Name: Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Apprenez la culture de macrophages dérivés de monocytes humains avec M-CSF, incluant la cryopréservation et la différenciation en masse. Cette méthode réduit la variabilité inter-donneurs et améliore la reproductibilité expérimentale en immunologie.

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Le Département de médecine transfusionnelle, Centre clinique, National Institutes of Health, a fourni des monocytes élutriés. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

La cytaphérèse a été réalisée dans le cadre du protocole de recherche d&#39;un sujet humain approuvé par un National Institutes of Health Institutional Review Board. 1. Isolement et Cryoconservation des monocytes <ol><li> Obtenir des cellules mononucléaires par cytaphérèse de donneurs humains, et d&#39; enrichir les monocytes par contre-courant continu élutriation de centrifugation des cellules mononucléaires telles que décrites dans les références 7,8. Obtenir environ 100 x 10 6 cellules décanté (environ 80 - 90% de monocytes) dans un tampon d&#39;élutriation spécifié par le fabricant. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> monocytes centrifuger dans un tube de 15 ml de polypropylène à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension doucement les cellules dans du FBS suivi par le sulfoxyde de diméthyle pour obtenir une concentration finale de 90% de FBS / 10% de diméthylsulfoxyde et 50 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter chaque ml de suspension cellulaire to un cryovial individuel. </li><li> Placer les cryotubes dans un récipient de congélation de cellules et les transférer vers un congélateur à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer vers un réservoir de stockage d&#39;azote liquide cryofiole pour le stockage à long terme. </li></ol> 2. Différenciation de monocytes en Macrophages <ol><li> Décongeler un cryotube de cellules en transférant rapidement dans un bain-marie à 37 ° C, puis immédiatement après l&#39;élimination de la suspension cellulaire a décongelé environ 70%. </li><li> Immédiatement après décongélation complète à la température ambiante, transférer les 1 ml contenus cryovial dans 50 ml de 37 ° C réchauffé Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyenne avec 2 mM de L-glutamine, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) et 10% de FBS (milieu complet). </li><li> Prélever 25 ml de suspension de monocyte dans chacun de deux flacons de 75 cm2 de culture cellulaire en plastique. </li><li> Incuber les cultures à 37 ° C , une culture cellulaire incubateur avec 5% de CO2 / 95% d&#39; air pendant 48 heures. </li><li> Rincer la cultures 3 fois avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (préchauffée à 37 ° C), en éliminant doucement le milieu de culture afin d&#39;éviter de déloger toutes les cellules faiblement fixées. </li><li> Après rinçage, ajouter un milieu complet frais, changeant moyenne tous les 2 jours jusqu&#39;à ce que les monocytes se différencient et prolifèrent suffisamment pour devenir confluentes. Ce qui nécessite environ une semaine de culture. </li></ol> 3. Récolte Macrophages pour lancer des expériences <ol><li> Rincer les macrophages différenciés dans un ballon 3 fois avec 10 ml de pré-chauffé à tampon phosphate une solution saline de 37 ° C Dulbecco sans Ca2 + et Mg2 + avant d&#39; ajouter 10 ml préchauffée acide trypsine éthylènediaminetétraacétique (EDTA) , solution à 37 ° C de 0,25%. </li><li> Placer dans fiole de culture cellulaire incubateur pendant 10 - 15 min, à laquelle environ 90% des macrophages aurait arrondi et détaché. Vérifiez ceci par un examen microscopique du flacon. </li><li> Ajouter 10 ml de RPMI 1640 contenant 10% de FBS à stop trypsinisation. </li><li> Transférer la suspension cellulaire macrophage de la fiole dans un tube de polypropylene de 50 ml, centrifuger 300 g pendant 5 min, et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre doucement les macrophages dans 1 ml de milieu complet. </li><li> Mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 10 ul macrophage solution bleu Trypan et déterminer le nombre de cellules et la viabilité de macrophage (typiquement&gt; 95%) en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Sur la base du comptage des cellules (habituellement environ 15 - 18 x 10 5 macrophages), ajouter un milieu complet supplémentaire pour atteindre la densité cellulaire d&#39;ensemencement souhaitée. Note: 1 x 10 5 macrophages dans 1,5 ml de milieu par puits d&#39;une plaque de 12 puits produira une culture quasi-confluentes. </li><li> À la suite de l&#39; ensemencement, les macrophages incuber pendant une nuit dans une culture de cellules C incubateur à 37 ° avec 5% de CO2 / 95% d&#39; air pour permettre la fixation des cellules. Ensuite, commencer les expériences souhaitées. </li></ol>

<ol><li>Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front. Immunol. 5, 683(2014).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).</li>
<li>Akagawa, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).</li>
<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).</li>
<li>Strasser, E. F., Eckstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+collection+and+monocyte+isolation+for+dendritic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture.</a> Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapheresis+products+by+using+the+Elutra+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator.</a> Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Anzinger, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+low-density+lipoprotein+uptake+by+macrophage+colony-stimulating+factor-differentiated+human+macrophages+is+mediated+by+macropinocytosis+and+micropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+receptor-independent+low+density+lipoprotein+uptake+and+cholesterol+accumulation+by+macrophages+differentiated+from+human+monocytes+with+macrophage-colony-stimulating+factor+%28M-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF).</a> J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).</li>
<li>Freeman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG1-mediated+generation+of+extracellular+cholesterol+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains.</a> J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).</li>
<li>Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent+fluid-phase+pinocytosis+mechanisms+for+induction+of+foam+cell+formation+with+native+low-density+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles.</a> Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA1+contributes+to+macrophage+deposition+of+extracellular+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol.</a> J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).</li>
<li>Ong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cholesterol-rich+microdomains+generated+by+human+macrophages+and+their+potential+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport.</a> J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-dependent+human+monocyte+survival+at+the+early+stage+of+the+culture+and+inhibits+the+generation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages.</a> J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).</li>
<li>Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+monocytes+from+whole+blood+by+density+gradient+centrifugation+and+counter-current+elutriation+followed+by+cryopreservation%3A+six+years%27+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).</li>
<li>Weiner, R. S., Normann, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integrity+of+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Functional integrity of cryopreserved human monocytes.</a> J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).</li>
<li>Hansen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+phagocytic+functions+in+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).</li>
<li>Seager Danciger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination+of+apolipoprotein+A-I%3A+effect+on+macrophage+proliferation--a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale.</a> Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Génération types de macrophage définis peut clarifier certains des résultats contradictoires obtenus par les enquêteurs lors de l&#39;étude de la biologie macrophage. L&#39;utilisation de différentes conditions de culture et des facteurs de différenciation pour générer des macrophages humains primaires peuvent conduire à des types très différents macrophage, un fait qui ne peut être apprécié par le chercheur. Par exemple, les macrophages sont parfois produites à partir de monocytes humains en utilisant pas de sérum, le ...

L’étude de macrophages en culture est un modèle utile pour comprendre la fonction de ces cellules dans l’inflammation telle qu’elle se produit dans les plaques d’athérosclérose. Lorsque la recherche se concentre sur les maladies humaines impliquant des macrophages, il est utile d’étudier les macrophages humains primaires plutôt que les macrophages non humains pour éviter les différences entre les espèces. De plus, les effets de la transformation cellulaire peuvent être évités en utilisant des macrophages primaires plutôt que des lignées cellulaires de macrophages. À cette fin, les macrophages différenciés des monocytes isolés du sang humain servent de moyen d’obtenir des macrophages humains primaires. 
Les macrophages tissulaires peuvent être soit résidents dans les tissus, soit dérivés de monocytes qui migrent dans le tissu et se différencient en macrophages 1. Deux types de macrophages dérivés de monocytes humains ont été définis, qui diffèrent non seulement par leur morphologie, mais aussi par l’expression des gènes et la fonction cellulaire 2. Ces deux types sont obtenus à partir de monocytes qui sont différenciés en macrophages en présence de M-CSF + sérum de veau fœtal (FBS) et de monocytes qui sont différenciés en macrophages en présence de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) + FBS 2-6. D’après notre expérience (observation non publiée), l’utilisation de sérum humain plutôt que de FBS génère le type GM-CSF, que M-CSF ou GM-CSF soit inclus dans le milieu de différenciation. Les macrophages de type M-CSF ont tendance à être plus allongés que les macrophages de type GM-CSF, qui ressemblent à des œufs au plat dans leur morphologie. Les chercheurs devraient reconnaître que les macrophages humains dérivés des monocytes M-CSF et GM-CSF ne sont pas les mêmes que les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris M1 et M2 6.
Au cours de recherches utilisant des macrophages différenciés M-CSF dérivés de monocytes humains, nous avons rencontré des difficultés liées à la disponibilité des monocytes pour initier des expériences et à la variation des densités cellulaires obtenues des macrophages lors de la différenciation des monocytes en macrophages. Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis au point le protocole suivant dans lequel les monocytes sont congelés jusqu’à ce qu’ils soient utilisés et les monocytes sont différenciés en vrac en macrophages qui peuvent ensuite être retirés des flacons de culture et plaqués aux densités cellulaires souhaitées pour obtenir des cultures plus uniformes d’une expérience à l’autre.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture Cellbind 12 puits</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, fiole T-75, traitement pour culture tissulaire</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 milieu de culture</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>chauffé à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp ;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS sans Ca2+ et Mg2+nbsp ;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube conique en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer hémicytomètre à lumière vive améliorée</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>CoolCell LX congélation de cellules conteneur</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>d’autres conteneurs de congélation devraient également être adéquats pour cette étape</td></tr><tr><td>Système de stockage d’azote liquide, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>7400</td><td>Tout réservoir d’azote liquide doit être adéquat</td></tr></tbody></table>

culture de macrophages factor macrophage colony-stimulating differentiated humaine monocytes dérivés

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Pour l’initiation des expériences, des monocytes frais ou congelés sont cultivés dans des flacons pendant 1 semaine avec du M-CSF pour induire leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages peuvent être récoltés et ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences. L’utilisation d’un nombre défini de macrophages plutôt que d’un nombre défini de monocytes pour initier des cultures de macrophages pour des expériences produit des cultures de macrophages dans lesquelles la densité cellulaire souhaitée peut être atteinte de manière plus constante. L’utilisation de monocytes cryoconservés réduit la dépendance à l’égard de la disponibilité des donneurs et produit des cultures de macrophages plus homogènes.

La viabilité des monocytes frais ou cryoconservés est supérieure à 95% telle que déterminée par coloration au bleu Trypan 9. La figure 1 et la figure 2 compare à des grossissements inférieurs et supérieurs, respectivement, la progression de la différenciation des monocytes frais et cryoconservés ( par exemple, congelé) dans les macrophages. Notez que les frais comparé à monocytes cryoconservés montrent une sous-popula...

Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le protocole utilise la cryoconservation des monocytes associée à leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages récoltés peuvent ensuite être ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

L'objectif général de cette procédure est d'améliorer la disponibilité des monocytes et de minimiser les variations des densités cellulaires obtenues lors de la différenciation induite par MCSF des monocytes sanguins humains en macrophages. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la biologie des macrophages humains. Le principal avantage de cette approche est que des cultures de macrophages dérivés de monocytes humains peuvent être facilement obtenues avec une dépendance réduite à l'égard de la disponibilité des donneurs.En outre, la densité cellulaire de macrophages souhaitée et des cultures homogènes peuvent être régulièrement obtenues. Pour commencer cette procédure, obtenir les cellules mononucléées par leucaphérèse à partir de donneurs humains, puis enrichir les monocytes par éluatrition centrifuge en contre-courant continue des cellules mononucléées. Ensuite, dénombrer les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Ensuite, centrifuger les monocytes dans un tube en polypropyl&egrave;ne de 15 millilitres pendant cinq minutes &agrave; temp&eacute;rature ambiante. Puis, &eacute;liminer le surnageant et re-suspendre d&eacute;licatement les cellules dans du FBS, suivi par du dim&eacute;thylsulfoxyde, afin d'obtenir une concentration finale de 90 % FBS, 10 % dim&eacute;thylsulfoxyde et 50 &times; 10⁶ cellules par millilitre. Ajouter ensuite un millilitre de suspension cellulaire dans un cryotube individuel.Placer les cryofiches dans un conteneur de congélation cellulaire, puis le transférer dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, transférer le conteneur dans un réservoir de cryofiches à azote liquide pour une conservation à long terme. À cette étape, décongeler une cryofiche de cellules en la maintenant brièvement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Lorsque la suspension cellulaire est décongelée à environ 70 %, retirez-la immédiatement du bain-marie et transférez-la à température ambiante. Une fois la suspension cellulaire complètement décongelée, transférez un millilitre du contenu du cryotube dans 50 millilitres de milieu RPMI 1640 contenant 2 millimolaire de L-glutamine, 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF, 25 nanogrammes par millilitre d'IL-10 et 10 % de FBS, à 37 degrés Celsius. Ensuite, transférez 25 millilitres de la suspension de monocytes dans deux flacons en plastique de 75 centimètres carrés destinés à la culture cellulaire.Incuber les cultures à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. N'oubliez pas de ne pas changer le milieu avant 48 heures ; sinon, les cellules ne seront pas bien attachées et seront éliminées par rinçage. Après 48 heures, rincer les cultures trois fois avec 10 millilitres de milieu RPMI 1640 préchauffé.Retirez délicatement le milieu de culture afin d'éviter de détacher les cellules faiblement adhérentes. Ensuite, ajoutez du milieu complet et cultivez les cellules pendant une semaine. Changez le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les monocytes se différencient et prolifèrent efficacement pour former une couche confluente.À présent, rincez les macrophages différenciés dans le flacon trois fois avec 10 millilitres de DPBS à 37 degrés Celsius, sans calcium ni magnésium. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de solution de trypsine-EDTA 0,25 % à 37 degrés Celsius. Puis, placez le flacon dans une étuve à culture cellulaire pendant 10 à 15 minutes.À ce stade, environ 90 % des macrophages devraient être arrondis et détachés. Ensuite, ajouter 10 millilitres de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS pour arrêter la trypsination. Si nécessaire, utiliser un grattoir à cellules pour détacher complètement les cellules.Parfois, au cours de cette procédure, de nombreux macrophages restent attachés. Ces macrophages peuvent être éliminés après la trypsination en passant un grattoir à cellules sur la surface du flacon. Ensuite, transférez la suspension de cellules macrophages du flacon dans un tube polypropylène de 15 millilitres.Centrifuger pendant cinq minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Ensuite, redisperser délicatement les macrophages dans un millilitre de milieu complet. En fonction du nombre de cellules, ajouter du milieu complet supplémentaire afin d'obtenir la densité cellulaire désirée pour le semis.Ensuite, ensemencer les macrophages dans 1,5 millilitre de milieu par puits d'une plaque de 12 puits. Une concentration de 1 × 10⁵ cellules dans 1,5 millilitre de milieu par puits produit généralement une culture quasi-confluente. Après l'ensemencement, incuber les macrophages toute la nuit à 37 °C pour permettre l'attachement cellulaire avant de les utiliser dans les expériences.Cette figure montre les images microscopiques en contraste de phase de monocytes frais cryopréservés au cours de leur différenciation induite par MCSF en macrophages, à faible grossissement. Les images de monocytes ont été prises au troisième et septième jour de culture dans un flacon, puis au huitième jour, soit un jour après leur récolte et leur resemis dans une plaque de culture 12 puits. On observe ici la comparaison entre monocytes frais et monocytes cryopréservés utilisés pour produire des macrophages à fort grossissement.Les vacuoles en phase de desserrement sont des macropinocytoses. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cryoconserver et, par la suite, différencier des monocytes humains en macrophages à l’aide de MCSF. Ensuite, les macrophages peuvent être cultivés à des densités cellulaires souhaitées pour des expériences.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre l’amorçage des monocytes primaires dans les macrophages. Les monocytes humains primaires peuvent être isolés et différenciés en un phénotype pro-inflammatoire de type M1 à l’aide du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) ou en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 à l’aide du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF).

Culture in vitro et différenciation des monocytes primaires en macrophages

Dans cette vidéo, nous démontrons une procédure pour induire la différenciation et la polarisation des monocytes dérivés du sang périphérique en macrophages M1 ou M2. L’incubation avec le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages, le lipopolysaccharide et l’interféron-gamma produit des macrophages M1 pro-inflammatoires, tandis que l’incubation avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages et l’interleukine-4 induit la production de macrophages M2...

Différenciation et polarisation de cellules dérivées de monocytes en cellules de type macrophage

Macrophages dérivés de monocytes sont des cellules importantes du système immunitaire inné. Ici, nous décrivons un outil facile à...

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.

Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Les monocytes et les macrophages sont des cellules immunitaires très plastiques et reprogrammables cruciales pour la santé et la maladie. Ils détectent et répondent à un large éventail de stimuli en adoptant des programmes de différenciation et des phénotypes spécifiques. Nous avons normalisé un modèle in vitro pour étudier la polarisation et la reprogrammation des macrophages, ce qui constitue un outil précieux pour la recherche.

Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

Apprenez la culture de macrophages dérivés de monocytes humains avec M-CSF, incluant la cryopréservation et la différenciation en masse. Cette méthode réduit la variabilité inter-donneurs et améliore la reproductibilité expérimentale en immunologie.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

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