Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

L'objectif général de cette procédure est de caractériser les cellules murines C1498 et la leucémie aiguë qu'elles induisent après injection intraveineuse chez la souris. Le principal avantage de cette procédure réside dans le fait que la leucémie myélomonocytaire murine induite après injection de cellules C1498 présente de nombreuses caractéristiques de la maladie humaine. Ce modèle animal peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématologie, telles que les mécanismes menant au développement de la leucémie et à l'immunodéficience.

L'implication de ce modèle animal s'étend au traitement de la leucémie, car il facilite l'évaluation de nouveaux agents chimiothérapeutiques et immunothérapeutiques. Commencez par transférer une souris femelle congénique C57 black 6 âgée de cinq à six semaines dans une hotte à flux laminaire stérile. Ensuite, placez l'animal dans un dispositif de contention.

Ensuite, charger une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 29 avec 100 microlitres de cellules. Saisir la queue à l'extrémité distale et désinfecter la peau de la queue avec une compresse imbibée d'éthanol à 70 %. Procéder ensuite à l'injection lente de un fois 10 puissance six cellules dans une veine latérale de la queue.

Lorsque toutes les cellules ont été administrées, retirez l'aiguille et appliquez une pression douce au site d'injection à l'aide d'une compresse stérile. Ensuite, remettez l'animal dans sa cage et surveillez-le attentivement pendant les semaines suivantes. 17 à 19 jours plus tard, insérez un tube capillaire dans le canthus médial de l'œil de l'animal leucémique anesthésié.

De 100 à 200 microlitres de sang seront prélevés du sinus orbital dans le tube capillaire. Retirez le tube et contrôlez l'hémorragie en appliquant doucement une compresse stérile sur l'œil. Ensuite, transférez le sang dans un tube contenant de l'EDTA et conservez le tube sur de la glace jusqu'à l'isolement des cellules mononucléées.

Pour isoler les cellules mononucléées du sang, ajoutez d'abord du PBS enrichi avec un millimolaire de EDTA jusqu'à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, transférez l'échantillon dans un tube de microcentrifugation. Puis, utilisez une seringue de un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 30 pour déposer soigneusement 500 microlitres de solution de séparation sous le sang, en prenant soin de ne pas mélanger les couches.

Séparez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette pour transférer la couche blanche opaque de cellules mononucléées dans un nouveau tube microcentrifuge. Ensuite, lavez les cellules immunitaires dans un millilitre de PBS. Centrifugez-les puis resuspendez le culot dans 600 microlitres de tampon FACS pour la coloration et l'analyse par cytométrie en flux.

Pour isoler la moelle osseuse, placez la souris sur le dos sur une planche en plastique et fixez les membres de l'animal. Désinfectez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, coupez chaque jambe au niveau supérieur du fémur, au-dessus de l'articulation, puis tirez doucement sur les tibias pour les détacher des fémurs.

Utilisez une pince et des ciseaux pour retirer la peau et les muscles des os, puis transférez les os dans une boîte de Pétri placée sur de la glace. Utilisez les ciseaux pour retirer les extrémités. Ensuite, insérez un aiguille de calibre 26 fixée à une seringue de 10 millilitres contenant cinq millilitres de PBS froid dans l'extrémité d'un os à la fois et éjectez les moelles osseuses dans la boîte.

Faites passer la suspension cellulaire plusieurs fois à travers l'extrémité de l'aiguille afin de rompre les cellules de la moelle osseuse. Ensuite, filtrez les cellules à travers un nouveau filtre de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres pour obtenir une suspension monocellulaire. Centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot dans deux millilitres de tampon de lyse.

Remplir immédiatement le tube avec jusqu'à 50 millilitres de PBS froid et centrifuger les cellules. Ensuite, reprendre le culot de moelle osseuse à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre dans du tampon FACS froid. Pour préparer les cellules de moelle osseuse au marquage, placer d'abord des lames dans des chambres jetables munies de cartouches filtrantes, puis insérer les chambres dans un cytocentrifugeur.

Ajouter 100 microlitres de tampon FACS dans chaque chambre de la carte filtrante et centrifuger brièvement les lames. À la fin de la centrifugation, ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque chambre et centrifuger les cellules. Ensuite, retirer soigneusement les lames des chambres pour les faire sécher à l'air.

Pour colorer les cellules de la moelle osseuse, plongez les lames dans un bocal Coplin contenant la solution de May-Grünwald pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les lames dans un bocal contenant une solution tampon de pH 6,8 pendant une minute. Puis, transférez les lames dans la solution de Giemsa R pendant 10 minutes.

Procéder à un rinçage de 10 secondes avec de l'eau neutre de pH. Après le rinçage, laisser sécher les lames à l'air libre et appliquer une goutte de milieu de montage sur chaque échantillon. Ensuite, poser un bord d'une lame à couvrir sur la lame porteuse, puis abaisser délicatement la lame à couvrir sur les cellules en appuyant légèrement pour éliminer les bulles d'air.

Contrairement aux animaux témoins, les animaux injectés avec les cellules C1498 présentent une infiltration massive de cellules C1498 dans leur moelle osseuse, comme observé par l'aspect de type blastique des cellules. Les cellules C1498 infiltrant la moelle osseuse présentent des phénotypes monocytaires et granulocytaires, indicatifs respectivement de cellules monoblastiques et myéloblastiques, caractéristiques de la leucémie aiguë myélo-monocytaire. L'analyse cytométrique en flux des fréquences des cellules mononucléées dans les échantillons sanguins des souris injectées avec les cellules C1498 indique qu'environ un quart de l'ensemble de la population de globules blancs est constitué de cellules leucémiques.

Les fréquences des lymphocytes T et B sont similaires entre les animaux témoins et ceux injectés avec C1498. Les fréquences des monocytes, en revanche, sont observées à des niveaux plus élevés chez les souris injectées avec C1498, une caractéristique de la leucémie aiguë myélo-monocytaire. Lors de la réalisation des procédures de cytochimie et de May-Grünwald Giemsa, il est important de se rappeler de maintenir les valeurs de pH, les températures et les durées d'incubation appropriées.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de caractériser la leucémie aiguë myélo-monocytaire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hématologie pour explorer la nature des leucémies aiguës spontanées et induites dans d'autres modèles animaux.