Haute résolution Time-lapse d'imagerie et d'analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine et d’analyser la dynamique du cytosquelette et la migration cellulaire à l’aide de l’imagerie en accéléré de cellules vivantes. Les méthodes décrites dans cette vidéo peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, moléculaire et mécanobiologique. Par exemple, ce protocole peut être utilisé pour identifier comment la forme et la motilité des cellules sont modulées par l’engagement de différents ECM.

La démonstration visuelle est essentielle car les étapes de préparation des échantillons sont difficiles à réaliser. Ils nécessitent une manipulation précise des cellules en temps opportun tout au long du processus. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la motilité des cellules endothéliales au cours de l’angiogenèse, elle peut également être appliquée à des investigations microscopiques de pratiquement n’importe quel système de modèles cellulaires adhérents.

À l’aide d’une pince, prenez une lamelle dans un bocal de stockage à 100 % éthanol et passez-la à la flamme d’un bec Bunsen pour la stériliser. Placez-le ensuite dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Préparez une lamelle pour chaque échantillon.

À un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, ajoutez 10 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution mère de fibronectine et 990 microlitres de PBS. Ensuite, pipetez 250 microlitres de la solution sur chaque lamelle. Étalez la solution uniformément pour couvrir la surface.

Incuber les lamelles pendant au moins trois heures à 37 degrés Celsius. Avant utilisation, rincez chaque lamelle trois fois avec deux millilitres de PBS. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminer le nombre de HUVEC cultivés et transférer un volume contenant 100 000 cellules par lamelle pour les expériences de non-migration, ou 500 000 cellules par lamelle pour les expériences de migration dans un tube de microcentrifugation.

Faites tourner les cellules à 1 400 fois fois G pendant quatre minutes pour les granuler. Après le spin, pour chaque condition à tester, remettre en suspension jusqu’à un million de cellules dans 100 microlitres de tampon d’électroporation et les combiner avec un microgramme d’ADNc. Transférez les cellules dans une cuvette d’électroporation.

Transfectez les cellules et le mélange d’ADN à l’aide du programme désigné pour l’électroporation HUVEC. Ensuite, sauvez les cellules transfectées en ajoutant 500 microlitres de milieu basal endothélial complet. Ensuite, plaquez le volume cellulaire approprié sur des lamelles enrobées de fibronectine.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures pour laisser le temps à l’expression des constructions de l’ADNc. En préparation de l’imagerie, prenez deux bandes de 2,5 centimètres sur 0,65 centimètre de ruban adhésif double face et fixez-les horizontalement le long des bords supérieur et inférieur d’une lame de verre propre. Notez qu’il est important de laisser une petite quantité d’espace entre le ruban et le bord coulissant pour sceller la chambre.

Montez la lamelle côté cellule vers le bas de sorte que les deux bords de la lamelle reposent sur le ruban. À l’aide d’une pince, appuyez doucement pour fixer la lamelle. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 40 microlitres de support d’imagerie entre la lamelle et la lame.

Assurez-vous que l’espace entre la lamelle et la lame est complètement rempli de support d’imagerie. Épongez tout excès de support avec une lingette en papier si nécessaire. Scellez tous les bords de la glissière avec du VALAP chaud.

Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites en appuyant doucement sur la lamelle en verre. Placez la lamelle montée et scellée sur une platine de microscope préchauffée à 37 degrés Celsius. À l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif, capturez des séquences d’images en accéléré, des images de protéines fluorescentes bleues et des images DIC.

Analyser la dynamique des microtubules et la co-localisation comme décrit dans le document d’accompagnement. Pour effectuer un test de migration cellulaire, après l’étape d’électroporation, sauvez les cellules transfectées en ajoutant 80 microlitres de milieu basal endothélial complet. Ensuite, pipetez l’échantillon entier de 80 microlitres en une seule goutte au centre d’une lamelle séchée enrobée de fibronectine.

Ne répandez pas la goutte. Le séchage de la lamelle est nécessaire pour éviter que la goutte de 80 microlitres ne se sépare au contact de la lamelle. Cette approche permet de concentrer les HUVECs dans une petite zone de la lamelle de recouvrement et favorise ainsi la formation rapide d’une monocouche confluente de cellules.

Incuber la lamelle à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures pour laisser le temps aux cellules d’adhérer en une monocouche confluente. Ensuite, rincez les lames deux fois dans un milieu basal endothélial complet pour éliminer toutes les cellules qui ne se sont pas attachées. Pour créer un bord de plaie sur la monocouche HUVEC, utilisez une pince pour maintenir doucement la lamelle en place et faites glisser fermement une lame de rasoir au centre de la monocouche cellulaire.

Laissez les cellules se rétablir dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, assemblez et montez les lamelles pour l’imagerie comme précédemment. Acquérez des images en contraste de phase à 10 minutes d’intervalle pendant 12 heures à l’aide d’un objectif de phase à ouverture numérique 10X 0,45 et d’un condenseur à longue distance de travail à ouverture numérique de 0,52.

Utilisez le panneau Acquisition ND du logiciel d’acquisition d’images. Enfin, quantifiez la ramification et la migration de HUVEC comme décrit dans le document d’accompagnement. Les HUVECs ont été transfectés pour exprimer mApple-marked-EB3, une protéine de liaison aux extrémités des microtubules, et des images en accéléré ont été capturées.

Des images brutes d’EB3 sont montrées à gauche. Les comètes bleues EB3 suivies par le logiciel plusTipTracker sont montrées à droite. Les comètes détectées dans chaque image ont été liées en fonction de leur changement de position d’une image à l’autre pour générer des pistes EB3 et une superposition visuelle de pistes EB3, comme illustré ici.

La croissance lente et à courte durée de vie des microtubules est indiquée en rouge, la croissance lente et à longue durée de vie est indiquée en vert, la croissance rapide et à courte durée de vie des microtubules est indiquée en jaune et la croissance rapide et à longue durée de vie des microtubules est indiquée en bleu. Pour analyser la ramification des cellules endothéliales, une CIVD et une image fluorescente d’un HUVEC individuel ont été capturées à un grossissement de 60 fois. Une limite a été dessinée à la main autour du bord de la cellule dans l’image fluorescente.

Les origines des branches ont ensuite été définies en traçant une ligne droite à travers la branche et à travers le plus grand angle de courbure de chaque côté de la branche. Les branches plus longues que larges et d’une longueur minimale de 10 microns ont été comptées et la longueur a été mesurée de l’origine de la branche à l’extrémité distale de la branche. Pour évaluer la migration du bord de la plaie des cellules endothéliales, les HUVECs ont été cultivés à haute densité et une imagerie en accéléré des cellules vivantes a été réalisée après la blessure, comme décrit dans cette vidéo.

Comme le montre ici, les cellules endothéliales du bord de la plaie ont migré dans la zone de la plaie. Ce mouvement a été analysé à l’aide du nucléole comme marqueur fiduciaire pour suivre la vitesse, la persistance et la distance de migration. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver, de transfecter et de préparer les HUVEC pour les expériences d’imagerie de la forme cellulaire et de la dynamique du cytosquelette ou pour les études de migration cellulaire en bordure de la plaie.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le polyacrylamide ou la conjugaison du collagène peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à l’engagement cellulaire des ECM modifiées. Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.