tricaine 0,2 % dans la boîte à embryons. Puis, transférez les embryons dans le moule d'injection à l'aide d'une pipette de transfert. Positionnez chaque embryon dans un puits différent du moule, en plaçant la tête dans la partie la plus profonde du puits de manière à ce que le tronc repose le long de la dépression et que la queue dépasse légèrement.Insérez maintenant l'aiguille remplie dans le micromanipulateur et positionnez la pointe de l'aiguille à côté d'un embryon. Insérez délicatement l'aiguille dans la veine caudale pour la microinjection. L'étape la plus critique de la procédure est la microinjection.Pour assurer le succès, l'aiguille doit être coupée selon un angle aigu et déplacée avec précaution en position à côté de l'embryon. Si l'injection réussit, vous devriez voir le liquide pénétrer dans la circulation. La co-injection du néphrotoxique avec une dextrine marquée par un fluorochrome permettrait au chercheur de vérifier la réussite de l'injection après la procédure.Ensuite, retirez délicatement l'aiguille de l'embryon. Transférez l'embryon dans une boîte propre et rincez-le pour éliminer la tricaïne avec du milieu E3 PTU frais. Incubez ensuite l'embryon jusqu'au point temporel souhaité pour évaluer la morphologie, ce qui peut être documenté par photographie dans un milieu de montage à base de méthylcellulose.Ou procéder à l’analyse expérimentale selon les besoins. Remarquez que la récupération des embryons doit être évaluée toutes les 12 à 24 heures après l’injection afin de déterminer le pourcentage d’individus présentant un œdème, ce qui indique généralement une lésion rénale. La transparence de l’embryon de poisson zèbre facilite la procédure de microinjection et peut être encore améliorée par un traitement chimique au PTU à 24 hpf, afin de réduire le développement de la pigmentation pendant la durée typique d’une expérience.Ici, des échantillons d'embryons ont été laissés en développement jusqu'au stade 72 hpf, puis ont été soit injectés de manière factice, soit micro-injectés avec un véhicule saline, soit micro-injectés avec de la gentamicine à 2,5 milligrammes par millilitre. Une observation en direct a ensuite été réalisée un et deux jours après l'injection, en utilisant un éclairage par transillumination avec un microscope stéréo. Contrairement aux embryons injectés de manière factice ou avec du sérum physiologique, seuls les individus injectés avec de la gentamicine ont présenté un développement d'œdème.Dans ce cas, un œdème péricardique suggère une abolition de la fonction rénale normale, en accord avec les observations publiées précédemment. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'hybridation in situ en montage entier pour C2, peuvent être réalisées afin d'évaluer les modifications de l'expression génique après une exposition à une néphrotoxine.

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons une technique de micro-injection de la famille des aminosides, la gentamicine, en 2 jours post-fetilization (DPF) des larves de poisson zèbre pour induire des lésions rénales aiguës (IRA). Nous décrivons également une méthode pour monter toute l'immunohistochimie, plastique enrobage et de sectionnement des larves de poisson zèbre pour visualiser les dégâts médiation AKI.

Microinjections intraveineuse de larves de poisson zèbre pour étudier lésions rénales aiguës

Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des...

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Cette vidéo démontre la micro-injection intraveineuse de néphrotoxines dans la veine de la queue d’un embryon de poisson-zèbre pour étudier leurs effets chimiques sur la fonction rénale.

Micro-injection intraveineuse de néphrotoxines dans l’embryon de poisson-zèbre : une technique pour administrer des agents néphrotoxiques dans la circulation sanguine de l’embryon de poisson-zèbre

Le rein adulte poisson zèbre est un excellent système pour les études de régénération et de maladies rénales. Un aspect essentiel de cette recherche est l'évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit plusieurs méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour évaluer la composition néphrons des tubules et d'évaluer la réabsorption rénale.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

Nous présentons ici une méthode fiable pour étudier la régénération rénale adulte en induisant une lésion rénale aiguë par injection de gentamicine. Nous montrons que les dommages dépendent de la dose de gentamicine et de la température ambiante en utilisant l’hybridation in situ pour marquer lhx1a+ en développant de nouveaux néphrons.

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

Ce travail présente un nouveau modèle in vivo de lésions rénales segmentaires utilisant du poisson zèbre transgénique GFP rénal. Le modèle permet l'induction de l'ablation ciblée des cellules épithéliales rénales pour montrer les mécanismes cellulaires des lésions et des réparations de néphron.

Approche précise de l&#39;ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre

Ce protocole décrit les procédures pour induire des lésions rénales aiguës (AKI) chez le poisson zèbre adulte utilisant le cisplatine comme agent néphroxique. Nous avons détaillé les étapes pour évaluer la reproductibilité de la technique et deux techniques pour analyser l’inflammation et la mort cellulaire dans le tissu rénal, la cytométrie d’écoulement et TUNEL, respectivement.

Modèle aigu de lésion rénale induit par le cisplatine chez le poisson zèbre adulte

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Cette vidéo montre comment morpholino ou ARNm peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule pour diminuer ou augmenter le niveau des produits de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

Découvrez la microinjection de néphrotoxines chez le zebrafish pour modéliser les lésions rénales aiguës. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des dommages cellulaires et de la régénération rénale chez Danio rerio.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Explorer plus de vidéos