Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l'absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total

L'objectif général de cette méthodologie est de mesurer l'absorption du glucose et de son transporteur sur différentes sous-populations de monocytes. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que : Quelle est l'importance du métabolisme des cellules immunitaires dans l'évolution des maladies ? Les principaux avantages de ces techniques sont qu'elles sont rapides, faciles à réaliser, ne nécessitent aucun matériau réactif et requièrent uniquement un petit volume de sang.

Moins d'une heure après le prélèvement des échantillons sanguins dans des tubes anticoagulants citrate ACD-B, placer les échantillons dans une hotte de sécurité biologique. Ensuite, ajouter 100 microlitres de sang de chaque échantillon dans des tubes en polypropylène individuels, puis traiter les cellules avec deux millilitres de solution de lyse 1X sur de la glace, en pipetant doucement pour homogénéiser. Après 15 minutes, centrifuger les cellules, puis effectuer deux autres centrifugations dans du tampon de lavage.

Après le deuxième lavage, utilisez une pipette pour éliminer soigneusement autant que possible le surnageant, puis resuspendez les culots dans 100 microlitres de tampon de lavage sur de la glace. Pour identifier les sous-populations spécifiques de monocytes, étiquetez les cellules avec cinq microlitres des anticorps appropriés par 100 microlitres de cellules, pendant 30 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons deux fois dans la solution de lavage et fixez les cellules avec 200 microlitres de formaldéhyde à 0,5 % dans du PBS.

Ensuite, analyser les cellules dans les 24 heures sur un cytomètre en flux capable de détecter quatre couleurs. Pour évaluer la capture de glucose par les sous-populations de monocytes, transférer 90 microlitres de sang de chaque échantillon dans des tubes en polypropylène individuels, puis ajouter 10 microlitres de l'analogue fluorescent de glucose d'intérêt au sang. Agiter doucement les tubes pour homogénéiser, puis couvrir les échantillons avec du papier d'aluminium.

Ensuite, placer les cellules à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes, puis les transférer immédiatement sur de la glace. Ajouter ensuite quatre millilitres de solution de lyse FACS aux tubes et centrifuger les cellules. Procéder ensuite à une deuxième centrifugation dans du tampon de lavage.

Versez délicatement le surnageant et étiquetez les cellules avec les anticorps appropriés d'intérêt pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière. Ensuite, lavez les échantillons avec quatre millilitres de tampon de lavage glacé, re-suspendez les culots dans 200 à 300 microlitres de PBS glacé, puis analysez les tubes dans les 10 minutes. Pour l'analyse en cytométrie en flux, utilisez d'abord les échantillons témoins non marqués et marqués individuellement pour régler la compensation.

Ensuite, dans le logiciel d'analyse de cellules uniques approprié, ouvrez le premier échantillon sur un graphique de diffusion avant par diffusion latérale et délimitez la population de monocytes comme illustré. Puis, double-cliquez sur la population de monocytes délimitée et délimitez la population négative pour le CD3. Double-cliquez maintenant sur la population négative pour le CD3, puis configurez l’axe des abscisses pour afficher la coloration CD14 et l’axe des ordonnées pour afficher la coloration CD16.

Ensuite, afin de mesurer l'absorption du glucose ou de son transporteur dans une sous-population spécifique de monocytes, générez les histogrammes appropriés. Puis, lorsque des populations cellulaires définies existent, utilisez les échantillons de contrôle IgG-FITC pour définir la fenêtre de sélection et déterminer le pourcentage total de monocytes positifs pour CD14 dans chaque échantillon. Ici, la stratégie initiale de fenêtrage pour isoler les monocytes par diffusion cellulaire et exclusion des lymphocytes T en ciblant la population négative pour CD3 est présentée.

Les monocytes sont ensuite sélectionnés selon l'expression de CD14 seule, ou en combinaison avec CD16, afin d'identifier l'ensemble des monocytes ou leurs sous-populations. Des populations distinctes de monocytes exprimant à la fois CD14 et le transporteur de glucose Glut-1 peuvent être observées, notamment parmi les leucocytes circulants obtenus à partir de sujets séropositifs pour le VIH. Des cellules CD14-positives et Glut-1-positives peuvent également être détectées au sein de sous-ensembles monocytaire spécifiques chez des individus non infectés par le VIH, bien que ces populations soient plus marquées chez les patients séropositifs.

Comme prévu d'après les données d'expression des transporteurs de glucose, l'analogue du glucose 2-NBDG est également capté en plus grande quantité par les cellules des individus séropositifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure et demie si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de limiter l'exposition à la lumière de toutes les régions.

Après la prise en charge des analogues du glucose, les cellules peuvent être marquées par des anticorps dirigés contre des marqueurs de surface cellulaire afin d'identifier les populations immunitaires spécifiques qui vous intéressent. Une fois développée, cette méthode peut être utilisée pour déterminer comment le VIH affecte le métabolisme des cellules immunitaires, et peut également être explorée par d'autres chercheurs dans différents domaines, tels que l'immunologie, la virologie et la recherche sur le cancer. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter le transporteur de glucose un et la prise de glucose dans les cellules immunitaires.

N'oubliez pas que lorsqu'on travaille avec des agents infectieux, des procédures de sécurité standard doivent être appliquées.