Name: Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation dun Thin Film Polydiméthylsiloxane (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Apprenez la formation automatisée de bicouches lipidiques utilisant un film mince de polydiméthylsiloxane. Cette méthode permet une formation reproductible en moins d'une heure pour étudier les interactions membrane-protéine.

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Ce travail a été soutenu par le programme Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) et les subventions de la National Research Foundation (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) de la National Research Foundation of Korea. Ce travail a également été partiellement soutenu par la bourse de recherche de l’Université Inha.

1. Préparation de la solution <ol><li> Préparation de la solution tampon: <ol><li> À formuler une solution tampon, on dissout 1 M de KCl (chlorure de potassium), 10 mM de Tris-HCl (Tris-chlorhydrate) et 1 mM d&#39;EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) dans l&#39;eau distillée et ajuster le pH à 8,0. </li><li> Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,20 um. Pour stériliser, autoclave la solution à 121 ° C pendant 15 min. </li></ol></li><li> Préparation de la solution lipidique pour prélaquage: <ol><li> Pour formuler la solution lipidique pour prélaquage, on dissout 3% DPhPC (1,2-sn - glycéro diphytanoyl--3-phosphatidylcholine) lipide (p: v) dans un mélange de 2: 8 et n décane hexadécane (v: v). Agiter pendant une nuit en utilisant un dispositif de rotation. </li></ol></li><li> Préparation de la solution lipidique pour la formation de la membrane: <ol><li> Pour formuler la solution lipidique pour la formation de la membrane, dissoudre 0,1% DPhPC (1, 2-sn - glycéro diphytanoyl--3-phosphatidylcholine) lipide (p: v) dans un mélange de 2: 8 plet ualene hexadécane (v: v). Agiter pendant une nuit en utilisant un dispositif de rotation. </li></ol></li></ol> 2. Formation d&#39;un Thin Film PDMS <ol><li> Mélanger PDMS et d&#39;agent de durcissement dans un rapport de 9 à 1 (p / p) dans un récipient de mélange pour former le prépolymère PDMS. Ajouter 5 g de PDMS prépolymère dans une boîte de Pétri pour former le PDMS film mince (épaisseur 200-250 um). Étaler PDMS de pré-polymère à l&#39;aide d&#39;une tournette à 800 tours par minute pendant 10 secondes pour former un film mince. </li><li> Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur sous vide à une pression de 100 mTorr pendant 2 heures pour éliminer les bulles d&#39;air. Pour polymériser le film mince pré-polymère, cuire au four pendant 5 heures à 70 ° C. </li><li> Afin de rendre un PDMS carrés de film mince, couper le PDMS polymérisés film mince en 2 x 2 cm 2 carrés. Utilisez un micro poinçon 500 um pour faire une ouverture dans le centre du PDMS à film mince. Des ouvertures pré-peinture avec une solution à 3% DPhPC lipidique mélangé 2: 8 et le décane n- hexadécane. </li></ol> 3. Chambre Fabrication et Assembly <ol><li> Pour fabriquer la chambre BLM, la conception de deux blocs symétriques de la chambre en utilisant un logiciel de dessin 3D avec des dimensions extérieures de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm et des dimensions intérieures puits de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17. </li><li> Craft la chambre en utilisant un bloc de PTFE avec une machine CNC et suivez les instructions du fabricant. </li></ol> 4. Assemblée Chambre <ol><li> Pour assembler la chambre, placer le film mince pré-peint-PDMS entre les deux blocs de PTFE tel que l&#39;ouverture sur le PDMS film mince est aligné avec le trou dans la chambre. </li><li> Sceller les bords extérieurs de la chambre en utilisant un couvercle en verre avec de la graisse (ce qui facilite l&#39;observation optique). Immobiliser la chambre assemblés à l&#39;aide des écrous et des boulons. REMARQUE: Assurez-vous que la chambre est bien scellé de sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuite de liquide. </li></ol> 5. La formation de membrane Precursor avec Expedited auto-assemblage Formation (MPES) <ol><li> En utilisant une pipette, déposer 0,5pi de 0,1% DPhPC lipide mélangé 2: 8 n décane: hexadécane sur l&#39;ouverture du PDMS film mince assemblé avec la chambre. </li><li> Avant d&#39;utiliser, stocker la chambre dans un congélateur ou un réfrigérateur en dessous de 10 ° C. </li></ol> 6. Membrane Formation et vérification <ol><li> Pour former un BLM avec MPES, retirer la chambre du réfrigérateur et de suspendre 2 ml d&#39;une solution tampon de chaque côté de la chambre. Réglez la chambre de côté pour &lt;10 min jusqu&#39;à ce que le précurseur de membrane congelée dégèle. </li><li> Placer la chambre sur un micromanipulateur pour contrôler avec précision la hauteur par rapport à la source lumineuse et le microscope. Illuminer un côté de la chambre comme une source de lumière en utilisant un halogène fibres optiques illuminateur pour illuminer l&#39;ouverture du PDMS à couche mince pour l&#39;observation optique du processus de formation BLM. </li><li> De l&#39;autre côté, placez un microscope numérique verticalement par rapport à la source lumineuse pour observer la formation BLM (magnifier par 200X). </li><li> Pour confirmer la formation BLM, observer le centre de l&#39;ouverture où la couleur devient plus lumineux que l&#39;anneau. </li></ol> 7. Enregistrement électrique <ol><li> Pour la mesure électrique, préparer des électrodes Ag / Cl en utilisant un fil d&#39;argent 208 um d&#39;épaisseur et de l&#39;eau de Javel dans l&#39;hypochlorite de sodium pendant&gt; 1 min. Placer les électrodes Ag / Cl dans chaque côté de la chambre suffisamment profond pour être plongé dans la solution tampon. </li><li> Connecter les électrodes à l&#39;amplificateur de microélectrodes. En utilisant le logiciel d&#39;électrophysiologie, appliquer une forme d&#39;onde triangulaire mV ± 10 à travers la membrane pour acquérir une onde carrée. Régler application d&#39;une tension en cliquant sur les flèches indiquées sur V_clamp (mV). </li><li> Enregistrer les propriétés électriques de la membrane en cliquant sur le bouton d&#39;enregistrement (rouge icône de point). Procéder à l&#39;enregistrement jusqu&#39;à ce qu&#39;une onde carrée uniforme est observée. Quittez l&#39;enregistrement en cliquant sur l&#39;icône carré noir. </li></ol> 8. Ion Canal Incorporation NE PASE: gramicidine A (gA) l&#39;incorporation se fait spontanément lors de la formation de BLM, comme gA est ajouté directement à la solution lipidique. <ol><li> Pour observer les activités de canal gA, appliquer 100 mV à travers la membrane à un taux de 5 kHz échantillon pour mesurer le potentiel de la membrane de maintien. Régler application d&#39;une tension en cliquant sur les flèches indiquées sur V_clamp (mV). </li><li> Enregistrer les propriétés électriques de l&#39;incorporation gA en cliquant sur le bouton d&#39;enregistrement (rouge icône de point). Continuez l&#39;enregistrement jusqu&#39;à ce que les sauts en cours est observée. Quittez l&#39;enregistrement en cliquant sur l&#39;icône carré noir. </li><li> Après l&#39;acquisition de données électriques, filtrer les données avec un filtre passe-bas de Bessel à 100 Hz en utilisant un logiciel d&#39;électrophysiologie. </li><li> Observer les sauts de courant dans la détention de données potentiels filtré (chaque saut courant, ~ 0,15 nS, représente dimérisation d&#39;un canal ionique gA) pour vérifier gA incorporation. </li></ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Notre technique de formation BLM fournit un outil puissant pour l’étude de la membrane cellulaire et des canaux ioniques, contrairement aux techniques conventionnelles qui ont un potentiel limité d’utilisation industrielle. Nous avons développé un précurseur membranaire à l’aide d’un film mince PDMS, et conçu un précurseur membranaire congelé avec auto-assemblage accéléré.
Contrairement aux méthodes conventionnelles de formation de membranes avec des films hydrophobes, où la formation de membr...

Membrane artificielle bicouche lipidique ou membrane lipidique noire (BLM), est un outil important pour les mécanismes des membranes cellulaires et des canaux ioniques, élucidant ainsi que pour la compréhension des interactions entre les canaux ioniques et des ions / molécules 1-7 Bien que la méthode patch-clamp. est souvent considéré comme l&#39;étalon-or pour les études de la membrane cellulaire, il est laborieux et exige des opérateurs hautement qualifiés pour des mesures de canaux ioniques. 8 Alors reconstituées artificiellement des membranes bicouches lipidiques ont émergé comme des outils alternatifs pour les études des canaux ioniques, 9,10 ils sont également associés à laborieuse des processus et des compétences spécifiques. Par ailleurs, les membranes sont sensibles aux perturbations mécaniques. Applications pratiques Ainsi, les technologies de bicouches lipidiques introduites à ce jour ont limité. 11 Afin d&#39;améliorer la robustesse et la longévité des membranes de bicouche lipidique, Costello et al. , 12, et Ide et Yanagida <sup&gt; 13 ont mis au point une bicouche lipidique autonome soutenue par hydrogels. Malgré une meilleure longévité cependant (&lt;24 h), bicouche robustesse n&#39;a pas été améliorée. Jeon et al. , 14 mis au point une membrane d&#39;hydrogel enrobé (HEM) avec un hydrogel intime bicouche lipidique de contact, ce qui entraîne une longévité accrue (jusqu&#39;à plusieurs jours). Pour augmenter encore la durée de vie du HEM, Malmstadt et Jeon et al. A créé une membrane d&#39;hydrogel encapsulé avec la liaison hydrogel-lipidique par conjugaison covalente in-situ (cgHEM). 15 Dans les deux systèmes, la durée de vie membranaires ont sensiblement augmenté (&gt; 10 jours) . Cependant, les systèmes de formation des membranes ne sont pas suffisamment robustes, et ne pouvaient pas être stockés ou livrés si nécessaire pour libérer l&#39;expertise pour l&#39;utilisation des bicouches lipidiques. Le développement d&#39;une plate-forme bicouche lipidique a principalement tourné autour de plus en plus de robustesse et de longévité de BLM. Bien que la longévité de BLM a été substantially améliorée récemment, leurs applications ont été limitées en raison d&#39;un manque de transportabilité et conservabilité. Pour surmonter ces problèmes, Jeon et al. A créé un système de membrane stockable et introduit un précurseur de membrane (MP). 16 Pour construire un député, ils ont préparé un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycéro-3-phosphatidylcholine) pour contrôler le point de la solution lipidique telle qu&#39;elle gèle à ~ 14 ° C ( en dessous de la température ambiante, supérieure à la température typique du réfrigérateur) congélation. Dans cette expérience, le député a été étalée sur une petite ouverture sur un polytétrafluoroéthylène (PTFE) Film et ensuite congelé dans un réfrigérateur à 4 ° C. Lorsque le MP est ramené à température ambiante, le MP décongelé et une bicouche lipidique est formée automatiquement, ce qui élimine l&#39;expertise typiquement associée à la formation de la membrane. Cependant, le taux de succès de BLM fait de la MP était aussi bas que ~ 27%, et la membrane formation temps était incompatible (30 min à 24 h), ce qui limite ses applications pratiques. Dans cette étude, un polydiméthylsiloxane (PDMS) film mince est utilisé à la place d&#39;un des films classiques hydrophobes minces (PTFE, polyoxyméthylène, polystyrène) à (a) le temps de contrôle de la fabrication et (b) augmenter le taux de formation BLM succès comme rapporté précédemment par Ryu et al. 17 Ici, la formation de la membrane a été facilitée par l&#39; extraction de solvants en raison de la nature poreuse de PDMS, et le temps nécessaire à la formation de la membrane a été contrôlée avec succès dans cette étude. Dans ce système, la solution lipidique a été absorbé dans le film mince PDMS, un temps de formation d&#39;une membrane uniforme a été obtenue. De plus, la durée de vie de la membrane a été prolongée en raison de l&#39;absorption lente des solvants dans les PDMS de film mince, un résultat de l&#39;addition de squalène à la solution lipidique. Nous avons effectué des mesures optiques et électriques pour vérifier que les membranes formées en utilisant cette technique sont appropriés pour isur des études canaux.

<table><tbody><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Pour solution tampon</td></tr><tr><td>Tris-chlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Pour solution tampon</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Pour solution tampon</td></tr> <tr><td>n-décane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Pour solution lipidique</td></tr><tr><td>Hexadécane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>Pour solution lipidique</td></tr><tr><td>Squalène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Pour solution lipidique</td></tr><tr><td>Gramicidine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>Protéine membranaire</td></tr><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Pour la formation de membranes</td></tr><tr><td>Sylgard 184a et 184b kit élastromère</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>Pour produire un film mince PDMS</td></tr><tr><td>0.2 &mu ; m filter</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Pour filtrer la solution tampon</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Pour dissoudre les lipides de manière homogène</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Pour stériliser la solution tampon</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>Pour étaler le prépolymère PDMS</td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Pour éliminer les bulles d’air en prépolymère PDMS</td></tr><tr><td>500 &mu ; m&nbsp ; poinçon</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>Pour créer une ouverture sur la machine CNC à couche mince PDMS</td></tr><tr><td></td><td>PME négoce</td><td>SME 2518</td><td>Pour fabriquer une chambre de formation de membrane</td></tr><tr><td>Illuminateur à fibre optique halogène</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Pour éclairer l’ouverture d’un film mince PDMS pour l’observation optique</td></tr><tr><td>Microscope numérique</td><td>Bleu numérique</td><td>QX-5</td><td>Pour observer optiquement la membrane bicouche lipidique Formation</td></tr><tr><td>Électrode</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Pour observer électriquement la formation</td></tr><tr>de la membrane<td>Amplificateur de microélectrodes (amplificateur Axopatch)</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Pour mesurer la capacité de la membrane (décrit comme amplificateur de microélectrode dans le manuscrit)</td></tr></tbody></table>

formation automatisée lipid bicouche membrane utilisation d&#39;un thin film polydiméthylsiloxane

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Une bicouche lipidique artificielle, ou d&#39;une membrane lipidique noire (BLM), est un outil puissant pour étudier les canaux ioniques et les interactions entre protéines, ainsi que pour les applications de biocapteurs. Cependant, les techniques classiques de formation BLM présentent plusieurs inconvénients et ils nécessitent souvent une expertise spécifique et des processus laborieux. En particulier, BLM classiques souffrent de faibles taux de réussite de la formation et incohérente temps de formation de la membrane. Ici, nous démontrons un système de formation BLM stockable et transportable avec le temps d&#39;éclaircissage contrôlé et amélioré le taux de formation BLM en remplaçant les films classiquement utilisés (polytétrafluoroéthylène, polyoxyméthylène, polystyrène) polydiméthylsiloxane (PDMS). Dans cette expérience, un polymère poreux structuré tel que le PDMS film mince est utilisé. En outre, par opposition aux solvants classiquement utilisés avec une faible viscosité, l&#39;utilisation du squalène a permis un temps d&#39;éclaircissage contrôlée par absorption par un solvant lent PDMS, ce qui prolonge la durée de vie de la membrane. En additioncondition, à l&#39;aide d&#39;un mélange de squalène et de l&#39;hexadécane, du point de la solution lipidique de congélation est augmentée (~ 16 ° C), en outre, des précurseurs membranaires ont été produits qui peuvent être stockés indéfiniment et facilement transportable. Ces précurseurs membranaires ont réduit BLM temps de formation de &lt;1 h et atteint un taux de formation BLM de ~ 80%. Par ailleurs, des expériences de canaux ioniques avec la gramicidine A ont démontré la faisabilité du système membranaire.

Optimisation de la composition de solution MPES Différentes compositions de lipides et les solvants ont été testés pour reconstituer avec succès des membranes bicouches lipidiques de MPES. Le système MP avec un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC 14 présentait un faible taux de réussite de la formation de membrane (~ 27%). De plus, comme le film de PDMS extrait en continu la solution lipidique...

Nous démontrons un système stockable, transportable lipidique formation bicouche. Une membrane lipidique à deux couches peut être formée à l&#39;intérieur de 1 heure avec un taux de succès supérieur à 80% lors d&#39;un précurseur de membrane congelée est ramené à température ambiante. Ce système permettra de réduire les processus laborieux et expertise associés aux canaux ioniques.

Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d&#39;un Thin Film Polydiméthylsiloxane

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

L'objectif général de cette procédure est de décrire une méthode pouvant être utilisée pour étudier la formation automatisée d'un bicouche lipidique à l'aide d'un film mince de polydiméthylsiloxane. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des nanobiosenseurs concernant les interactions membrane-protéine. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la formation du bicouche lipidique est automatisée et reproductible.Pour commencer, préparez la solution tampon en mélangeant du chlorure de potassium, du tris hydrochlorure et de l'EDTA dans de l'eau distillée. Ensuite, ajustez le pH de la solution à 8,0. Puis, filtrez la solution à l'aide d'un filtre de 0,2 micron et stérilisez-la en autoclave à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, préparez la solution lipidique pour la pré-painture en dissolvant 3 % du lipide dans un mélange composé de deux parties d'undécane et de huit parties d'hexadécane en volume. Agitez la solution toute la nuit à l'aide d'un rotateur. Préparez également la solution lipidique pour la formation de la membrane en dissolvant 0,1 % du lipide dans le même mélange de deux parties d'undécane et de huit parti

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Bioengineering

Bioingénierie

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Jet microfluidique contre une bicouche lipidique de l'interface des gouttelettes fournit un moyen fiable pour générer des vésicules avec le contrôle de l'asymétrie de la membrane, l'incorporation de protéines transmembranaires, et l'encapsulation des matériaux. Cette technique peut être appliquée pour étudier une variété de systèmes biologiques où les biomolécules compartimentés sont souhaitées.

Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Nous présentons un protocole expérimental pour former une bicouche lipidique supporté sur des substrats solides, sans utiliser des vésicules lipidiques. Nous démontrons un procédé en une étape pour former une bicouche lipidique de dioxyde de silicium et l'or ainsi que des membranes supportées par domaine enrichi en cholestérol pour diverses applications biologiques.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

La génération d’émulsions doubles microfluidiques implique généralement des dispositifs avec une mouillabilité à motifs ou des composants en verre fabriqués sur mesure. Nous décrivons ici la fabrication et le test d’un générateur d’émulsion double entièrement polydiméthylsiloxane (PDMS) qui ne nécessite pas de traitement de surface ou de processus de fabrication compliqués, et qui est capable de produire des émulsions doubles jusqu’à 14 μm.

Double Emulsion génération utilisant un flux focus périphérique (PDMS) Co-axial

Solide-soutenus, sans protéines, double membranes bicouches phospholipidiques (DALG) peuvent être transformés en réseaux de nanotube de lipides complexes et dynamiques et peuvent servir de modèles 2D de bas en haut du réticulum endoplasmique.

Formation spontanée et le réarrangement des réseaux de Nanotube lipidique artificielle comme un modèle de bas en haut pour le réticulum endoplasmique

Nous rapportons un protocole pour produire une membrane hybride de lipide à l’interface eau/air en dopant la bicouche lipidique avec des molécules de cuivre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). La membrane lipidique hybride résultante a une structure lipidique/CuPc/lipide de sandwich. Ce protocole peut également être appliqué à la formation d’autres nanomatériaux fonctionnels.

Auto-assemblage de membranes lipidiques hybrides dopées de molécules organiques hydrophobes à l’interface eau/air

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Ici, un système bicouche lipidique soutenu par nanobar est développé pour fournir une membrane synthétique avec une courbure définie qui permet la caractérisation de protéines ayant une capacité de détection de courbure in vitro.

Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Le présent protocole décrit l’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), une technique microfluidique pour générer des liposomes biocompatibles. OLA produit des liposomes monodispersés de la taille d’un micron avec une encapsulation efficace, permettant une expérimentation immédiate sur puce. Ce protocole devrait être particulièrement adapté à la biologie synthétique et à la recherche sur les cellules synthétiques.

Ensemble liposome assisté par octanol sur puce pour la bio-ingénierie

Ce protocole présente une procédure de démoulage améliorée pour la technique de double coulée de polydiméthylsiloxane (PDMS) en introduisant de l’huile de silicone comme barrière non adhésive entre les couches de PDMS. Contrairement aux méthodes de modification de surface par plasma ou par produits chimiques, cette approche ne nécessite aucun équipement spécialisé ou coûteux, ce qui en fait une alternative plus accessible et plus rentable.

Double coulée de polydiméthylsiloxane amélioré (PDMS) par traitement à l’huile de silicone pour une réplication de la microstructure densément tassée

Apprenez la formation automatisée de bicouches lipidiques utilisant un film mince de polydiméthylsiloxane. Cette méthode permet une formation reproductible en moins d'une heure pour étudier les interactions membrane-protéine.

Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d'un Thin Film Polydiméthylsiloxane

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