Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

L’objectif global de cette procédure est de caractériser les cellules C1498 murines et la leucémie aiguë qu’elles induisent après injection intraveineuse chez la souris. Le principal avantage de cette procédure est que la leucémie myélomonoïde murine induite après une injection de cellules C1498 présente de nombreuses caractéristiques de la maladie humaine. Ce modèle animal peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hématologie, telles que : quels sont les mécanismes qui conduisent au développement de la leucémie et à l’immunodéficience.

L’implication de ce modèle animal s’étend au traitement de la leucémie car il facilite l’essai de nouveaux agents de chimiothérapie et immunothéreptiques. Commencez par transférer une souris femelle congénique C57 black 6 âgée de cinq à six semaines dans une hotte stérile à flux laminaire. Ensuite, placez l’animal dans une contention.

Ensuite, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 29 avec 100 microlitres de cellules. Saisissez la queue de l’extrémité distale et désinfectez la peau de la queue avec une gaze imbibée à 70 % d’éthanol. Procédez à l’injection lente une fois 10 fois à la sixième cellule dans une veine latérale de la queue.

Lorsque toutes les cellules ont été distribuées, retirez l’aiguille et appliquez une légère pression à la vue de l’injection avec de la gaze stérile. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage avec une surveillance attentive pendant les prochaines semaines. 17 à 19 jours plus tard, insérez un tube capillaire dans le canthus médial de l’œil de l’animal leucémique anesthésié.

100 à 200 microlitres de sang seront prélevés du sinus orial dans le tube capillaire. Retirez le tube et contrôlez le saignement en appliquant doucement une éponge de gaze stérile sur l’œil. Ensuite, transférez le sang dans un tube EDTA et stockez le tube sur de la glace jusqu’à l’isolement de la cellule mononucléaire.

Pour isoler le sang, les cellules mononucléées ajoutent d’abord du PBS complété par un EDTA millimolaire jusqu’à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30 pour superposer soigneusement 500 microlitres de solution de séparation sous le sang, en prenant soin de ne pas mélanger les couches.

Séparez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette pour transférer la couche de cellule mononucléée blanche opaque dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ensuite, lavez les cellules immunitaires dans un millilitre de PBS. Centrifugez-les et remettez la pastille en suspension dans 600 microlitres de tampon FACS pour la coloration et l’analyse par cytométrie en flux.

Pour isoler la moelle osseuse, placez la souris sur son dos sur une planche en plastique et fixez les membres de l’animal. Désinfectez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, coupez chaque jambe en haut du fémur au-dessus de l’articulation et tirez doucement sur les tibias pour les déconnecter des fémurs.

Utilisez des pinces et des ciseaux pour retirer la peau et les muscles des os, puis transférez les os dans une boîte de Pétri sur de la glace. Utilisez des ciseaux pour enlever les extrémités. Ensuite, insérez une aiguille de calibre 26 attachée à une seringue de 10 millilitres contenant cinq millilitres de PBS froid à l’extrémité d’un os à la fois et rincez les moelles osseuses dans le plat.

Passez la suspension cellulaire à travers la pointe de l’aiguille plusieurs fois pour perturber les cellules de la moelle osseuse. Ensuite, filtrez les cellules à travers un nouveau filtre de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres pour obtenir une suspension à cellule unique. Centrifugez les cellules et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon de lyse.

Remplissez immédiatement le tube avec jusqu’à 50 millilitres de PBS froid et centrifugez les cellules. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la boulette de moelle osseuse à une fois 10 à six cellules par millilitre dans un tampon FACS froid. Pour préparer d’abord les cellules de la moelle osseuse à la coloration, placez les lames dans des chambres jetables avec des cartes de filtre pré-attachées et placez les chambres dans une cytocentrifugeuse.

Ajoutez 100 microlitres de tampon FACS dans chaque chambre de carte filtrante et centrifugez brièvement les lames. À la fin de la rotation, ajoutez 100 microlitres de cellules dans chaque chambre et centrifugez les cellules. Ensuite, retirez soigneusement les lames des chambres pour les faire sécher à l’air.

Pour colorer les cellules de la moelle osseuse, plongez les lames dans un bocal de coplin contenant la solution de May-Grunwald pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les lames dans un bocal de solution tampon avec un pH de 6,8 pendant une minute. Ensuite, transférez les lames dans la solution Giemsa R pendant 10 minutes.

Suivi d’un lavage de 10 secondes avec de l’eau au pH neutre. Après le lavage, laissez les lames sécher à l’air libre et appliquez une goutte de support de montage sur chaque échantillon. Ensuite, placez un bord d’un verre de protection sur la lame et abaissez soigneusement le verre de couverture sur les cellules en appuyant doucement pour éliminer les bulles d’air.

Par rapport aux animaux témoins, les animaux injectés de cellules C1498 présentent une infiltration massive de cellules C1498 dans leur moelle osseuse, comme l’observe l’apparence explosive des cellules. Les cellules C1498 infiltrant la moelle osseuse présentent des phénotypes monocytaires et granulocytaires indiquant respectivement des cellules monoblastiques et myéloblastiques, caractéristiques de la leucémie myélomonocytaire aiguë. L’analyse par cytométrie en flux des fréquences des cellules mononucléées dans les échantillons de sang des souris injectées au C1498 indique qu’environ un quart de l’ensemble de la population de globules blancs est composé de cellules leucémiques.

Les fréquences des lymphocytes T et B sont similaires entre les animaux témoins et les animaux injectés de C1498. Les fréquences monocytaires, cependant, sont observées à des niveaux plus élevés chez les souris injectées de C1498, une caractéristique de la leucémie myélomonocytaire aiguë. Lors de la réalisation des procédures de cytochimie et de May-Grunwald Giemsa, il est important de ne pas oublier de maintenir les valeurs de pH, les températures et les temps d’incubation appropriés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de caractériser la leucémie myélomonoïde aiguë. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’hématologie pour explorer la nature de la leucémie aiguë spontanée et induite dans d’autres modèles animaux.