Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de mesurer la greffe in vivo de cellules sanguines transplantées dans des niches de la moelle osseuse receveuse. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser les processus cellulaires tels que le homing, l’expansion et la localisation dans différentes niches de la moelle osseuse des cellules hématopoïétiques du donneur après la transplantation. Utilisée en combinaison avec des modèles animaux modifiés, cette approche peut aider à définir les voies moléculaires essentielles à la régénération des cellules hématopoïétiques.

Contrairement à l’histologie ou à d’autres techniques d’imagerie, la microscopie intravitale permet de capturer les interactions de cellule à cellule chez un animal vivant au niveau cellulaire et en temps réel. Nous avons décidé d’utiliser cette méthode pour déterminer si le microenvironnement de la moelle osseuse était le site initial du développement de la maladie myéloproliférative causée par la perte de la signalisation Notch. Les défis pour les personnes novices dans cette technique comprennent la minimisation des artefacts respiratoires, le positionnement et la stabilisation optimaux de la tête et l’évitement de la saturation de l’image.

Une à deux heures avant la greffe, vaporisez une souris EGFP lysée avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision dans la peau de chaque jambe autour de la cheville et une pince chirurgicale pour retirer la peau et la fourrure ensemble afin d’exposer le tissu musculaire propre. Retirez autant de muscle que possible des jambes.

Ensuite, coupez les os au niveau des articulations du genou et de la cheville et utilisez des éponges de gaze pour retirer tout tissu musculaire restant des fémurs et des tibias. Rincez les os nettoyés dans une plaque à six puits contenant du DMEM complété par 10 % de FBS. Ensuite, transférez les quatre os de la patte arrière dans 10 millilitres d’EDTA froid dans du PBS dans un mortier et écrasez les os avec un pilon.

Triturez les cellules de la moelle osseuse pour obtenir une suspension unicellulaire et filtrez la boue à travers un filtre de 70 microns dans un tube de centrifugation de 15 millilitres. Rincez le filtre avec deux à trois millilitres de PBS. Ensuite, centrifugez les cellules et remettez en suspension la pastille dans 10 millilitres de DMEM frais plus 10 % FBS.

Pour l’injection, centrifugez la suspension cellulaire, puis comptez et ajustez la concentration des cellules à 1,5 fois 10 à la septième cellule par millilitre dans l’IMDM sans sérum. Placez les cellules sur de la glace. Cinq à six heures après la deuxième dose de radiation, injecter trois fois 10 à 10 cellules de la moelle osseuse dans la veine de la queue de chaque animal receveur irradié.

Ajoutez le point temporel approprié après la transplantation. Placez la souris receveuse anesthésiée sur un coussin chauffant à 37 degrés Celsius et confirmez l’absence de réponse au pincement des orteils. Appliquez la pommade sur les yeux de l’animal et administrez 100 microlitres du marqueur fluorescent approprié via la veine de la queue.

Ensuite, utilisez une petite tondeuse électrique pour retirer les poils de la surface dorsale de la tête de l’animal, puis appliquez une crème dépilatoire. Au bout de cinq minutes, retirez la crème avec des éponges de gaze et rincez toute solution restante avec une solution saline. Désinfectez le cuir chevelu avec un coton-tige imbibé à 70 % d’éthanol.

Ensuite, à l’aide d’une pince fine et de ciseaux, faites une incision cutanée médiane de 10 à 20 millimètres sur le cuir chevelu afin d’exposer la surface dorsale sous-jacente du crâne. À l’aide de soie chirurgicale 5-0, placez deux sutures de hauban de chaque côté de l’incision en créant un lambeau pour exposer le calvarium pour l’imagerie. Appliquez une gouttelette d’huile sur le crâne exposé.

Avec la souris en position couchée, immergez le cuir chevelu exposé dans un plat à fond de verre rempli d’huile de microscope. Placez ensuite l’animal sur une platine d’imagerie multiphotonique avec le calvarium au-dessus de l’objectif et couvrez l’animal avec un coussin chauffant à 37 degrés Celsius. Il est essentiel que la tête reste stabilisée dans la bonne position lors de l’acquisition d’images multiphotoniques.

Utilisez un appareil stéréotaxique ou fixez la souris avec du ruban adhésif, le cas échéant. À l’aide d’un système confocal inversé modifié pour l’imagerie multiphotonique, réglez le laser à deux photons à 830 nanomètres. Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition d’images approprié.

Dans le menu des paramètres d’acquisition, vérifiez que le mode de balayage unidirectionnel est sélectionné et réglez la vitesse de balayage sur quatre microsecondes par pixel, la fréquence d’images sur 512 x 512 pixels et le zoom sur 1,5. Sélectionnez le watt 20X dans un objectif de 0,95. Ouvrez la fenêtre de la liste des colorants et sélectionnez deux photons.

Sélectionnez ensuite le miroir RDM690 dans la fenêtre du contrôleur du microscope. Dans la fenêtre du chemin de lumière et des dés, sélectionnez la case deux unités laser pour vérifier si l’obturateur laser à deux photons est ouvert. Sélectionnez Lampe EPI et choisissez le cube de filtre B/G EPI.

Focalisez ensuite l’objectif sur l’échantillon pour visualiser le flux vasculaire dans la niche de la moelle osseuse du calvarium, en utilisant la bifurcation de la veine centrale et la suture coronaire comme points de référence. En utilisant le mode sans balayage, sélectionnez trois détecteurs externes et imagez l’échantillon à une vitesse de balayage de quatre microsecondes par pixel sans moyenne et avec une puissance laser et un gain de détecteur constants pour utiliser toute la plage dynamique du détecteur avec une saturation minimale. Après avoir collecté une série de coupes dans la profondeur du tissu, ouvrez le logiciel de quantification et de visualisation d’images 3 à 4D dédié.

Visualisez de manière interactive les piles Z à l’aide de l’algorithme de rendu 3D approprié selon les instructions du fabricant. Utilisez ensuite le module de segmentation d’objets spot pour segmenter les cellules GFP et appliquer un traitement arithmétique de pile pour éliminer les cellules GFP faussement positives dans les canaux vert et rouge. Enfin, utilisez le module de segmentation de surface pour réformer la segmentation du système vasculaire et de la surface osseuse, en appliquant des algorithmes de distance de tension X du point à la surface pour calculer les distances des cellules à l’une des surfaces distales si nécessaire.

Ici, les piles Z collectées dans chacune des six régions standard du calvarium de la moelle osseuse ont été rendues sous forme de projection d’intensité maximale 3D, de projection d’ombre 3D incluant la composante osseuse et d’images segmentées 3D, permettant de quantifier les cellules et de mesurer leurs distances par rapport à l’os et aux vaisseaux. Dans cette expérience, l’imagerie in vivo de cellules myéloïdes dans le microenvironnement de la moelle osseuse défectueuse de Notch a révélé que les cellules GFP lysées par donneur ont une efficacité de guidage similaire chez les receveurs de type sauvage et knock-out 24 heures après la greffe, tandis qu’elles présentent une greffe différente à des moments ultérieurs. L’analyse de la dynamique de l’expansion des progéniteurs myéloïdes a montré que les cellules transplantées de moelle osseuse de manière adaptative se sont développées plus rapidement et en plus grand nombre chez les receveurs knock-out deux semaines après la greffe.

Les cellules de moelle osseuse du donneur chez les receveurs de type sauvage se sont développées plus tard, mais en nombre deux fois plus élevé que les cellules du donneur et des receveurs knock-out à quatre semaines, un moment où les cellules du donneur dans la moelle osseuse knock-out sont diminuées parce qu’elle passe rapidement en circulation. Et qu’au bout de six semaines, les différences dans le nombre de cellules donneuses dans le calvarium de la moelle osseuse se stabilisent. De plus, l’analyse de segmentation 3D de la région moyenne inférieure de la calvaria knock-out et de type sauvage six semaines après la greffe de moelle osseuse indique que les cellules GFP lysées se localisaient à la même distance de l’os chez les deux types d’animaux receveurs, mais il est intéressant de noter qu’elles résidaient plus loin du système vasculaire chez les souris knock-out.

Une fois maîtrisée, l’imagerie intravitale de la moelle osseuse peut être réalisée en une heure et 30 minutes par souris si elle est effectuée correctement. Lors de l’utilisation de cette approche, il est important de se rappeler d’échantillonner plusieurs zones de la moelle osseuse du calvarium par souris et d’analyser au moins trois souris par expérience pour tenir compte de toute variation intra et inter échantillon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner la greffe de moelle osseuse et l’imagerie intravitale pour déterminer la cinétique de la greffe d’une sous-population sanguine spécifique au microenvironnement de la moelle osseuse.