Name: Haute résolution Time-lapse dimagerie et danalyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez l'imagerie en time-lapse haute résolution pour analyser la dynamique des microtubules dans les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine. Cette méthode permet d'étudier la motilité cellulaire et le comportement du cytosquelette en temps réel.

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Un merci spécial à Dr. Clare M. Waterman pour le mentorat et les discussions, Michelle Baird et Mike Davidson pour fournir un grand nombre de constructions d&#39;ADNc fluorescents utilisés dans ces études, et Kathryn Applegate et Gaudenz Danuser pour le développement de logiciels d&#39;analyse plusTipTracker MT. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention à KAM du National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) et le National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Utilisation de HUVEC en Morphologie et migration expériences. imagerie des cellules vivantes de la dynamique de croissance de MT EB3 marqué au sein de HUVEC nécessite des conditions de culture cellulaire appropriés et reproductibles afin de mesurer et d&#39;évaluer les changements dans la croissance MT et HUVEC morphologie, de telle sorte qu&#39;ils peuvent être affectés à une signalisation de la MEC cue. HUVEC représentent un excellent modèle pour l&#39;étude de la forme des cellules et la motilité. Ils sont extrêmement sensibles à la transfection avec des ADNc marquées par fluorescence, ils présentent des morphologies dramatiques en réponse aux deux signaux de signalisation solubles et physiques, et ils maintiennent la capacité à s&#39;organiser dans des tubes vasculaires lorsqu&#39;ils bénéficient de conditions de culture de cellules appropriées 65-70. des cultures de cellules primaires, telles que HUVEC, nécessitent un traitement et le suivi du numéro de passage cellulaire prudent afin d&#39;assurer que les cellules sont en bonne santé et qu&#39;ils se comportent normalement lors de l&#39;expérimentation. Par exemple, lors d&#39;expériences portant sur l&#39;cytoskeletonne et / ou la morphologie des cellules, des cellules HUVEC ne doivent pas être utilisés pour des expériences au-delà du dixième passage de la culture cellulaire, comme HUVEC commencent généralement à afficher des morphologies non uniformes autour de passage de douze à quinze. La densité cellulaire est également un régulateur essentiel de la santé et de la prolifération HUVEC. enquêtes de branchement HUVEC (voir Protocole 10.01 à 10.04, ci-dessus) utilisent des cultures de densité relativement faible de la cellule afin de fournir les cellules d&#39;espace physique pour interagir avec leur ECM et d&#39;étendre les saillies ramifiées. En revanche, dans les études de migration plaie de pointe (voir Protocole 10/05 au 10/08), les HUVEC sont la culture en monocouche avant la blessure. En tant que tel, HUVEC blessure pointe affichent une morphologie relativement non-ramifié, étendre menant des saillies de bord, et présentent des interactions cellule-cellule avec leurs voisins immédiats comme ils migrent dans la plaie. Mises en garde et avantages de suivi MT Dynamics dans Living HUVEC. Spinning microscopie disque est une excellente approche pourtester des hypothèses expérimentales qui nécessitent image confocale clarté haute résolution temporelle. Avec le module de caméra et laser approprié, cette approche de microscopie est sensible à une faible émission de fluorescence et peut aider à photoblanchiment réduite par rapport à d&#39;autres types de microscopie à fluorescence. Fait important, cette approche est également bien adapté à modéré à élevé résolution temporelle imagerie est nécessaire pour générer des mesures complètes de la dynamique de croissance MT en utilisant l&#39;approche de l&#39;étiquetage EB3, dans une variété de différents types de cellules. Bien que la méthodologie de EB3 de l&#39;étiquetage croissante MT plus-extrémités présente des avantages distincts par rapport à d&#39;autres méthodes d&#39;étiquetage par fluorescence MTs, elle a aussi des inconvénients uniques. Par exemple, il y a une partie de la gamme MT qui ne sont pas en croissance active à un moment donné, y compris à la fois la population de MTs désassemblage et la population de stabile, MTs non dynamiques 71-74. EB3 ne serait pas étiqueter ces deux populations de MTs etdonc la contribution de ces deux populations ne serait pas inclus dans l&#39;analyse des données expérimentales. méthodes alternatives pour l&#39;évaluation de l&#39;ensemble du réseau de MT ont mis l&#39;accent sur l&#39;expression de la tubuline marquée par fluorescence, qui incorpore dans toutes les populations de MTs et permet l&#39;identification de plus en plus, le rétrécissement, et stabile MTs. Cependant, en raison de la densité relativement élevée de la matrice MT près du centre de la cellule et à côté du centre organisateur des microtubules (MTOC), marquage de l&#39;ensemble de la matrice MT crée un inconvénient dans l&#39;exécution de l&#39;analyse d&#39;image des extrémités MT qui ne sont pas à proximité de la cellule périphérie 75-77. Des expériences utilisant deux couleurs co-marquage de MTs avec la tubuline fluorescente et EB3 fluorescente dans les cellules vivantes ont révélé, qualitativement, que la grande majorité des MTs de tubuline marqués sont également EB3 marqué 78. En outre, il n&#39;a pas été une méthode efficace de suivi automatisé des MTs étiquetés avec la tubuline fluorescente. Cela signifie que les données collection et de mesures de la dynamique MT dans les cellules exprimant la tubuline fluorescente nécessitent un suivi de main de MTs individuels, un processus qui est sujette aux erreurs et fastidieux. Par conséquent, l&#39; analyse automatisée de calcul EB3 marqué MTs est devenue la méthode préférée pour la mesure de la dynamique des MT , car il peut être appliqué à TA dynamique des expériences sur de nombreux types cellulaires et dans une variété de régimes expérimentaux 35,79. Lier MT Growth Dynamics à HUVEC Morphologie et migration. Du point de vue d&#39;un enquêteur du cytosquelette, une adaptation extrêmement utile de l&#39;plusTipTracker analyse automatisée de suivi est la capacité de mesurer et d&#39;évaluer les deux cellules et régionales des changements entiers dans la dynamique de croissance MT. L&#39;exigence d&#39;une cellule à devenir polarisée est une condition préalable essentielle pour la migration cellulaire directionnelle. En tant que tel, les indices de signalisation polarisées sont connus depuis longtemps comme des facteurs clés de conduite pour la migration cellulaire directionnelle 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Par exemple, des molécules de signalisation solubles tels que le VEGF induisent la polymérisation de l&#39; actine et de la croissance MT vers la queue de VEGF dans des types de cellules endothéliales 2,82-87. En outre, en réponse à des interactions physiques avec l&#39;ECM (par exemple, la conformité et la dimensionnalité mechanosensing), HUVEC moduler leur dynamique de MT en régulant localement MAPs pour promouvoir la croissance de MT dans les allongeant saillies ramifiées, et cela sert à guider la migration HUVEC dans le sens de la cue 5,31,88. Ainsi, la polarisation en réponse à extracellulaires signalisation des indices met en évidence la nécessité d&#39;une évaluation expérimentale des changements localisés dans la dynamique du cytosquelette. Simultanée imagerie des cellules vivantes de la dynamique MT de croissance (en utilisant l&#39;approche de EB3) et la migration des cellules HUVEC est extrêmement difficile à réaliser parce que MTs poussent sur une échelle de temps de secondes, tandis que les changements dans la morphologie cellulaire et la migration directionnelle se produisent sur une échelle de temps des heures. Pourtant, les deux processus sont intimement linkeré. De plus, en continu, l&#39;imagerie rapide de EB3 d&#39;marqué par fluorescence sur la seconde échelle de temps conduit à photoblanchiment du signal de EB3. Les tentatives de surmonter ce problème en effectuant de courtes séries d&#39;imagerie de EB3 (série d&#39;acquisition 1-2 min) toutes les 30 minutes ont été couronnés de succès, mais ne pouvait être accompli dans un petit nombre de ECs qui avait une expression optimale de EB3 et qui n&#39;a pas afficher défavorable effets à répétition illumination laser 5. Une approche alternative qui permet des interprétations de la façon dont la dynamique de croissance MT contribuent aux changements dans la morphologie cellulaire et la migration est la région plusTipTracker d&#39;intérêt (ROI) outil 35 (voir le protocole 6.6). Cette méthodologie permet une croissance entière de MT cellulaire pistes pour être sous-divisé en régions définies par l&#39;utilisateur, à partir de laquelle les pistes de croissance MT peuvent ensuite être extraites et analysées. Par exemple, des comparaisons de «ramifié» par rapport à des régions «non-ramifiés&quot; de la cellule ont révélé que MTs croître plus spetits et plus persistant au sein des régions ramifiées par rapport à la périphérie des cellules 5 non ramifié. Dans la plaie de pointe polarisée HUVEC, les comparaisons des principaux bord de fuite et la dynamique de croissance bord de MT a révélé que induit MCAK-MT désassemblage est inhibée spécifiquement dans le bord d&#39;attaque, mais pas le bord de fuite. évaluation régionale de début et de fin dynamique de croissance bord de MT dans HUVEC exprimant Rac1 et / ou mutants de phosphorylation de MCAK a en outre révélé que l&#39;activation Rac1-induite de kinase Aurora-A spécifiquement et localement inhibe l&#39;activité de MCAK dans le bord d&#39;attaque pour conduire HUVEC polarisation et migration directionnelle 31. Ainsi, la combinaison de suivi automatisé de la dynamique de croissance MT et de l&#39;évaluation régionale du MT dynamique de croissance dans les saillies ramifiés et / ou le bord d&#39;attaque de la plaie bord HUVEC nous a permis de relier la dynamique de croissance MT à HUVEC morphologie et de la migration. Les protocoles décrits sont designed de fournir une méthodologie généralement simple et hautement reproductible pour la culture HUVEC et investigation expérimentale. Néanmoins, la plupart des détails du protocole sont complexes et prennent du temps, ce qui, à son tour, offre la possibilité d&#39;erreurs ou de difficultés dans la conduite de la méthode expérimentale. Bien qu&#39;il ait été tenté de résoudre les problèmes potentiels à travers le protocole, est ici fourni, le dépannage détaillé des problèmes potentiels qui sont moins courants ou autrement abrégé en notes dans les protocoles méthodologiques. Associées à des lamelles de revêtement avec des substrats de polyacrylamide (protocole de 2,2), un problème commun qui se pose est la complexité de l&#39;activation des lamelles de verre, le couplage de polyacrylamide au verre, en activant le polyacrylamide, puis le couplage ECM à l&#39;polyacrylamide. Une étape particulièrement difficile et potentiellement problématique est la culture de HUVEC sur le gel de fibronectine / polyacrylamide après une exposition de l&#39;polyades lamelles couvre-crylamide revêtu à 2 mM sulfo- SANPAH (étape 2.2.2.6, ci-dessus). Il est critique pour le succès de la mise en culture des cellules HUVEC sur ces substrats sulfo- SANPAH être complètement retiré du système expérimental suivant ECM conjugaison. Ceci peut être mieux accomplie par lavage à l&#39; ddH 2 O et en incubant les lamelles en ddH 2 O sur un agitateur pendant une nuit. Si les cellules cultivées sur les ECM de polyacrylamide ne survivent pas, ou si la viabilité est moins que prévu, a augmenté et a répété le lavage des sulfo-SANPAH après conjugaison à la fibronectine (étape 2.2.2.9) est recommandée pour atténuer potentiellement ce problème. Associés au protocole 3 (ADNc transfection et culture HUVEC sur une lamelle), une influence majeure au succès de la procédure d&#39;électroporation est la manipulation des HUVEC à la fois pendant la trypsine des cellules pour les retirer de la fiole en plastique, et après la conclusion de l&#39;électroporation (étapes 3.3 à 3.4 ci-dessus). Il est essentiel de prendre soincontrôler complètement le HUVEC tandis que la trypsine, et ne pas dépasser le temps nécessaire pour que les cellules «round-up&quot; à la surface du ballon (généralement 1-2 minutes). temps excessif dans la trypsine est une cause majeure de HUVEC la mort, qui est généralement pas réalisé jusqu&#39;à ce que les cellules sont étalées sur des lamelles revêtues de fibronectine (étape 3.4) et ne parviennent pas à fixer sur le substrat. D&#39;une importance similaire, HUVEC (et la plupart des types de cellules primaires) ne se portent pas bien lorsqu&#39;ils sont suspendus pendant de longues heures dans le tampon d&#39;électroporation. Au cours d&#39;expériences à grande échelle, par exemple, où l&#39;utilisateur dispose de cinq ou plusieurs conditions qui nécessitent une électroporation, il est préférable de garder les cellules sédimentées dans des tubes individuels (1 tube par transfection) et de les mélanger, un à-un-temps , dans le tampon d&#39;électroporation immédiatement avant électroporation. Cette approche réduit le temps d&#39;incubation dans le tampon d&#39;électroporation et de survie HUVEC maximisée. En outre, le sauvetage immédiat dans les milieux de culture complet est aussi critical électroporation suivant. retards de sauvetage d&#39;une minute ou plus électroporation suivantes peuvent entraîner près de la mort complète HUVEC et doivent donc être évités. Liés détermination de migration cellulaire (Protocole 9), la technique de culture de cellules HUVEC à une densité extrêmement élevée dépend d&#39;une modification critique (décrit à l&#39;étape 9.2) de la méthode de culture de cellules HUVEC classique (décrite dans le protocole n ° 3) qui nécessite un séchage de la fibronectine enduit lamelle afin de permettre à la culture de HUVEC dans une très petite zone de la lamelle couvre-objet. Souvent, si la lamelle couvre-objet ne soit pas complètement séché, ou si le revêtement préalable de la lamelle couvre-objet avec de la fibronectine (étapes 2.1 ou 2.2) n&#39;a pas été efficace, les cellules contenant un milieu qui est placée sur la lamelle couvre-objet vont perdre sa tension de surface et augmenter la les bords de la lamelle, ce qui réduit la densité des cellules sur la lamelle. Une méthode pour résoudre ce problème potentiel est d&#39;aspirer les médias de la lamelle, puisplacer la lamelle (encore dans son plat de 35 mm) à l&#39;arrière de l&#39;enceinte de sécurité biologique pendant 5-10 min. Cette adaptation peut contribuer à permettre l&#39;écoulement d&#39;air à l&#39;intérieur du coffret pour faciliter le séchage de la vaisselle. Si un liquide visible reste sur la lamelle après séchage à l&#39;air, aspirez les taches liquides et encore laisser sécher pendant 5-10 minutes supplémentaires dans l&#39;armoire de biosécurité. Il est important de noter qu&#39;il n&#39;y a aucun moyen d&#39;éviter complètement ce problème potentiel, mais il ne devient moins d&#39;un problème avec la pratique répétée du protocole. Il est également une recommandation de dépannage lors de la préparation des lamelles pour le dosage de la migration des cellules (ou tout dosage, en général), pour préparer des lamelles supplémentaires et ont HUVEC supplémentaires prêt-à-aller en cas de problèmes le long du chemin. Avec ces considérations de dépannage à l&#39;esprit, il est également important de mettre en évidence l&#39;utilité des protocoles discutés et leurs implications dans les futures recherches sur la biologie cellulaire. L&#39;applicabilité à l&#39;polyacrapproche ylamide est vaste et comprend non seulement des études en deux dimensions de l&#39; engagement cellule-ECM (décrit ci - dessus), mais aussi des enquêtes en trois dimensions 5. Cette application est essentielle pour accroître notre compréhension de la façon dont HUVEC régulent la forme des cellules et de la migration dans des environnements physiologiques et devrait fournir aux chercheurs une compréhension de base de la façon dont les changements morphologiques sont coordonnés avec les changements du cytosquelette. Bien que les protocoles décrits ici se concentrent sur des mesures de la dynamique de croissance MT, la majorité des protocoles peut et doit être adapté pour mesurer un certain nombre d&#39;autres aspects des interactions microscopiques mesurables cellule-ECM. En ce qui concerne la dynamique MT, il existe de nombreuses cartes, y compris au moins 14 familles de kinésines 89, chacun ayant un rôle potentiel dans la contribution à HUVEC polarité et migration dirigée, et qui peuvent tous être étudiés en utilisant les protocoles présentés. Les recherches futures devraient uneLSO être ciblées sur l&#39;engagement des cellules ECM dans des conditions normales par rapport à des états pathologiques. protocoles HUVEC présentés ici sont applicables aux enquêtes sur les processus homéostatique vasculaires normales, ainsi que des états pathologiques, y compris les maladies cardiaques, la rétinopathie, la croissance tumorale et les métastases, pour ne citer que quelques-uns. Conjuguer ECM et polyacrylamide substrats visiblement transparents de conformité se prêtent à des études microscopiques permettra des études d&#39;engagement cellulaire ECM tels que l&#39;angiogenèse des cellules endothéliales vasculaires peut être contrôlé avec une résolution spatiale et temporelle. Ces types d&#39;approches expérimentales ont déjà commencé à révéler d&#39; importantes différences dans la forme des cellules endothéliales, la polarité, la migration, et les effets des protéines qui régulent ces processus 5,31,90. Les efforts futurs devraient viser à déterminer comment la combinaison de la conformité ECM et dimensionnalité mechanosensing peut servir à localement des protéines de contrôle qui ciblent et régulent la dynamique du cytosquelette.

L&#39;angiogénèse est déclenchée par des signaux de signalisation extracellulaire qui favorisent les cellules endothéliales (EC) pour polariser la migration directionnelle avec une spécificité et de former de nouveaux vaisseaux dans les tissus qui nécessitent une alimentation en sang. Les facteurs contributifs pensé à conduire l&#39;angiogenèse sont des signaux à partir de la matrice extracellulaire (ECM). En réponse à des signaux physiques, CEs étendre de nouvelles branches avec une spécificité directionnelle pour guider le mouvement directionnel dans la formation du 1,2 du réseau vasculaire. L&#39;architecture de la morphologie CE et ramification est défini par la réglementation localisée du cytosquelette de microtubules (MT) d&#39;une manière qui est coordonnée avec la réglementation des acto-myosine contractilité 3. Pour les branches CE pour former, myosine-II doit être downregulated localement, ce qui entraîne des protubérances membranaires localisées 4. Dans le même temps et au même endroit dans la cellule, la dynamique de croissance MT se modifient résultant de la croissance de MT lente et persistante de promouvoir la branche elontion et de la stabilité 5. Ce règlement cytosquelette coordonné permet ECs de polariser leur morphologie pour faciliter la migration directionnelle. Le développement d&#39;une morphologie cellulaire polarisée monter MT polarisée 6. Dans la migration des cellules épithéliales, MTs se développent lentement et de façon persistante spécifiquement à la fine pointe de la cellule 7-9; tandis que dans les neurones, l&#39;initiation et de l&#39; allongement des axones ou dendrites exige que MTs sont non seulement présents, mais qu&#39;ils subissent dynamiquement les processus de montage et de démontage 10-15. De cette façon, le contrôle localisé de la dynamique de croissance MT détermine l&#39;architecture de la cellule et permet un remodelage rapide de la morphologie des cellules comme CEs naviguer à travers leur ECM. la dynamique de croissance MT sont réglementées par des familles de protéines motrices moléculaires et des protéines non-motrices, appelées microtubules Associated Proteins ou microtubules protéines interagissant (désormais réféRRED comme MAPs). Les cartes peuvent être activées localement ou inactivé, généralement par des cascades initiées à l&#39;interface cellule-ECM 16,17 signalisation. Fonction Une fois activé, MAPs en se liant à la MT et de modifier la cinétique de MT montage et le démontage; fonctionnant ainsi de réguler localement la dynamique MT afin de promouvoir la forme des cellules et de la polarité 18-20. Mitotique Centromere Associated Kinesin (MCAK) est un MAP Kinesin-13 famille qui se lie aux extrémités et les couples d&#39;hydrolyse de l&#39; ATP à MT désassemblage 21-23 MT. Ce rôle fonctionnel de MCAK est connue pour être critique dans le fuseau mitotique 24-28, ainsi que pendant l&#39; interphase 29,30. Dans interphase CEs, MCAK médiée MT désassemblage est régulée par localisée Aurora-A phosphorylation induite par des MCAK en réponse à remontage bord activation induite de la petite GTPase Rac1. Le résultat de cette cascade de signalisation est l&#39;inhibition de MCAK à la fine pointe de la COCOM, entraînant une croissance de MT polarisée vers le leading bord et induits MCAK-MT désassemblage au niveau du bord de fuite de la migration 31 CEs. méthodes traditionnelles de mesure de la dynamique de croissance MT ont généralement utilisé le suivi de la main de l&#39;une ou l&#39;autre tubuline marqué par fluorescence ou, plus récemment, marqué par fluorescence MT Fin protéine de liaison 1 ou 3 (EB1 ou EB3, respectivement). L&#39;approche de la tubuline fluorescente a l&#39;avantage d&#39;étiqueter l&#39;ensemble du réseau de MT. Cependant, comme la plupart des types de cellules mitotiques à maintenir un réseau radial de MTs pendant l&#39; interphase 8,32,33, MTs près du centrosome sont très denses, et en conséquence, le suivi de l&#39; évolution de la MT et le démontage avec la tubuline fluorescente est généralement limitée à la périphérie des régions de la cellule. En raison de ces limitations, l&#39;utilisation des protéines EB marquées par fluorescence (EB1 ou EB3) a été l&#39;approche plus commune pour mesurer la dynamique de MT. Parce que EBs seule l&#39;étiquette les plus-extrémités croissantes de MTs, ils apparaissent comme de petite taille (1-3 pm), fluorescent brillamment venirts, fournissant ainsi un marqueur facilement discernable de polymérisation MT avec un fond très limité fluorescence 34-37. Bien que le fait que l&#39;étiquette EB seulement un sous-ensemble du réseau MT représente un atout majeur de l&#39;approche EB, il met également en évidence une limitation importante, que les MTs non-croissance ne sont pas marqués par l&#39;approche de EB3. Néanmoins, la capacité de mesurer et de suivre les comètes EB3 au fil du temps et de visualiser la croissance MT dans les régions sub-cellulaires font de cette approche idéale pour les applications qui nécessitent une évaluation régionale de l&#39;organisation MT. Une autre limitation critique des méthodes traditionnelles de mesure dynamique de croissance MT a été très grands ensembles de données et le temps nécessaire à l&#39;analyse des données. Cette limitation découle de la nécessité pour le suivi de la main de centaines de comètes EB à haute résolution temporelle. En outre, ces mesures doivent être effectuées dans un nombre statistiquement significatif de cellules et également réalisée sous une variété de contrôle et experimeconditions NTAL. Récemment, ces contraintes ont été surmontées grâce à des techniques d&#39;analyse de calcul spécifiquement destinés aux comètes suivi EB3 utilisant la microscopie time-lapse dans les cellules vivantes 35. Lorsqu&#39;il est utilisé de manière appropriée, cette approche de calcul sert à la fois de restreindre les possibilités d&#39;erreur humaine associée à la main suivi en plus de fournir une méthode à haut débit de mesure polymérisation MT. Analyse computationnelle de la dynamique MT en utilisant le progiciel basé sur MatLab, plusTipTracker, permet des mesures de croissance MT par le suivi des comètes EB3 marqués par fluorescence 5,31,35,38. En outre, le logiciel plusTipTracker permet de calculer des événements catastrophiques MT (aka démontage) basé sur la disparition des comètes EB3 dans une piste de MT de plus en plus, et permet une analyse sub-cellulaire (aka régionale) de la dynamique de croissance MT dans les régions définies par l&#39; utilisateur d&#39;intérêt . Pour nos études, la dynamique de croissance MT ont été comparés dans lesrégions ramifiées par rapport à des régions non-ramifiés, ou dans menant contre les bords de fuite des cellules. La sortie de données à partir du logiciel plusTipTracker peut également être utilisé pour générer des superpositions de piste à code couleur pour les cellules individuelles et les régions sub-cellulaires. Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour étudier le rôle de MCAK dans la modulation de la dynamique de croissance de MT et la contribution de ce MT dépolymérase à la réglementation des CE ramification morphologie et migration directionnelle. Notre approche a utilisé une première ligne de cellules humaines, des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont faciles à cultiver et se prêtent très bien à induit électroporation, transfection transitoire du plasmide d&#39;ADNc. Nous avons ensuite utilisé à haute résolution, time-lapse de microscopie par fluorescence de HUVEC transfectées avec MT End Binding Protein 3 (EB3) et mitotique Centromere Associated Kinesin (MCAK) ADNc spécifique de constructions pour évaluer les effets sur la dynamique MT transfectées HUVEC. analyse d&#39;image de calcul basée sur PlusTipTracker de EB3MT, plus marqué au extrémités était de mesurer la vitesse de croissance MT et la durée de vie de croissance MT dans les images en accéléré, de mesurer et de comparer les effets des manipulations expérimentales sur la dynamique de croissance MT. Cette méthodologie permet l&#39;étude de la dynamique MT et l&#39;identification de la façon dont la régulation localisée de la dynamique MT dans les régions sous-cellulaires contribue aux processus angiogéniques des CE de ramification et de la migration. Ces techniques sont applicables aux enquêtes de toute carte qui peuvent être marquées par fluorescence et exprimés dans les cellules vivantes.

<table><tbody><tr><td>Inhibiteur d’Aurora A I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>Solution 2 % Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltriméthyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm module de combinaison laser MLC400 haute puissance</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash ; billes d’immunoprécipitation IgG de souris Réactifs</td><td>TrueBlot ; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash ; billes d’immunoprécipitation IgG de lapin Réactifs</td><td>TrueBlot ; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, Filtre d’émission DAPI-ET</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Filtre d’émission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Filtre d’émission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Filtre d’émission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Fraction V</td><td>Produits RPI</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Caméra à dispositif à couplage de charge refroidie Clara</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 âne anti-lapin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 chèvre anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Approvisionnement & Facteurs de croissance (contenu indiqué ci-dessous)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrait de cerveau bovin 2,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamycine 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine (10 000 UI Pen/ml, 10 000 &#181 ; g Streptocoque/ml)&nbsp ; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Obturateur électronique</td><td>Instrument Sutter</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Inhibiteur de protéase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP chèvre anti-souris</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP chèvre anti-lapin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanoline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnésium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Platine motorisée</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-tubuline (DM1A)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contient le tampon d’électroporation</td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 UI Pen/ml, 10 000 &#181 ; g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&ndash ; pT288&ndash ; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&ndash ; &alpha ;-tubuline</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Disque tournant&nbsp ;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

haute résolution time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules dynamics living ombilicale humaine cellules endothéliales de veine

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Le processus physiologique par lequel de nouvelles voies vasculaires se forment à partir de la technologie vasculaire existante nécessite des événements de signalisation spécifiques qui déclenchent des changements morphologiques au sein des cellules endothéliales individuelles (CE). Ces processus sont essentiels pour l’entretien homéostatique tel que la cicatrisation des plaies, et sont également cruciaux pour favoriser la croissance tumorale et les métastases. La morphologie de l’EC est définie par l’organisation du cytosquelette, un système étroitement régulé de dynamique de l’actine et des microtubules (MT) qui est connu pour contrôler la ramification, la polarité et la migration directionnelle de l’EC, composants essentiels de l’angiogenèse. Pour étudier la dynamique de la MT, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence haute résolution couplée à l’analyse d’images computationnelles des extrémités positives de la MT marquées par fluorescence pour étudier la dynamique de croissance de la MT et la régulation de la morphologie ramifiée de l’EC et de la migration directionnelle. L’imagerie en accéléré de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine vivantes (HUVEC) a été réalisée après la transfection avec la protéine de liaison de l’extrémité MT 3 (EB3) et les constructions d’ADNc spécifiques de la kinésine associée au centromère mitotique (MCAK) afin d’évaluer les effets sur la dynamique de la MT. Le logiciel PlusTipTracker a été utilisé pour suivre les extrémités plus MT étiquetées EB3 afin de mesurer les vitesses de croissance MT et les durées de vie de croissance MT dans des images en accéléré. Cette méthodologie permet d’étudier la dynamique des MT et d’identifier comment la régulation localisée de la dynamique des MT dans les régions subcellulaires contribue aux processus angiogéniques de ramification et de migration des EC.

Les protocoles pour la culture de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), la transfection transitoire de marqueurs de croissance des microtubules marqués par fluorescence, l’imagerie de cellules vivantes et l’analyse automatisée de la dynamique de croissance des microtubules interphase sont détaillés.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine et d'analyser la dynamique du cytosquelette et la migration cellulaire à l'aide d'images en microscopie temporelle sur cellules vivantes. Les méthodes décrites dans cette vidéo peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, moléculaire et mécanobiologie. Par exemple, ce protocole peut être utilisé pour identifier la manière dont la forme cellulaire et la motilité sont modulées par l'interaction avec différentes matrices extracellulaires (ECM).La démonstration visuelle est essentielle car les étapes de préparation de l'échantillon sont difficiles à réaliser. Elles exigent une manipulation précise des cellules dans des délais appropriés tout au long du processus. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la motilité des cellules endothéliales durant l'angiogenèse, elle peut également être appliquée à l'étude microscopique de pratiquement tout modèle de système cellulaire adhérent.À l’aide de pinces, prendre une lame couvre-objet provenant d’un bocal de stockage contenant de l’éthanol à 100 % et la passer dans la flamme d’un bec Bunsen afin de la stériliser. Ensuite, la placer dans une boîte de Petri de 35 millimètres. Préparer une lame couvre-objet pour chaque échantillon.Dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, ajouter 10 microlitres de solution mère de fibronectine à 1 milligramme par millilitre et 990 microlitres de PBS. Ensuite, pipeter 250 microlitres de la solution sur chaque lame. Étaler la solution uniformément pour recouvrir toute la surface.Incuber les lamelles pendant au moins trois heures à 37 degrés Celsius. Avant utilisation, rincer chaque lamelle trois fois avec deux millilitres de PBS. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminer le nombre de cellules HUVEC cultivées et transférer un volume contenant 100 000 cellules par lamelle pour les expériences sans migration, ou 500 000 cellules par lamelle pour les expériences de migration, dans un tube de microcentrifugation.Faire centrifuger les cellules à 1 400 × g pendant quatre minutes afin de former un culot. Après la centrifugation, pour chaque condition à tester, resuspendre jusqu'à un million de cellules dans 100 microlitres de tampon d'électroporation et les mélanger avec un microgramme de cDNA. Transférer les cellules dans une cuvette d'électroporation.Transfectez les cellules et le mélange d'ADN en utilisant le programme désigné pour l'électroporation des HUVEC. Ensuite, récupérez les cellules transfectées en ajoutant 500 microlitres de milieu basique endothélial complet. Puis, ensemencez le volume cellulaire approprié sur des lamelles revêtues de fibronectine.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures afin de permettre l'expression des constructions d'ADNc. En prévision de l'observation microscopique, prendre deux bandes de ruban adhésif double face de 2,5 centimètres sur 0,65 centimètre et les fixer horizontalement le long des bords supérieur et inférieur d'une lame en verre propre. Remarquer qu'il est important de laisser un petit espace entre le ruban adhésif et le bord de la lame pour assurer l'étanchéité de la chambre.Placer le coverslip côté cellules vers le bas de sorte que les deux bords du coverslip reposent sur le ruban. Utiliser une pince pour appuyer doucement et fixer le coverslip. À l’aide d’une micropipette, ajouter 40 microlitres de milieu d’imagerie entre le coverslip et la lame.Veillez à ce que l'espace entre la lame et la lamelle soit entièrement rempli de milieu d'observation. Absorbez tout excès de milieu avec un papier essuie-tout si nécessaire. Scellez tous les bords de la lame avec du VALAP chaud.Vérifiez les fuites en appuyant doucement sur le coverslip en verre. Placez le coverslip monté et scellé sur la platine d'un microscope préalablement chauffée à 37 degrés Celsius. À l'aide d'un microscope confocal à disque tournant, acquérez des séquences d'images en lapse de temps, des images de la protéine fluorescente bleue et des images DIC.Analyser la dynamique des microtubules et la co-localisation comme décrit dans le document accompagnant. Pour réaliser un test de migration cellulaire, après l'étape d'électroporation, récupérer les cellules transfectées en ajoutant 80 microlitres de milieu basal endothélial complet. Ensuite, prélever l'échantillon entier de 80 microlitres à l'aide d'une pipette et le déposer en une seule goutte au centre d'un coverslip séché recouvert de fibronectine.Ne pas étaler la goutte. Le séchage de la lame couvre-objet est nécessaire pour empêcher la goutte de 80 microlitres de se séparer au contact de la lame. Cette approche permet de concentrer les cellules HUVEC dans une petite zone de la lame couvre-objet et favorise ainsi la formation rapide d'une monocouche confluente de cellules.Incuber la lame à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures pour permettre aux cellules de s'adhérer et de former une monocouche confluente. Rincer ensuite les lames deux fois dans un milieu basal endothélial complet afin d'éliminer les cellules non attachées. Pour créer un bord de blessure sur la monocouche de cellules HUVEC, utiliser une pince pour maintenir délicatement la lame en place et tirer fermement une lame de rasoir au centre de la monocouche cellulaire.Laisser les cellules se rétablir dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, assembler et monter les lamelles pour l'acquisition d'images comme précédemment. Acquérir des images en contraste de phase toutes les 10 minutes pendant 12 heures à l'aide d'un objectif de phase de 10X à ouverture numérique de 0,45 et d'un condenseur à distance de travail longue de 0,52 d'ouverture numérique.Utilisez le panneau d'acquisition ND du logiciel d'acquisition d'images. Enfin, quantifiez la ramification et la migration des HUVECs comme décrit dans le document accompagnant. Les HUVECs ont été transfectées pour exprimer la protéine mApple-étiquetée EB3, une protéine de liaison aux extrémités des microtubules, et des images en prise de vue instantanée ont été capturées.Les images brutes d'EB3 sont affichées à gauche. Les comètes bleues d'EB3 repérées par le logiciel plusTipTracker sont affichées à droite. Les comètes détectées dans chaque image ont été associées en fonction de leur déplacement d'une image à l'autre afin de générer des trajectoires d'EB3 et une superposition visuelle des trajectoires d'EB3, comme illustré ici.La croissance lente et de courte durée des microtubules est indiquée en rouge, la croissance lente et de longue durée des microtubules en vert, la croissance rapide et de courte durée des microtubules en jaune, et la croissance rapide et de longue durée des microtubules en bleu. Pour analyser la ramification des cellules endothéliales, une image CIDI et une image fluorescente d'un HUVEC individuel ont été capturées à un grossissement de 60 fois. Une limite a été dessinée manuellement autour du contour cellulaire sur l'image fluorescente.Les origines des branches ont ensuite été définies en traçant une ligne droite traversant la branche et passant par l'angle de courbure maximal de chaque côté de la branche. Les branches dont la longueur était supérieure à la largeur et mesurant au minimum 10 micromètres de longueur ont été comptabilisées, et la longueur a été mesurée depuis l'origine de la branche jusqu'à l'extrémité distale de celle-ci. Pour évaluer la migration des cellules endothéliales au niveau du bord de la plaie, les HUVECs ont été cultivées à haute densité et une imagerie en temps réel de cellules vivantes a été réalisée après la création de la plaie, comme décrit dans cette vidéo.Comme illustré ici, les cellules endothéliales situées au bord de la plaie ont migré de manière directionnelle vers la zone lésée. Ce mouvement a été analysé en utilisant le nucléole comme marqueur de repère pour suivre la vitesse, la persistance et la distance de migration. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des méthodes de culture, de transfection et de préparation des cellules HUVEC, que ce soit pour des expériences d'imagerie de la forme cellulaire et de la dynamique du cytosquelette ou pour des études sur la migration des cellules au bord de la plaie.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la polyacrylamide ou la conjugaison de collagène peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à l'interaction cellulaire avec des MEC modifiées. Merci d'avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.

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Biologie

Ce protocole vidéo illustre l'isolement et la culture de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) de cordon ombilical humain. Une fois isolé ces cellules peuvent être utilisées pour des dosages angiogenèse in vitro comme le dosage optimisé fibrine billes de gel a également démontré par le laboratoire de M. Hughes.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été cultivées jusqu’à la confluence au sein d’un dispositif de réseau microfluidique. La jonction cellulaire endothéliale et les distributions de l’actine F ont été illustrées et les changements dans la concentration intracellulaire de calcium et la production d’oxyde nitrique en réponse à l’adénosine triphosphate (ATP) ont été quantifiés en temps réel au niveau cellulaire individuel.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Pour quantifier le flux microvasculaire des séquences d'images capillaires à grande vitesse, nous avons développé le logiciel STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Sur l'ensemble du champ d'images et au fil du temps, STAFF évalue les vitesses de débit et génère une séquence de cartes spatiales codées en couleur pour la visualisation et la sortie tabulaire pour les analyses quantitatives.

Analyse temporelle spatiale du flux en champ dans la microvasculature

Ce protocole décrit les procédures chirurgicales et techniques qui permettent l’imagerie en temps réel in vivo par fluorescence multiphotonique du cerveau des rongeurs pendant les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.

Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

Ce protocole est dédié à la visualisation des microtubules par transfection de la protéine EB3 afin d’étudier leurs propriétés dynamiques en culture cellulaire primaire. Le protocole a été mis en œuvre sur des fibroblastes cutanés primaires humains obtenus chez des patients atteints de la maladie de Huntington.

Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine

La présente étude décrit un protocole permettant de surveiller les changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) au cours d’une infection virale à l’aide d’un système d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA).

Surveillance des changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine lors d’une infection virale à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance

Découvrez l'imagerie en time-lapse haute résolution pour analyser la dynamique des microtubules dans les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine. Cette méthode permet d'étudier la motilité cellulaire et le comportement du cytosquelette en temps réel.

Haute résolution Time-lapse dimagerie et danalyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine (Vidéo) | JoVE Journal

Haute résolution Time-lapse d'imagerie et d'analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

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