Name: Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Découvrez la caractérisation de la lignée cellulaire C1498 et du modèle de leucémie aiguë myélomonocytaire chez la souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et la cytologie pour étudier les mécanismes de la leucémie.

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Les auteurs tiennent à remercier la Ligue Nationale contre le Cancer (Comité du Septentrion), le SIRIC ONCOLille (Bourse INCa-DGOS-INSERM 6041) et l’Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) pour leur soutien à ce travail. Ils tiennent à remercier Delphine Taillieu et le personnel de la animalerie pour l’hébergement des souris et le maintien de leur bien-être. Nous remercions également Raphaëlle Caillerez et Nathalie Jouy pour leur aide respective en microscopie et en cytométrie en flux.

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<li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans des études antérieures, la lignée cellulaire C1498 a été décrit comme un inducteur de myéloïde aiguë 5, myélomonocytaire 6 ou 7 NKT leucémie. Toutefois, les données démonstratifs dans la littérature étaient absents ou incomplets. Le protocole présenté ici utilise différentes techniques telles que la cytométrie en flux, l&#39;immunofluorescence, des dosages et MGG coloration cytochimique pour caractériser les cellules cultivées et C1498 pour déterminer la nature de la leucémie qui est induite chez la souris après leur injection. Lorsque nous phénotypé dans les cellules C1498 cultivées in vitro après immunocoloration et de cytométrie de flux analyses ont été effectuées, nous avons observé certaines limites parce que ces cellules expriment quelques marqueurs hématopoïétiques de la surface cellulaire qui ont été décrits dans la littérature 6,7. En accord avec nos résultats, Labelle et al. N&#39;a pas observé l&#39;expression de surface cellulaire mature TCR sur les cellules C1498 utilisant cytomet de fluxry coloration. Cependant, ils les considéraient comme une lignée de cellules NKT après avoir détecté CD3e et TCRVβ8.2 ARNm 7. Nous avons également observé l&#39;expression intracellulaire des chaînes TCRVβ et molécules CD3e dans la plupart des cellules (&gt; 70%), mais leurs lignées hématopoïétiques n&#39;a pu être déterminée, car il y avait aussi l&#39;expression intracellulaire concomitante de la molécule Mac-3. Myéloperoxydase, la coloration au MGG et des évaluations pour analyser les esterases fonctionnels à l&#39;aide cytochimie démontré que la lignée de cellules C1498 a une origine myéloïde et se composait de monoblastes et les myéloblastes. Ces résultats sont concordants avec le pourcentage de Mac-3 + cellules qui ont été obtenues dans l&#39; analyse de cytométrie en flux de la coloration. Bien que non quantitative, ces étapes représentent des expériences clés à effectuer. En effet, ils restent, jusqu&#39;à présent, les meilleures méthodes actuelles de caractérisation de la phase de cellules hématopoïétiques qui expriment ou non f lignée et la différenciationmarqueurs phénotypiques spécifiques Ew. Cytométrie de flux coloration a été utile pour démontrer le développement de la leucémie aiguë chez la souris congéniques après C1498 cellules ont été injectées par voie intraveineuse. Les CD45.2 + C1498 cellules qui se sont infiltrés dans le sang périphérique et divers organes ont été isolés, et leurs fréquences ont été déterminées. Quantification a également été réalisée pour analyser médullaires inhérente et les cellules spléniques après immunophénotypage. Limitations ont été rencontrées lorsque le phénotype de cellules C1498 a été examiné dans les organes comme ils ont exprimé quelques marqueurs hématopoïétiques (seulement quelques - uns d&#39;entre eux étaient B220 +). Pour définir la nature de la leucémie aiguë observée, May-Grünwald Giemsa et une analyse des activités des monocytes et estérases granulocytes ont été effectuées en utilisant la moelle osseuse. Les résultats ont montré que les cellules C1498 ont conservé leur morphologie et la fonction myéloblastique et monoblastiques, révélant l&#39;apparition de la leucémie myélomonocytaire. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En contrepartie des étapes critiques décrites dans ce protocole, une attention particulière devrait être accordée à pH lors de l&#39;exécution des réactions cytochimiques et MGG coloration car les erreurs de pH peuvent conduire à des interprétations erronées des résultats. Par exemple, une activité esterase butyrate α-naphtyl est spécifique à des cellules monocytaires seulement à un pH de 6,0, car les granulocytes et les lymphocytes peuvent également colorées positivement pour ce test à des valeurs de pH plus élevées. Fixateur les cellules ne sont pas recommandé avant d&#39;effectuer MGG coloration, et nous a montré que seulement la fixation CAF a fourni des résultats satisfaisants lors de l&#39;exécution des estérases réactions cytochimiques utilisant C1498 cellules. Afin de préserver l&#39;expression de la molécule CD115 et sa détection par cytométrie en flux, tous les échantillons (cellules par exemple, le sang, la moelle osseuse et la rate) devrait être maintenu sur la glace au cours de la procédure. Si aucune coloration est observée dans la cytométrie de flux et / ou des expériences d&#39;immunofluorescence, la référence des anticorps, leur re de stockagefélicitations et leurs dilutions doivent être vérifiées. Les références indiquées dans le tableau des matériaux / équipements ont été sélectionnés pour des applications de cytométrie de flux ou d&#39;immunofluorescence. Les principaux anticorps / secondaires ou leurs fluorophores conjugués pourraient avoir perdu leur activité due au stockage inapproprié (par exemple, l&#39; exposition à la lumière ou à la chaleur), la dilution inappropriée, vaste congélation / décongélation ou l&#39;utilisation de tampons contaminés. Exécuter des contrôles positifs pour veiller à ce qu&#39;ils fonctionnent correctement. Utiliser osseuse de souris des cellules de rate dérivées qui sont connues pour exprimer les protéines d&#39;intérêt ou de la moelle. Pour éviter un bruit de fond et la coloration non spécifique, assurez-vous que les cellules sont lavées correctement et maintenus à une humidité élevée (pour immunofluorescence) et que les anticorps sont dilués selon les instructions. En utilisant la même concentration et la dilution de l&#39;anticorps témoin isotypique et l&#39;anticorps primaire afin de déterminer avec précision le niveau d&#39;arrière-plan dans l&#39;échantillon. Pour les expériences estérase de cytochimie, lales réactifs peuvent être testés à l&#39;aide de lames de contrôle positif et négatif contenant des granulocytes de souris purifié splénique (Ly6G +) et les cellules monocytaires (CD115 +). La procédure décrite dans cette étude a montré que bon nombre des caractéristiques leucémiques observés chez les souris après l&#39;injection de cellules C1498 partagé caractéristiques communes avec la leucémie myélomonocytaire aiguë humaine 11,12. Les cellules leucémiques envahies ont donné lieu à une réduction des matures et immatures (précurseurs) et les progéniteurs des cellules hématopoïétiques médullaires. les cellules C1498 sont présents à haute fréquence (&gt; 20%) dans le sang périphérique, comme les cellules monocytes. Hépatomégalie et une splénomégalie ont été observées suite à l&#39;infiltration de cellules leucémiques et des augmentations significatives dans les lymphocytes B et les cellules myéloïdes ont également été observées pour accompagner splénomégalie. Thrombopénie a également été observée lorsque le nombre de plaquettes de sang ont été estimées en utilisant un analyseur d&#39;hématologie. Il était shown, à l&#39; aide des expériences in vitro, les cellules C1498 qui inhibent l&#39; hématopoïèse normale de souris en sécrétant des facteurs solubles 13. Dans plusieurs modèles de souris de tumeurs, les cellules myéloïdes immatures (y compris les cellules monocytaires et granulocytaires) ont également montré que la migration de la moelle osseuse vers la rate où ils inhibent l&#39; activation des cellules T spécifiques anti-tumorale et la prolifération 14. Ainsi, la réduction dans les cellules hématopoïétiques qui a été observée dans la moelle osseuse peut être due à une carence soit dans l&#39;hématopoïèse et / ou de leur migration. Ce dernier mécanisme peut expliquer la présence d&#39;une monocytose dans le sang périphérique ou l&#39;observation des fractions myéloïdes agrandies dans la rate. Il est également envisageable que ces cellules pouvaient être dérivées d&#39;une amélioration de l&#39;hématopoïèse splénique. En effet, dans des conditions de régime permanent, certains sous - ensembles de cellules spléniques B ont été identifiés comme des précurseurs de maturité des lymphocytes B 15. En outre, dans des conditions inflammatoires, medcellules souches et progéniteurs ullary ont été montrés à déménager dans la rate pour induire la production de monocytes matures 16. Ce protocole ne nous permet pas de tirer des conclusions concernant les mécanismes qui sont impliqués dans le développement de la leucémie, et des tests fonctionnels ainsi que moléculaires supplémentaires devraient être employées pour le faire. Cependant, ces données comprennent des informations détaillées sur les caractéristiques cliniques de la leucémie myélomonocytaire aiguë et aideront les chercheurs à évaluer et à comprendre les effets de nouveaux agents thérapeutiques.

la leucémie myéloïde aiguë (LMA) est caractérisée par la prolifération incontrôlée des cellules myéloïdes hématopoïétiques qui sont bloqués à différents stades de maturation. Cette dysrégulation peut affecter le granulocytaire, monocytaire, érythrocytaire ou voies de différenciation megaryocytic 1. les cellules AML accumulent dans la moelle osseuse, ce qui conduit à une altération de l&#39;hématopoïèse, ce qui se traduit par une thrombopénie, une lymphopénie et une anémie. Les cellules leucémiques envahissent également le sang et les organes non lymphoïdes. Le modèle C1498 de la souris a été utilisé pendant des décennies comme un modèle pour la leucémie aiguë puisque les cellules cancéreuses ont été isolées à partir d&#39; un 10-month-old souris femelle leucémique C57BL / 6 (H-2 b) en 1941. La littérature décrit l&#39;invasion dans le sang , les organes hématopoïétiques (par exemple, les ganglions lymphatiques et la rate) et des organes non-hématopoïétiques (par exemple, le foie, les poumons, les ovaires et les reins) par les cellules C1498 hautement prolifératives après qu&#39;ils ont été injectés via un dansintraveineux, sous - cutanée ou par voie intra-péritonéale à des souris sensibles 2-4. Toutefois, ce modèle de souris a été signalé pour induire soit granulocytaire 2,5 ou myélomonocytaire 6 leucémie. Plus récemment, une étude publiée en 2002 décrit ce type de cancer que NKT murine leucémie 7. Ainsi, la littérature est différente en ce qui concerne la nature de cette lignée de cellules C1498 et la leucémie associée qu&#39;il induit chez la souris. Ces écarts sont principalement dus à un manque d&#39;informations détaillées et publiées à jour sur les cellules et la maladie leucémique en général, parce que de nombreuses études ont été réalisées dans les années 1950 - 70. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour décrire la façon de caractériser les cellules C1498 et analyser la nature de la maladie leucémique qui est induite par l&#39;injection intraveineuse à des souris. La première partie de ce protocole est consacrée à la description des cellules C1498 qui ont été cultivées in vitro. fluorescent anti-organismes dirigés contre la surface et des marqueurs hématopoïétiques intracellulaires ont été utilisés pour déterminer leur phénotype cytométrie en flux. La présence de la myéloperoxydase a été évalué en utilisant la microscopie à immunofluorescence, leur lignée et la différenciation hématopoïétique étape a été évaluée à l&#39;aide cytochimie pour évaluer l&#39;activité des estérases et May-Grunwald Giemsa a été réalisée. Les cellules C1498 ont ensuite été injectées dans des souris, et la maladie de la leucémie aiguë qui a été induit est décrit dans la seconde partie de ce manuscrit. Les mêmes techniques ont été utilisées pour déterminer les fréquences et les phénotypes des cellules leucémiques et inhérentes à la moelle osseuse, le sang périphérique, la rate et les organes non-hématopoïétiques (le foie et les poumons). Ce protocole est hautement reproductible, et les données présentées ici permettra aux chercheurs d&#39;évaluer les effets de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce modèle de la leucémie de la souris a déjà été utilisé pour tester l&#39;immunothérapie approche d&#39;unnd différents médicaments chimiothérapeutiques du cancer 8,9. Leur efficacité a été évaluée en déterminant l&#39;évolution de la charge tumorale et le taux de survie. Ce protocole peut être utilisé pour fournir des informations supplémentaires sur la distribution et de subsistance des populations de cellules hématopoïétiques leucémiques et d&#39;autres pendant le traitement.

<table><tbody><tr><td>C1498 lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs de culture de cellules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr> Solution <tr><td>d’acides aminés non essentiels, Gibco&nbsp ; &nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine, Gibco&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs de coloration par cytométrie en flux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-souris B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>clone RA3-6B2, dilution finale 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris B220 biotine (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>clone RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anti-souris CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>clone 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>clone GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-souris CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>clone GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris CD8 biotine (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-souris CD11a biotine</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>clone M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD11b PE&nbsp ;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>clone M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris CD16/32 biotine</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>clone 93, 1/400</td></tr><tr><td>purifié anti-souris CD16/32 (blocage FcR)&nbsp ;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>clone 2.4G2</td></tr><tr><td>anti-souris CD18 biotine (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>clone M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>clone M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>clone 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>clone 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>clone 390, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>clone RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anti-souris CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td>553134</td><td>clone IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris CD45.2 FITC&nbsp ;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>clone 104, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD49b/Pan NK PE&</td><td>nbsp ; BD biosciences</td><td>553858</td><td>clone DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris CD80 biotine</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>clone 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris CD86 biotine</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>clone GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>clone M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anti-souris CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>clone AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>clone 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>clone A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>clone 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anti-souris CD274 (-L1) biotine</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>clone MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>clone D7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-souris Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>clone HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anti-souris Ly-6G&nbsp ; (Gr-1) biotine (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>clone RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anti-souris Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>clone 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris CMH classe I (H-2Db) biotine</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>clone 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris CMH classe II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>clone M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anti-souris NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>clone PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-souris TCRVb FITC BD</td><td>biosciences</td><td>553170</td><td>clone H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>streptavidine PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp ; &nbsp ; 1/200</td></tr><tr>Réactifs <td></td><td></td><td></td><td>de coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-myéloperoxydase de souris (anticorps à chaîne lourde)&nbsp ;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 & micro ; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp ; IgG anti-chèvre (anticorps couplé Texas Red)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Solution Hoechst</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Milieu de montage 1 (Fluoromount)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td><Réactifs de coloration cytochimique à forte >Estérase</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naphtol AS-D Solution de chloroacétate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>(solution Fast Red Violet LB Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 concentré (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>Solution de nitrite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Solution de citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde, 37 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-solution de butyrate de naphtyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Nitrite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pararosaniline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>milieu de montage 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml ; réactifs de coloration nwald Giemsa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml ; nwald solution</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R solution&nbsp ;</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320310</td><td>&nbsp ; &nbsp ; 1/20</td></tr><tr><td>pH 6,8 solution tampon</td><td>RAL Diagnostics</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td>Autres matériaux, réactifs et équipements</fort></td>Kétamine 1000 (100 mg/ml)VIRBAC 3597132111010 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin albumine sérum en poudre (BSA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>Solution PBS (1x concentré)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Solution EDTA Ultra Pure 0,5 M, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Solution de séparation (souris Pancoll)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse (Tampon de lyse des globules rouges) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0,4 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>tube de 50 ml (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; m Crépine cellulaire (Falcon)&nbsp ;</td><td>Corning Sciences de la Vie</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Chambre & carte filtrante (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass, 24 x 24mm</td><td>Knittel</td><td>Glass VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Starfrost - bords rectifiés 90)</td><td>Knittel Glass</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette 150 mm (tube capillaire)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 26 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; seringue et aiguille à insuline 29 G</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>aiguille 30 G&nbsp ;</td><td>Becton et Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de cytométrie en flux (bleu)</td><td>Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>Stylo hydrofuge (Dakopen)</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux stériles tranchants&nbsp ;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>Pince stérile</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Thoma Chambre de comptage</td> cellulaire <td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (Fisherbrand Plastic)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A Tube de</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugation (1,5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de retenue cylindrique 15 - 30 g</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Cytocentrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Éponges de gaze stériles</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine c1498 et son modèle associé leucémie souris

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

L&#39;injection intraveineuse de cellules C1498 à des souris syngéniques ou congéniques a été réalisée depuis 1941. Ces injections se traduisent par le développement de la leucémie aiguë. Cependant, la nature de cette maladie n&#39;a pas été bien documentée dans la littérature. Ici, nous fournissons un protocole technique pour caractériser les cellules C1498 in vitro pour déterminer la nature de la leucémie induite in vivo. La première partie de cette procédure est axée sur la détermination de la lignée hématopoïétique et le stade de la différenciation des cellules C1498 cultivées. Pour ce faire, multiparamétrique coloration par cytométrie de flux est utilisée pour détecter des marqueurs de cellules hématopoïétiques. La microscopie en immunofluorescence, cytochimie et coloration May-Grünwald Giemsa sont ensuite effectuées pour évaluer l&#39;expression de la myéloperoxydase, l&#39;activité des estérases et la morphologie cellulaire, respectivement. La seconde partie de ce protocole est consacrée à la description de la maladie de la leucémie qui est induite dansvivo. Ce dernier peut être réalisé en déterminant les fréquences des cellules leucémiques et inhérentes dans le sang, les organes hématopoïétiques (par exemple, la moelle osseuse et la rate) et les tissus non lymphoïdes (par exemple, le foie et les poumons) en utilisant une coloration spécifique et cytométrie de flux analyses. La nature de la leucémie est alors confirmée à l&#39;aide de May-Grünwald Giemsa et coloration pour esterases spécifiques dans la moelle osseuse. Ici, nous présentons les résultats qui ont été obtenus en utilisant ce protocole chez les souris C1498- et PBS-injecté âge.

Pour caractériser le modèle C1498 de la souris, nous avons procédé à deux étapes principales. Tout d&#39; abord, les cellules ont été caractérisées C1498 pour déterminer leur lignée hématopoïétique et la maturation étape in vitro (figure 1). Ces cellules ont ensuite été injectées dans des souris congéniques, ainsi que la nature de la maladie leucémique induite a été évaluée afin de déterminer des caractéristiques différentes: l&#39;infiltration de cellules leucémiques, leur phénotype, une quantification des cellules hématopoïétiques (/ précurseurs matures et des progéniteurs) dans la moelle osseuse, les fréquences des C1498 et des cellules hématopoïétiques matures dans le sang et une évaluation du gonflement des organes (dans la rate, le foie et les poumons) et la composition cellulaire. Afin de caractériser le phénotype de cellules C1498 in vitro, les cellules ont été marquées avec des anticorps dirigés contre des molécules qui sont exprimées par des précurseurs hématopoïétiques et des cellules matures (tableau 1) et les résultats ont été analysés à l&#39; aide du flux cytometry. Les cellules C1498 ont été positifs pour l&#39;expression de surface cellulaire de Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (&gt; 25%), et ils affichent l&#39;expression intracellulaire de CD3e, TcR chaînes (RCT) Vß et Mac -3 (figures 2A et B). Les cellules ont été négatifs pour les marqueurs de surface cellulaire Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, et pan-NK molécules et pour l&#39;expression intracellulaire de lymphocytes CD4 et CD8 (données non présentées) . Ils ont ensuite été examinés pour les marqueurs des cellules et des progéniteurs (tableau 1) souches hématopoïétiques. Ils étaient également négatifs pour l&#39;expression de surface cellulaire de CD117, CD34, Sca-1, CD150 et CD16 / 32 (données non présentées). Ces cellules leucémiques ont ensuite été testées pour déterminer l&#39;expression de l&#39;adhérence, la présentation des antigènes et des molécules co-stimulatrices. Les cellules expriment les marqueurs de surface LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), et H-2D b et ont été négatifs pour le CMH de classe II, CD80, CD86 et CD274 (données non présentées). Les cellules T C1498herefore exprimées à la fois myéloïdes (Mac-1, Mac-3) et des marqueurs lymphoïdes (B220, CD3, TCR). Afin de mieux caractériser leur lignée hématopoïétique, l&#39;expression myéloperoxydase a été évaluée en utilisant la microscopie immunofluorescence. Toutes les cellules étaient positives pour la myéloperoxydase, ce qui a vérifié leur origine myéloïde (figure 3A). La majorité des cellules a également une coloration positive pour les α-naphtyl butyrate estérases (figure 3B, le panneau gauche), et certains d&#39;entre eux pour les tachée naphtol AS-D chloroacétate estérases (flèches noires) (Figure 3B, panneau de droite). Les résultats indiquent que les cellules contiennent des mélanges de cellules monocytaires et granulocytaires. Après May-Grünwald Giemsa a été réalisée, les cellules C1498 ont été observées pour afficher une morphologie blastique-like avec un rapport nucléo-cytoplasmique élevé, 3 à 5 nucléoles dans le noyau, un halo périnucléaire, de nombreuses vacuoles et un cytoplasme basophile (figure 3C ). thnous, la lignée cellulaire C1498 est composé de monoblastes et myéloblastes. Les cellules C1498 (CD45.2 +) ont ensuite été injectés par voie intraveineuse en CD45.1 + souris. Les souris ont succombé 17 à 19 jours après que les cellules ont été injectées. Ces souris ont été sacrifiées afin que leur type de leucémie pourrait être analysé avant de mourir de la maladie. Les souris témoins, qui ont été injectées avec du PBS, ont été analysés dans les mêmes points de temps pour la comparaison. Les souris C1498 cellulaire injecté affiche infiltration massive de cellules C1498 dans leur moelle osseuse, tel que démontré par l&#39;apparition de souffle comme des cellules après May-Grünwald Giemsa a été réalisée (figure 4A). Ils ont également conservé leur monocytaire et phénotypes granulocytes (figure 4B et C), ce qui démontre une accumulation de cellules monoblastiques et myéloblastique qui est caractéristique de la leucémie myélomonocytaire aiguë. Pour déterminer si médullaires nombre de cellules hématopoïétiques étaient plus faibles suivant les cellules leucémiques invasion, CD45.2 + C1498 cellules, B lymphocytaire, monocytes et granulocytes populations (y compris les progéniteurs, les précurseurs et les cellules matures), ont été quantifiés en utilisant immunofluorescence et flux multi-paramétrique cytométrie analyse. les cellules leucémiques représentent 16 à 36% des cellules hématopoïétiques (données non présentées). Les autres types de cellules ont été présents tout en nombre significativement plus faibles chez les souris C1498-injectées que chez les souris PBS-injectées (par 5 fois en moyenne pour les sous-ensembles de cellules B, 4 fois en moyenne pour les cellules granulocytes et 3 fois en moyenne, pour des sous - monocytaires) (figure 5A à C). Une enquête sur les fréquences des cellules mononucléaires dans des échantillons de sang leucémiques et de la souris de contrôle a montré qu&#39;ils contenaient un pourcentage comparable de lymphocytes (figure 6A) , mais une fréquence plus élevée des monocyteset des cellules leucémiques. Ces caractéristiques sont représentatives de la leucémie myélomonocytaire aiguë 11 (figure 6B). Parmi les autres caractéristiques de la leucémie myélomonocytaire aiguë 12, les souris C1498-injectées présentées aux foies gonflés (de hépatomégalie), les poumons et la rate (splénomégalie) (Figure 7A). Différentes fréquences de cellules CD45.2 + C1498 ont été détectées dans ces organes à l&#39; aide immunofluorescence et analyse par cytométrie de flux (figure 7b). Comme splénomégalie peut résulter d&#39;un nombre élevé de monocytes infiltrés, nous avons également estimé les proportions des populations spléniques. Le nombre de cellules dans la chambre lymphocytaire, monocytaire et les fractions de cellules granulocytaires étaient significativement plus grandes, par une moyenne de 2 fois, 2,5 fois et 3 fois, respectivement, dans les rates leucémiques que dans les rates de commande (figure 7C). mince page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique du Protocole Set Up pour Caractériser in vitro des lignées cellulaires Cultured C1498 et descriptions in vivo de leucémie aiguë. La lignée hématopoïétique et le stade de la différenciation des cellules C1498 tissus en culture ont d&#39; abord été déterminée. les cellules C1498 ont ensuite été injectées dans des souris congéniques pour induire le développement de la leucémie aiguë. L&#39;isolement de l&#39;os tissus pulmonaires osseuse, le sang périphérique, la rate, le foie et a été réalisée pour déterminer les fréquences, les phénotypes et des changements morphologiques des cellules C1498 après l&#39;infiltration. IV: MGG intraveineux:. Mai-Grünwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> ad / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Analyse phénotypique des cellules C1498 après culture in vitro. Flux représentant cytométrie parcelles de points et histogrammes de surface cellulaire (A) et intracellulaire (B) C1498-exprimé des molécules qui ont été associés à la différenciation des cellules hématopoïétiques matures sont présentés. les cellules C1498 ont été récoltées à partir de cultures, lavées et marquées à l&#39;aide d&#39;anticorps fluorescents qui étaient spécifiques à la surface des cellules CD11b, CD18 et des marqueurs de B220 ou de leurs contrôles isotypiques. Pour la coloration intracellulaire, les cellules ont été fixées, perméabilisées et marquées en utilisant des anticorps dirigés contre le Mac-3, CD3e et un épitope commun du TCR (T-Cell Receptor) chaîne Vß ou leurs contrôles isotypiques. Les analyses ont été effectuées en utilisant gating avec des cellules vivantes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Figure 3. fonctionnelle et morphologique Caractérisation des cellules cultivées C1498. Les cellules C1498 ont été récoltées à partir des cultures et on les centrifuge sur des lames pour microscope. (A) La coloration pour l&#39; expression de la myéloperoxydase a été réalisée par immunofluorescence (B) . Les réactions cytochimiques ont été utilisées pour analyser l&#39;estérase α-naphtyl butyrate (NBE) et le naphtol AS-D chloroacétate estérase (CAE) activités dans les cellules C1498. Les cellules ont été considérés comme positifs pour chaque étiquette lorsque marron et rouge-pourpre, gros granules cytoplasmiques, respectivement, ont été observées. (C) Mai-Grünwald Giemsa (MGG) coloration des C1498 cellules. Pour chaque expérience, la coloration, le grossissement de l&#39;objectif microscopique est indiqué. Chaque image est représentative de trois expériences distinctes.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Figure 4. Souris de moelle osseuse Morphologies en PBS- et C1498-injecté. Des cellules de moelle osseuse ont été isolées à partir de PBS et souris injectées de cellules C1498 et centrifugés sur des lames pour la microscopie. (A) Mai-Grünwald Giemsa (MGG) coloration. (B ) estérase α-naphtyl butyrate (NBE) et (C) naphtol AS-D chloroacétate estérase (CAE) ont été évalués à l&#39; aide des fonctions cytochimie. Dans le panneau A, la bande (immature) ou segmentées neutrophiles (matures) sont moins visibles dans la moelle osseuse des souris C1498-injectées que les souris PBS-injectées. Groupe B et C indiquent qu&#39;il ya eu une accumulation de cellules monocytes et granulocytes dans la moelle osseuse leucémique par rapport aux chiffres observés dans le contrôle de la moelle osseuse. Toutanalyses microscopiques ont été réalisées avec un objectif de grossissement 100X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Figure 5. Souris Analyse quantitative des populations médullaires dans PBS- et C1498-injecté. Des cellules de moelle osseuse ont été isolées à partir de PBS et souris injectées de cellules C1498 et estimées après le comptage des cellules a été réalisée. Les fréquences des différentes populations cellulaires ont été déterminées après immunocoloration et flux de cellules fermée en direct analyse par cytométrie. (A) Les sous - ensembles de cellules B inclus CD19 + B220 + cellules dans les stades à partir de cellules pro-B à maturité des lymphocytes B (B) cellules granulocytaires dans le CD3 - et CD11b + Ly6G + lignées, qui comprenait un des précurseurse. granulocytes matures et immatures (C) Les sous - ensembles monocytaires ont été définis comme CD3 - CD115 + et les cellules incluses dans le progénitrices matures étapes monocytaires. n = 7 souris / groupe et les données sont présentées sous forme d&#39;histogrammes représentant les moyennes ± SEM. ***, P &lt;0,0001 et **, p &lt;0,01, test t de Student non apparié comparant PBS- et souris C1498-injectées. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> Figure 6. Analyse de sang de mononucléaires sous - ensembles de cellules dans PBS et souris C1498-injecté. Débit représentatif cytométrie tracés de points de (A) des pourcentages de lymphocytes T et B, qui sont respectivement définis comme étant CD3 + et les cellules B220 + dans du PBS et injecté cellules C1498. des souris (B) , les fréquences de cellules monocytaires dans C1498 leucémiques et de contrôle des souris (PBS) ont été déterminées en analysant CD115 + Ly6C - et CD115 + Ly6C cellules élevées. L&#39;analyse a été réalisée par gating des cellules vivantes. Pour comparer les souris leucémiques et de contrôle, CD45.2 + C1498 cellules ont été exclus. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Figure 7. Estimation des populations spléniques en leucémiques et de contrôle des souris. (A) des photographies représentatives du foie, du poumon et de la rate gonflement chez les souris leucémiques comparées aux souris témoins. Les rates ont été recueillies et pesées, et les splénocytes ont été comptés après la rupture des tissus. (B) Histogramme représentant les fréquences de cellules leucémiques dans difforganes érents après immunocoloration a été réalisée pour CD45.2 + cellules et les résultats ont été analysés par cytométrie en flux. (C) Les estimations de B splénique, le nombre de granulocytes et de monocytes cellulaires après immunomarquage et l&#39; analyse de cytométrie en flux gating ont été réalisées pour identifier en direct CD19 + B220 + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - et CD3 - cellules élevées CD11b + Ly6C. Les barres d&#39;échelle indiquées pour les poumons, la rate et le foie indiquent 1 cm. .. n = 5-8 souris / groupe, et les données sont représentées dans les histogrammes que les moyens ± SEM *, p &lt;0,05; **, p = 0,0033 souris, test t de Student non apparié comparant PBS- et C1498-injecté <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> Type de cellule </td><td> Membrane ou intracellulaire Molécules </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Précurseurs et cellules matures </td><td></td></tr><tr><td> Les cellules NK </td><td> NK1.1 +, pan-NK + </td></tr><tr><td> Les cellules NKT </td><td> NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 + </td></tr><tr><td> Les lymphocytes T </td><td> Vbeta TCR +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> cellules B précurseurs et de lymphocytes B </td><td> B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + </td></tr><tr><td> précurseurs et granulocytes granulocytes </td><td> Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + </td></tr><tr><td> précurseurs monocytes et les monocytes / macrophages </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Progéniteurs </td><td></td></tr><tr><td> progéniteurs multipotentes </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-) </td></tr><tr><td> progénitrices multipotentes lymphoïdes amorcées </td><td> CD117hi 1hi Sca-CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> progéniteurs lymphoïdes communs </td><td> CD117lo 1LO Sca-CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> progéniteurs myéloïdes communs </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- Sca-1-) </td></tr><tr><td> progéniteurs de granulocytes-macrophages </td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- Sca-1-) </td></tr><tr><td> progéniteurs érythroïdes mégacaryocytes </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- Sca-1-) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Les cellules souches hématopoïétiques </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Les marqueurs de lignées de cellules hématopoïétiques et Différenciation. CD: groupe de différenciation; Lin: marqueurs de cellules matures; lo:faible expression; salut: haute expression; int: expression intermédiaire; NK: les cellules tueuses naturelles; TCR: récepteur des cellules T.

Ce manuscrit fournit un procédé technique qui peut être utilisée pour caractériser des cultures de cellules C1498 in vitro et la leucémie aiguë induite chez la souris après leur injection. analyses phénotypiques et fonctionnelles sont effectuées à l&#39;aide de cytométrie de flux, la microscopie d&#39;immunofluorescence, cytochimie et May-Grünwald Giemsa.

Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

L'objectif général de cette procédure est de caractériser les cellules murines C1498 et la leucémie aiguë qu'elles induisent après injection intraveineuse chez la souris. Le principal avantage de cette procédure réside dans le fait que la leucémie myélomonocytaire murine induite après injection de cellules C1498 présente de nombreuses caractéristiques de la maladie humaine. Ce modèle animal peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématologie, telles que les mécanismes menant au développement de la leucémie et à l'immunodéficience.L'implication de ce modèle animal s'étend au traitement de la leucémie, car il facilite l'évaluation de nouveaux agents chimiothérapeutiques et immunothérapeutiques. Commencez par transférer une souris femelle congénique C57 black 6 âgée de cinq à six semaines dans une hotte à flux laminaire stérile. Ensuite, placez l'animal dans un dispositif de contention.Ensuite, charger une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 29 avec 100 microlitres de cellules. Saisir la queue à l'extrémité distale et désinfecter la peau de la queue avec une compresse imbibée d'éthanol à 70 %. Procéder ensuite à l'injection lente de un fois 10 puissance six cellules dans une veine latérale de la queue.Lorsque toutes les cellules ont été administrées, retirez l'aiguille et appliquez une pression douce au site d'injection à l'aide d'une compresse stérile. Ensuite, remettez l'animal dans sa cage et surveillez-le attentivement pendant les semaines suivantes. 17 à 19 jours plus tard, insérez un tube capillaire dans le canthus médial de l'œil de l'animal leucémique anesthésié.De 100 à 200 microlitres de sang seront prélevés du sinus orbital dans le tube capillaire. Retirez le tube et contrôlez l'hémorragie en appliquant doucement une compresse stérile sur l'œil. Ensuite, transférez le sang dans un tube contenant de l'EDTA et conservez le tube sur de la glace jusqu'à l'isolement des cellules mononucléées.Pour isoler les cellules mononucléées du sang, ajoutez d'abord du PBS enrichi avec un millimolaire de EDTA jusqu'à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, transférez l'échantillon dans un tube de microcentrifugation. Puis, utilisez une seringue de un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 30 pour déposer soigneusement 500 microlitres de solution de séparation sous le sang, en prenant soin de ne pas mélanger les couches.Séparez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette pour transférer la couche blanche opaque de cellules mononucléées dans un nouveau tube microcentrifuge. Ensuite, lavez les cellules immunitaires dans un millilitre de PBS. Centrifugez-les puis resuspendez le culot dans 600 microlitres de tampon FACS pour la coloration et l'analyse par cytométrie en flux.Pour isoler la moelle osseuse, placez la souris sur le dos sur une planche en plastique et fixez les membres de l'animal. Désinfectez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, coupez chaque jambe au niveau supérieur du fémur, au-dessus de l'articulation, puis tirez doucement sur les tibias pour les détacher des fémurs.Utilisez une pince et des ciseaux pour retirer la peau et les muscles des os, puis transférez les os dans une boîte de Pétri placée sur de la glace. Utilisez les ciseaux pour retirer les extrémités. Ensuite, insérez un aiguille de calibre 26 fixée à une seringue de 10 millilitres contenant cinq millilitres de PBS froid dans l'extrémité d'un os à la fois et éjectez les moelles osseuses dans la boîte.Faites passer la suspension cellulaire plusieurs fois à travers l'extrémité de l'aiguille afin de rompre les cellules de la moelle osseuse. Ensuite, filtrez les cellules à travers un nouveau filtre de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres pour obtenir une suspension monocellulaire. Centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot dans deux millilitres de tampon de lyse.Remplir immédiatement le tube avec jusqu'à 50 millilitres de PBS froid et centrifuger les cellules. Ensuite, reprendre le culot de moelle osseuse à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre dans du tampon FACS froid. Pour préparer les cellules de moelle osseuse au marquage, placer d'abord des lames dans des chambres jetables munies de cartouches filtrantes, puis insérer les chambres dans un cytocentrifugeur.Ajouter 100 microlitres de tampon FACS dans chaque chambre de la carte filtrante et centrifuger brièvement les lames. À la fin de la centrifugation, ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque chambre et centrifuger les cellules. Ensuite, retirer soigneusement les lames des chambres pour les faire sécher à l'air.Pour colorer les cellules de la moelle osseuse, plongez les lames dans un bocal Coplin contenant la solution de May-Grünwald pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les lames dans un bocal contenant une solution tampon de pH 6,8 pendant une minute. Puis, transférez les lames dans la solution de Giemsa R pendant 10 minutes.Procéder à un rinçage de 10 secondes avec de l'eau neutre de pH. Après le rinçage, laisser sécher les lames à l'air libre et appliquer une goutte de milieu de montage sur chaque échantillon. Ensuite, poser un bord d'une lame à couvrir sur la lame porteuse, puis abaisser délicatement la lame à couvrir sur les cellules en appuyant légèrement pour éliminer les bulles d'air.Contrairement aux animaux témoins, les animaux injectés avec les cellules C1498 présentent une infiltration massive de cellules C1498 dans leur moelle osseuse, comme observé par l'aspect de type blastique des cellules. Les cellules C1498 infiltrant la moelle osseuse présentent des phénotypes monocytaires et granulocytaires, indicatifs respectivement de cellules monoblastiques et myéloblastiques, caractéristiques de la leucémie aiguë myélo-monocytaire. L'analyse cytométrique en flux des fréquences des cellules mononucléées dans les échantillons sanguins des souris injectées avec les cellules C1498 indique qu'environ un quart de l'ensemble de la population de globules blancs est constitué de cellules leucémiques.Les fréquences des lymphocytes T et B sont similaires entre les animaux témoins et ceux injectés avec C1498. Les fréquences des monocytes, en revanche, sont observées à des niveaux plus élevés chez les souris injectées avec C1498, une caractéristique de la leucémie aiguë myélo-monocytaire. Lors de la réalisation des procédures de cytochimie et de May-Grünwald Giemsa, il est important de se rappeler de maintenir les valeurs de pH, les températures et les durées d'incubation appropriées.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de caractériser la leucémie aiguë myélo-monocytaire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hématologie pour explorer la nature des leucémies aiguës spontanées et induites dans d'autres modèles animaux.

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Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

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