Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d'un Thin Film Polydiméthylsiloxane

L’objectif général de cette procédure est de décrire une méthode qui peut être utilisée pour étudier la formation automatisée de bicouches lipidiques à l’aide d’un film mince de polydiméthylsiloxane. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des nanobiocapteurs concernant les interactions membrane-protéine. Le principal avantage de cette technique est que la formation de la bicouche lipidique est automatisée et reproductible.

Pour commencer, préparez la solution tampon en combinant du chlorure de potassium, du chlorhydrate de tris et de l’EDTA dans de l’eau distillée. Ensuite, ajustez le PH de la solution à 8,0. Ensuite, filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 micron et autoclavez la solution à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, préparez la solution lipidique pour la pré-peinture en dissolvant 3 % du lipide dans un mélange composé de deux parties d’undecane et de huit parties d’hexadécane en volume. Remuez la solution pendant la nuit à l’aide d’un rotateur. Préparez également la solution lipidique pour la formation membranaire en dissolvant 0,1 % du lipide dans le même mélange de deux parties d’undecane et de huit parties d’hexadecane en volume.

Remuez également cette solution pendant la nuit sur un rotateur. Afin de préparer un film mince PDMS, mélangez neuf parties de prépolymère avec une partie d’agent de durcissement dans une tasse de mélange. Placez cinq grammes de ce mélange dans une boîte de Pétri et essorez l’enrobage à 800 tr/min pendant 10 secondes pour former un film de 200 à 250 microns d’épaisseur.

Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un dessiccateur sous vide et tirez un aspirateur de 100 millitorr pendant deux heures pour éliminer les bulles d’air résiduelles. Ensuite, faites cuire le film mince dans un four pendant cinq heures à 70 degrés Celsius pour polymériser le PDMS. Une fois refroidi, coupez le film mince polymérisé en carrés de deux centimètres sur deux centimètres et utilisez un poinçon de 500 microns de diamètre pour faire une petite ouverture au centre du carré.

Ensuite, à l’aide d’une micropipette, pré-peignez les ouvertures avec un microlitre de solution lipidique à 3 %. Pour créer la chambre à membrane lipidique noire, concevez deux blocs symétriques pour la chambre à l’aide d’un logiciel de dessin 3D. Ensuite, fabriquez la chambre à l’aide d’un bloc de PTFE et d’une machine CNC.

Pour assembler la chambre, placez le film mince PDMS prépeint entre les deux blocs PTFE, de sorte que l’ouverture du film mince PDMS soit centrée avec le trou dans la chambre. Utilisez du verre de protection et de la graisse sous vide pour sceller les bords extérieurs de la chambre. Une fois scellée, immobilisez la chambre assemblée à l’aide d’écrous et de boulons.

Il est important de s’assurer que la chambre est bien scellée afin qu’il n’y ait pas de fuite de liquide. À l’aide d’une pipette, déposer 0,5 microlitre de la solution lipidique à 0,1 % sur l’ouverture de la couche mince PDMS, assemblée avec la chambre. Ensuite, placez la chambre dans un environnement refroidi en dessous de 10 degrés Celsius et stockez-la jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.

Pour former une membrane lipidique noire avec auto-assemblage accéléré, retirez la chambre du réfrigérateur et ajoutez deux millilitres de la solution tampon de chaque côté de la chambre. Mettez la chambre de côté pendant 10 minutes jusqu’à ce que le précurseur de membrane congelé décèle. Ensuite, placez la chambre sur un micro-manipulateur pour contrôler précisément l’élévation par rapport à la source lumineuse et au microscope.

À l’aide d’un illuminateur halogène à fibre optique, éclairez un côté de la chambre pour éclaircir l’ouverture du film mince PDMS. De l’autre côté, placez un objectif 20x aligné avec l’ouverture et observez le centre où la couleur devient plus brillante que l’anneau. Pour la mesure électrique, préparez des électrodes de chlorure d’argent en plaçant un fil d’argent de 208 micromètres d’épaisseur dans une solution d’hypochlorite de sodium pendant au moins une minute.

Ensuite, connectez les électrodes à un amplificateur de microélectrodes. Ensuite, placez les électrodes de chlorure d’argent de chaque côté de la chambre, de sorte qu’elles soient dans la solution tampon. À l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie, appliquez une forme d’onde triangulaire de 10 millivolts à travers la membrane pour obtenir une onde carrée.

Enregistrez les propriétés électriques de la membrane en cliquant sur le bouton d’enregistrement. Continuez à enregistrer jusqu’à ce qu’une onde carrée uniforme soit observée. Ensuite, quittez l’enregistrement en cliquant sur l’icône du carré noir.

Deux méthodes peuvent être employées pour incorporer la gramicidine A dans la bicouche lipidique. Tout d’abord, la gramicidine A peut être ajoutée directement à la solution lipidique avant d’étaler la solution lipidique sur l’ouverture de la couche mince PDMS. Deuxièmement, une solution de gramicidine A peut être ajoutée à la chambre lorsqu’une bicouche lipidique se forme.

Pour observer l’activité du canal A de la gramicidine, appliquez 100 millivolts à travers la membrane à une fréquence d’échantillonnage de 5 kilohertz pour mesurer le potentiel de rétention de la membrane. Enregistrez les propriétés électriques comme vous l’avez fait précédemment, en cliquant sur le bouton d’enregistrement. Au fur et à mesure que les activités des canaux ioniques sont affichées, continuez à enregistrer jusqu’à ce que divers sauts de courant soient observés pour confirmer l’incorporation des canaux ioniques.

Une fois confirmé, quittez l’enregistrement en cliquant sur l’icône du carré noir. Une fois l’enregistrement terminé, filtrez les données avec un filtre passe-bas de Bessel à 100 hertz à l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie. Observez les sauts actuels dans les données de potentiel de détention filtrées.

Ces sauts représentent la dimérisation d’un canal ionique A de gramicidine. Lorsque le précurseur de la membrane congelé a été amené à température ambiante pour décongeler, la formation de la bicouche lipidique est facilitée en raison de l’extraction du solvant hydrophobe dans la couche mince du PDMS. Cette séquence d’images montre la formation d’une bicouche lipidique, qui s’auto-assemble lorsqu’elle est réchauffée à partir de sa forme gelée.

Ici, la conductance électrique illustre l’incorporation et la dimérisation de la gramicidine A. Lors de la dimérisation, la gramicidine A forme un canal ionique et les niveaux de conductance passent à 28 picosiemens, ce qui est cohérent avec les résultats des rapports précédents et montre l’incorporation immédiate de cet antibiotique dans la bicouche. Notre technique de formation membranaire fournit un outil puissant pour l’étude des membranes cellulaires et des nanocanaux, contrairement aux techniques conventionnelles qui ont un potentiel limité d’application pratique. Notre système ne nécessite aucune expertise pour la formation de membranes ou l’incorporation de canaux ioniques, ce qui le rend bien adapté aux applications de criblage de médicaments et de biodétection.