Haute résolution Time-lapse d'imagerie et d'analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine et d'analyser la dynamique du cytosquelette et la migration cellulaire à l'aide d'images en microscopie temporelle sur cellules vivantes. Les méthodes décrites dans cette vidéo peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, moléculaire et mécanobiologie. Par exemple, ce protocole peut être utilisé pour identifier la manière dont la forme cellulaire et la motilité sont modulées par l'interaction avec différentes matrices extracellulaires (ECM).

La démonstration visuelle est essentielle car les étapes de préparation de l'échantillon sont difficiles à réaliser. Elles exigent une manipulation précise des cellules dans des délais appropriés tout au long du processus. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la motilité des cellules endothéliales durant l'angiogenèse, elle peut également être appliquée à l'étude microscopique de pratiquement tout modèle de système cellulaire adhérent.

À l’aide de pinces, prendre une lame couvre-objet provenant d’un bocal de stockage contenant de l’éthanol à 100 % et la passer dans la flamme d’un bec Bunsen afin de la stériliser. Ensuite, la placer dans une boîte de Petri de 35 millimètres. Préparer une lame couvre-objet pour chaque échantillon.

Dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, ajouter 10 microlitres de solution mère de fibronectine à 1 milligramme par millilitre et 990 microlitres de PBS. Ensuite, pipeter 250 microlitres de la solution sur chaque lame. Étaler la solution uniformément pour recouvrir toute la surface.

Incuber les lamelles pendant au moins trois heures à 37 degrés Celsius. Avant utilisation, rincer chaque lamelle trois fois avec deux millilitres de PBS. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminer le nombre de cellules HUVEC cultivées et transférer un volume contenant 100 000 cellules par lamelle pour les expériences sans migration, ou 500 000 cellules par lamelle pour les expériences de migration, dans un tube de microcentrifugation.

Faire centrifuger les cellules à 1 400 × g pendant quatre minutes afin de former un culot. Après la centrifugation, pour chaque condition à tester, resuspendre jusqu'à un million de cellules dans 100 microlitres de tampon d'électroporation et les mélanger avec un microgramme de cDNA. Transférer les cellules dans une cuvette d'électroporation.

Transfectez les cellules et le mélange d'ADN en utilisant le programme désigné pour l'électroporation des HUVEC. Ensuite, récupérez les cellules transfectées en ajoutant 500 microlitres de milieu basique endothélial complet. Puis, ensemencez le volume cellulaire approprié sur des lamelles revêtues de fibronectine.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures afin de permettre l'expression des constructions d'ADNc. En prévision de l'observation microscopique, prendre deux bandes de ruban adhésif double face de 2,5 centimètres sur 0,65 centimètre et les fixer horizontalement le long des bords supérieur et inférieur d'une lame en verre propre. Remarquer qu'il est important de laisser un petit espace entre le ruban adhésif et le bord de la lame pour assurer l'étanchéité de la chambre.

Placer le coverslip côté cellules vers le bas de sorte que les deux bords du coverslip reposent sur le ruban. Utiliser une pince pour appuyer doucement et fixer le coverslip. À l’aide d’une micropipette, ajouter 40 microlitres de milieu d’imagerie entre le coverslip et la lame.

Veillez à ce que l'espace entre la lame et la lamelle soit entièrement rempli de milieu d'observation. Absorbez tout excès de milieu avec un papier essuie-tout si nécessaire. Scellez tous les bords de la lame avec du VALAP chaud.

Vérifiez les fuites en appuyant doucement sur le coverslip en verre. Placez le coverslip monté et scellé sur la platine d'un microscope préalablement chauffée à 37 degrés Celsius. À l'aide d'un microscope confocal à disque tournant, acquérez des séquences d'images en lapse de temps, des images de la protéine fluorescente bleue et des images DIC.

Analyser la dynamique des microtubules et la co-localisation comme décrit dans le document accompagnant. Pour réaliser un test de migration cellulaire, après l'étape d'électroporation, récupérer les cellules transfectées en ajoutant 80 microlitres de milieu basal endothélial complet. Ensuite, prélever l'échantillon entier de 80 microlitres à l'aide d'une pipette et le déposer en une seule goutte au centre d'un coverslip séché recouvert de fibronectine.

Ne pas étaler la goutte. Le séchage de la lame couvre-objet est nécessaire pour empêcher la goutte de 80 microlitres de se séparer au contact de la lame. Cette approche permet de concentrer les cellules HUVEC dans une petite zone de la lame couvre-objet et favorise ainsi la formation rapide d'une monocouche confluente de cellules.

Incuber la lame à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures pour permettre aux cellules de s'adhérer et de former une monocouche confluente. Rincer ensuite les lames deux fois dans un milieu basal endothélial complet afin d'éliminer les cellules non attachées. Pour créer un bord de blessure sur la monocouche de cellules HUVEC, utiliser une pince pour maintenir délicatement la lame en place et tirer fermement une lame de rasoir au centre de la monocouche cellulaire.

Laisser les cellules se rétablir dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, assembler et monter les lamelles pour l'acquisition d'images comme précédemment. Acquérir des images en contraste de phase toutes les 10 minutes pendant 12 heures à l'aide d'un objectif de phase de 10X à ouverture numérique de 0,45 et d'un condenseur à distance de travail longue de 0,52 d'ouverture numérique.

Utilisez le panneau d'acquisition ND du logiciel d'acquisition d'images. Enfin, quantifiez la ramification et la migration des HUVECs comme décrit dans le document accompagnant. Les HUVECs ont été transfectées pour exprimer la protéine mApple-étiquetée EB3, une protéine de liaison aux extrémités des microtubules, et des images en prise de vue instantanée ont été capturées.

Les images brutes d'EB3 sont affichées à gauche. Les comètes bleues d'EB3 repérées par le logiciel plusTipTracker sont affichées à droite. Les comètes détectées dans chaque image ont été associées en fonction de leur déplacement d'une image à l'autre afin de générer des trajectoires d'EB3 et une superposition visuelle des trajectoires d'EB3, comme illustré ici.

La croissance lente et de courte durée des microtubules est indiquée en rouge, la croissance lente et de longue durée des microtubules en vert, la croissance rapide et de courte durée des microtubules en jaune, et la croissance rapide et de longue durée des microtubules en bleu. Pour analyser la ramification des cellules endothéliales, une image CIDI et une image fluorescente d'un HUVEC individuel ont été capturées à un grossissement de 60 fois. Une limite a été dessinée manuellement autour du contour cellulaire sur l'image fluorescente.

Les origines des branches ont ensuite été définies en traçant une ligne droite traversant la branche et passant par l'angle de courbure maximal de chaque côté de la branche. Les branches dont la longueur était supérieure à la largeur et mesurant au minimum 10 micromètres de longueur ont été comptabilisées, et la longueur a été mesurée depuis l'origine de la branche jusqu'à l'extrémité distale de celle-ci. Pour évaluer la migration des cellules endothéliales au niveau du bord de la plaie, les HUVECs ont été cultivées à haute densité et une imagerie en temps réel de cellules vivantes a été réalisée après la création de la plaie, comme décrit dans cette vidéo.

Comme illustré ici, les cellules endothéliales situées au bord de la plaie ont migré de manière directionnelle vers la zone lésée. Ce mouvement a été analysé en utilisant le nucléole comme marqueur de repère pour suivre la vitesse, la persistance et la distance de migration. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des méthodes de culture, de transfection et de préparation des cellules HUVEC, que ce soit pour des expériences d'imagerie de la forme cellulaire et de la dynamique du cytosquelette ou pour des études sur la migration des cellules au bord de la plaie.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la polyacrylamide ou la conjugaison de collagène peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à l'interaction cellulaire avec des MEC modifiées. Merci d'avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.