Name: Approches génétiques et biochimiques pour In Vivo et In vitro Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Découvrez les approches génétiques et biochimiques pour évaluer l'oligomérisation du récepteur de la ryanodine in vivo et in vitro. Ces méthodes permettent d'étudier les interactions protéiques impliquées dans les arythmies cardiaques.

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Ce travail a été soutenu par des bourses British Heart Foundation à SZ (FS / 08/063 et FS / 15/30/31494).

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Les auteurs ont rien à déclarer.

La formation de la protéine homo-oligomères est un processus biologique fondamental qui régit l&#39;activité des facteurs de transcription, des enzymes, des canaux ioniques et des récepteurs 25,26. Fait important, la protéine oligomérisation a également des conséquences pathologiques , y compris la neurodégénérescence et de la maladie cardiaque arythmogène 4,27. Les méthodes décrites dans cet article sont utilisés pour identifier les interactions domaine-domaine médiatrices protéine auto-association et oligomérisation. Ci-dessous, nous indiquons aux étapes critiques au sein de chaque protocole, et nous discutons d&#39;importantes considérations, les limites et le dépannage. Le système de Y2H peut être utilisé d&#39;abord pour dépister les éventuels partenaires protéiques interagissant en raison de sa projection relativement à haut débit, la facilité d&#39;utilisation et des résultats hautement reproductibles. procédures Y2H sont effectuées dans un laboratoire de microbiologie à la norme (plaque ou agitateur) incubateurs et des installations chambre de confinement. L&#39;utilisation de frcellules compétentes eshly préparés (étape 1.1.8) est essentielle pour une grande transformation de la levure d&#39;efficacité, alors que pour obtenir les meilleurs résultats dans les essais β-Gal, fraîchement cultivé colonies de levure (jusqu&#39;à 5 jours anciens) doit être utilisé (étape 1.2.3). Les systèmes basés sur des facteurs de transcription autres que GAL4 et / ou des gènes rapporteurs supplémentaires / alternatifs sont disponibles, et donc des appâts et des plasmides proies doivent correspondre à la souche Y2H appropriée. Certaines souches doivent être mises en culture en présence d&#39; acide 3-amino-1,2,4-triazole, un inhibiteur compétitif de la protéine HIS3, afin d&#39;étancher une expression constitutive du gène rapporteur HIS3 7,8. Expression de protéines de fusion appât et cibles devraient être vérifiées par immunotransfert 17. Dans le cas où l&#39;appât / protéines de fusion proies sont toxiques pour les levures, les taux de protéines plus faible tolérables pourraient être obtenus par clonage dans des vecteurs différents où un appât / proie expression est entraînée par un promoteur différent. En outre, il est essentiel de s&#39;assurer tprotéines appât / proie de fusion de chapeau ne présentent pas l&#39;activité du gène rapporteur autonome. l&#39;activation du gène rapporteur autonome peut être secouru par la modification de la construction pour éliminer la région responsable ou en échangeant l&#39;ADN GAL4 BD et des fusions de la MA pour les deux protéines testées. En outre, les domaines transmembranaires sont mieux omis des constructions d&#39;appât / proie, car ils peuvent provoquer un mauvais repliement ou une mauvaise localisation des protéines de fusion dans les compartiments membranaires intracellulaires. En effet, le principal inconvénient du système de Y2H est que les protéines d&#39;appât et de la cible sont localisés dans le noyau de la levure hors de leur localisation subcellulaire physiologique et susceptible de ne pas les modifications post-traductionnelles spécifiques, ce qui entraîne des interactions faussement positifs ou faussement négatifs 6-9 . Les systèmes d&#39;expression hétérologues de mammifères sont mieux adaptés à l&#39;étude des protéines membranaires intégrales de mammifère en termes de conformation, modifications post-traductionnelles et la localisation subcellulaire.Une des méthodes de transfection de cellules les plus largement utilisés est la précipitation de phosphate de calcium, principalement en raison de l&#39;équipement minimal et les réactifs nécessaires 11,15. Des méthodes alternatives, à savoir l&#39;électroporation, les liposomes, les lipides et les polymères cationiques, peuvent donner une plus grande efficacité de transfection en fonction de la lignée cellulaire et la construction utilisée. D&#39;une manière générale, les principaux facteurs qui affectent l&#39;efficacité de transfection sont plasmide qualité de l&#39;ADN cellulaire et la santé / viabilité. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque l&#39;ADN de plasmide de la plus haute pureté (260 nm / 280 nm de rapport d&#39;absorbance ~ 1,8) et des cellules en division active sont utilisées. Les cellules doivent par conséquent être transfectés à pas plus de 60 - 70% de confluence (étape 2.1.2), parce que la capacité à absorber l&#39;ADN étranger est liée à la surface de la cellule exposée au milieu 11. En outre, l&#39; inclusion d&#39;antibiotiques dans le milieu de culture pendant la transfection (étape 2.1.3) est déconseillée en raison de la mort cellulaire accrue 15. Fou le phosphate de calcium, une précipitation, en particulier, une préparation minutieuse et l&#39;ajustement du pH (à 7,05 avec précision) de la solution de 2 x HBS (étape 2.1.1), et la formation correcte de l&#39;ADN de plasmide / calcium / complexes de phosphate par un mélange vigoureux (étape 2.1.5) sont étapes critiques pour la transfection à haut rendement. En règle générale, l&#39;expression des protéines par des pics de transfection transitoire au sein de 24-72 h. Une fois que les cellules sont récoltées, les procédures ultérieures doivent être effectuées à 4 ° C pour minimiser l&#39;activité de protéase, et l&#39;addition d&#39;inhibiteurs de la protéase est recommandée. Cellule homogénéisation doit être suivie d&#39;une étape de centrifugation pour éliminer les noyaux car l&#39;ADN chromosomique peut augmenter la viscosité de la solution et améliorer la liaison non spécifique. Ainsi, l&#39;homogénéisation par un moyen mécanique dans un tampon iso-osmotique est préféré, habituellement (0,3 M), le saccharose ou le (150 mM) de NaCl. En général, les tampons à base de saccharose sont connus pour améliorer la stabilité des protéines et de réduire l&#39;agrégation potentiel de protéine non-native, mais en raison de phydratation référentielle sur la surface de la protéine, interactions protéine-protéine électrostatiques sont favorisés. A l&#39; inverse, des tampons à base de sel influencent la charge nette des groupes latéraux d&#39;acides aminés chargés sur la surface de la protéine, ayant ainsi un biais en faveur des interactions plus hydrophobes à base 28. Co-IP est le dosage biochimique le plus couramment utilisé pour évaluer les interactions protéine-protéine en particulier à partir de tissu natif. Son principal inconvénient est l&#39;exigence d&#39;anticorps hautement spécifiques validés pour une utilisation dans IP et immunobuvardage 10,16,18. Ainsi, les protéines recombinantes sont souvent marqués avec un epitope peptidique, par ex., La grippe hémagglutinine (YPYDVPDYA) ou cMyc humaine (EQKLISEEDL), pour lequel des anticorps spécifiques de haute affinité sont disponibles dans le commerce. Si on le désire, l&#39;anticorps immunoprécipitation peut être conjugué chimiquement à la résine de protéine A pour éviter la détection et l&#39;élution à l&#39;étape de immunoempreinte qui peuvent obscurcir le co-précipité protein 16; Pour ce faire , nous avons utilisé avec succès l&#39;agent de réticulation 3,3&#39;-dithiobis de chimique (suifosuccinimidylpropionate) 24. Il est impératif que d&#39;un détergent approprié est inclus dans le tampon IP et le matériau insoluble de cellules homogénéisées est éliminé par centrifugation pour minimiser la liaison non spécifique (étape 3.1.3). Le choix et la concentration de détergent sont des considérations importantes: les détergents forts et / ou des concentrations plus élevées permettront de réduire considérablement la liaison non spécifique, mais peuvent également supprimer X: Y protéines d&#39;interaction, tandis que des concentrations plus faibles ou de détergents doux peut permettre une interaction faible pour être observée, mais peut entraîner trop de liaison non spécifique. Les détergents de résistance intermédiaires sont préférés, par exemple, le Triton X-100 à 0,5. - Concentration de 1%. Afin de réduire davantage la liaison non spécifique, une protéine neutre (par exemple, la sérum albumine bovine à 100 ug / ml) peut être inclus dans le tampon IP et / ou le lysat cellulaire peut être pré-cleared avec une incubation préalable avec la résine de protéine A seul. Le nombre de lavages devrait être optimisé pour le X: Y paire testée, typiquement trois lavages de 10 min avec un tampon IP (étape 3.1.9). Dans tous les cas, un échantillon de co-IP avec l&#39;IgG non immune comme l&#39;anticorps immunoprécipitation doit toujours être traité en parallèle pour servir de témoin négatif (étape 3.1.6). Le principal avantage de réticulation chimique est qu&#39;elle informe sur la composition stoechiométrique de la protéine homo-oligomère. Le glutaraldéhyde est un agent de réticulation couramment utilisé car il ne nécessite aucun équipement spécialisé et il génère thermiquement et chimiquement stables liaisons transversales entre les protéines qui interagissent 19,20. Les composés avec des groupes amino libres doivent être omises de dosage tampons (étape 3.2.1) car ils vont arrêter la réaction chimique. la concentration en glutaraldéhyde et le temps de réaction (étape 3.2.4) doivent être optimisées pour le complexe protéine oligomérique d&#39;intérêt. Le principal inconvénient de cette technique, especiallié lorsqu&#39;elles sont effectuées sur des préparations de cellules entières, est la non-spécificité de la réaction chimique qui pourrait produire des agrégats de protéines artificielles qui manquent de signification biologique. Alternatif in vivo (par ex., Une fluorescence de résonance transfert d&#39;énergie de fluorescence bi-moléculaire ou la luminescence complémentation) et des techniques in vitro (par ex., La Chromatographie en taille d&#39;exclusion, l&#39; ultracentrifugation analytique, calorimétrie de titration isotherme) sont disponibles pour la caractérisation des protéines auto-association et d&#39; évaluation dbligomérisation stoechiométrie 29,30. Chaque méthode a ses propres avantages et inconvénients, et il peut être plus approprié pour l&#39;étude d&#39;une protéine spécifique en fonction de la protéine purification / stabilité et la disponibilité du matériel / réactif. Les trois méthodes complémentaires décrites ici en détail, à savoir Y2H, co-IP et la réticulation, ont été utilisés en combinaison pour fournir des preuves convaincantes de RyR2 homo-oligomela formation de r dans l&#39;isolement et à l&#39;intérieur d&#39;une cellule vivante.

Skeletal et contraction du muscle cardiaque est déclenchée par le réticulum sarcoplasmique Ca 2+ libération médiée par RyR. Il existe trois isoformes RyR mammifères avec le canal fonctionnel composé de quatre sous-unités identiques. Chaque sous - unité RyR se compose d&#39;une grande partie N-terminale de réglementation cytoplasmique et une petite partie C-terminale contenant les domaines transmembranaires qui forment une grande conductance Ca 2+ pore. Interactions intra- anormale et inter-sous - unités sous - tendent un dysfonctionnement des canaux RyR et entraînent des troubles neuromusculaires et cardiaques 1. L&#39;identification et la caractérisation des domaines spécifiques impliqués dans RyR structure: relation de fonction est donc crucial pour la compréhension de la physiopathologie RyR. des techniques d&#39;interaction protéine-protéine biochimiques traditionnelles nécessitent des quantités importantes de protéine purifiée, souvent produites dans les bactéries. Ceci est impossible dans le cas de la RyR, une très grande membrane de protein composé de ~ 5000 acides aminés, alors que ses fragments recombinants ne sont pas facilement se prêtent à l&#39;expression bactérienne et purification. Ainsi, des systèmes d&#39;expression impliquant d&#39;autres cellules hôtes eucaryotes sont requises pour des protéines membranaires intégrales de mammifères. Nous avons déjà utilisé Y2H, le co-IP et les essais de reticulation afin de démontrer que , collectivement extrémité N-terminale tétramérisation est une caractéristique structurelle qui est conservée à travers les trois isoformes de mammifère RyR 2,3. Surtout, nous avons trouvé qu&#39;une seule mutation ponctuelle associée à une maladie cardiaque arythmogène perturbe N-terminale auto-association et les résultats dans un canal RyR dysfonctionnel 4. Nous avons également appliqué ces techniques à des études d&#39;oligomérisation de l&#39;cytoplasmique C-terminale de la queue RyR 5 ainsi que l&#39; extrémité N-terminale de la libération de Ca2 + intracellulaire canal homologue, le récepteur de l&#39; inositol 1,4,5 triphosphate de 2. Dans le dosage Y2H, le interactisur entre deux protéines (X et Y) est mesurée par la reconstitution d&#39;un facteur de transcription fonctionnel (GAL4) et l&#39;activation consécutive de gènes rapporteurs 6-9. Deux vecteurs de clonage différents sont utilisés pour générer des fusions de deux protéines testées avec les deux physiquement séparables, des domaines indépendants de GAL4: / protéine X fusion DNA-Binding Domain (ADN-BD) (appât) et d&#39;activation (AD) / protéine Y fusion (cible). Le Y2H peut être utilisée pour tester si une protéine interagit avec lui-même en générant l&#39;ADN de GAL4 BD et des fusions AD de la même protéine. Génétiquement modifiés souches Y2H sont GAL4 et GAL80 déficiente (la protéine GAL80 est un répresseur de GAL4), ainsi que TRP1 et LEU2 déficient (pour fournir la sélection nutritionnelle pour appât et proie des plasmides, respectivement). Dans le noyau de levure, les peptides ADN-BD et AD recombinantes sont mises en proximité physique pour produire un facteur hybride de transcription GAL4 seulement par le X de leurs fusions: Y interaction. Cette approche permet un dépistage génétique rapide pour détecter des interactions protéine-protéine par l&#39;activation de la transcription en parallèle prototrophe (codant HIS3 pour une enzyme nécessaire à la biosynthèse de l&#39; histidine) et chromogénique (codant pour lacZ pour la β-galactosidase (β-Gal)) des gènes rapporteurs. Le principal avantage de la Y2H est qu&#39;il est un essai in vivo qui détecte les interactions protéine-protéine , même faibles ou transitoires. En outre, la détection implique l&#39;utilisation simple de sélection de croissance (dans un milieu sans histidine) ou de colorimétrie (β-Gal) Essai sans nécessiter de purification des protéines d&#39;appât et de la cible ou la génération d&#39;anticorps spécifiques. En outre, le Y2H peut être utilisé pour cribler une collection de clones inconnus aléatoires (clones de la banque d&#39;ADNc fusionnés à GAL4 AD) pour les nouveaux partenaires de liaison d&#39;une protéine d&#39;appât, ce qui donne un accès direct à l&#39;ADNc de la protéine de la bibliothèque. Pour étendre les observations Y2H, independtechniques biochimiques ent peuvent être employées. Co-IP et des essais de réticulation combinés avec immunoblot sont les méthodes utilisées pour détecter des associations de protéines dans des mélanges d&#39;échantillons complexes, par exemple., Lysats de cellules entières 10. Leur principal avantage est qu&#39;ils rendent compte des interactions protéine-protéine du tissu natif, contrairement à d&#39;autres méthodes qui nécessitent l&#39;utilisation de protéines recombinantes. Les protéines recombinantes peuvent également être utilisés, typiquement exprimés dans une lignée cellulaire de mammifère, où elles sont susceptibles d&#39;avoir leur conformation correcte et modifications post-traductionnelles, ainsi que la localisation subcellulaire. Toutefois, étant donné que la co-IP et la réticulation sont des essais in vitro en utilisant des cellules homogénéisées, il est nécessaire de confirmer si les deux partenaires protéiques sont co-localisés dans la cellule intacte 11. Nous utilisons régulièrement transfection de cellules HEK293 de mammifères pour exprimer transitoirement membranaire intégrale des mammifères et des protéines cytosoliques en utilisant la méthode au phosphate de calcium de précipitation 2-4,12-14, Décrit ici en détail. Ceci est un moyen peu coûteux de fournir efficacement l&#39;ADN de plasmide à l&#39; intérieur des cellules mais elle est dépendante de la lignée cellulaire particulière utilisée et la confluence des cellules, ainsi que la pureté de l&#39;ADN plasmidique 11,15. Le test de co-IP implique l&#39;isolement de la protéine native ou recombinante d&#39;intérêt à partir de lysats de cellules dans des conditions non dénaturantes permettant la co-purification de partenaires d&#39;interaction putatif 10,16. Il nécessite l&#39;utilisation de deux anticorps indépendants, l&#39;anticorps immunoprécipitation pour l&#39;isolement de la protéine X, et l&#39;anticorps immunotransfert pour la détection de partenaire de protéine Y. Elle peut être utilisée pour tester si une protéine interagit avec lui-même en produisant deux fusions différents, avec deux épitope différent balises (par exemple., HA et cMyc). L&#39;anticorps est lié immunoprécipitation par sa région Fc sur la protéine A (ou de protéine G, en fonction de l&#39;espèce animale, où l&#39;anticorps a été élevé), quiest conjugué à de l&#39;agarose (Sepharose ou) une résine. La protéine X est précipitée par l&#39;anticorps: protéine A-résine après incubation avec le lysat cellulaire, à savoir la fraction de détergent soluble dans des cellules homogénéisées. Protéines immuncomplexes sont éluées avec un tampon contenant du SDS et analysées ensuite par SDS-PAGE et immunoblot en utilisant un anticorps pour détecter la présence de la protéine Y 17. Co-IP doit être réalisée avec des protéines de détergent soluble dans excessive pour éviter une liaison non spécifique. Le choix du détergent et de sa concentration, ainsi que le nombre de lavages doivent être optimisés pour chaque X: Y paire 10,16,18. La réticulation est utilisée pour déterminer la stoechiométrie du complexe de protéine oligomérique. Elle est basée sur une réaction chimique afin de créer des liaisons covalentes entre les protomères qui interagissent adjacentes, et par conséquent, elle permet de préserver l&#39;état oligomérique de la protéine pendant la séparation par SDS-PAGE. Il existe de nombreux reage de reticulationnts de longueurs différentes et la composition chimique ciblant différents groupes réactifs sur les protéines, les amines primaires, typiquement des groupes carboxyle ou thiol. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation de glutaraldéhyde (OHC (CH 2) 3 CHO), un agent de reticulation homo-bifonctionnel avec deux groupes aldéhyde aux deux extrémités , qui réagissent avec les groupes amino libres présents dans les résidus lysine 19,20. La réticulation est suivie d&#39;une manière concentration- ou dépendant du temps conduisant à la formation d&#39;addition. Glutaraldéhyde réaction est arrêtée avec de l&#39; hydrazine (H 2 NNH 2) et les échantillons de protéines sont ensuite analysés par SDS-PAGE et immunotransfert 17 pour évaluer l&#39;état d&#39;oligomérisation. Il convient de noter que la réticulation ne provoque pas oligomérisation mais crée simplement des ponts stables entre des complexes de protéines pré-existantes. Considérations importantes lors de la réalisation des expériences de réticulation comprennent le choix de l&#39; agent de réticulation, sa concentration et le temps de réaction 19,20.

<table><tbody><tr><td><forte>PARTIE 1 levure deux-hybrides</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à plaques</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Utilisé à 30 &deg ; C</td></tr><tr><td>Incubateur à agitateur orbital</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Utilisé à 30 &deg ; C avec agitation à 230 - 250 tr/min</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Pour mesurer OD600 de culture de levure ; pour mesurer l’absorbance à 420 nm dans un test b-Gal liquide</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contient le vecteur d’appât pGBKT7, le vecteur de proie pACT2 et la souche de levure Y190 ;</td></tr><tr><td>Base d’azote de levure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Pour préparer un milieu de culture SD minimal&nbsp ;</td></tr><tr><td>Complément alimentaire dépourvu de leucine et de tryptophane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Pour préparer un milieu de culture SD minimal&nbsp ;</td></tr><tr><td>Supplément d’abandon manquant de leucine, tryptophane, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Pour préparer un milieu de culture SD minimal&nbsp ;</td></tr><tr><td>Testicules de hareng porteur d’ADN&nbsp ;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Pour la transformation de levure</td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman Grade 5&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>pour utilisation dans le test du papier filtre b-Gal pour l’absorption des colonies</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>pour l’utilisation dans le test du papier filtre b-Gal pour l’inhalation</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophényl-&beta ;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>pour l’utilisation</td></tr> <tr><td>dans le dosage du b-Gal liquidePARTIE 2. Expression protéique dans une lignée cellulaire de mammifère</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>lignée</td> cellulaire <td>ATCC ATCC&reg ; &nbsp ; CRL-1573&commerce ;</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur humidifié (5 % CO2, 37 &deg ; C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Pour cultiver des cellules de</td></tr><tr><td>mammifères DMEM (milieu de l’aigle modifié de Dulbecco)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>Pour préparer le milieu de croissance des cellules de mammifères</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>Pour préparer le milieu de croissance des cellules de mammifères</td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Pour homogénéiser les cellules</td></tr><tr><td>Aiguille 23 G (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>Pour homogénéiser les cellules</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase (Complet)&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Pour prévenir la protéolyse</td></tr><tr><td><forte>PARTIE 3. Méthodes biochimiques in vitro&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (système SDS-PAGE)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp ;</td><td>Pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (système de transfert semi-sec)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Pour transfert électrophorétique</td></tr><tr><td>Processeur compact de films à rayons X</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>Pour utilisation dans l’immunobuvardage</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Pour utilisation dans la réticulation chimique</td></tr> des <tr><td>billes de sépharose Protein-A&nbsp ;</td><td>GE Healthcare Sciences de la vie</td><td>17-5280-01&nbsp ;</td><td>Pour une utilisation dans le dosage de la co-IP</td></tr><tr><td>Anti-HA (IgG polyclonales de lapin Y-11)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Pour utilisation dans le test de co-IP</td></tr><tr><td>IgG de lapin non immunisé</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp ;</td><td>sc-2027</td><td>Pour une utilisation dans le test co-IP</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (IgG monoclonale de souris 9E10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp ;</td><td>sc-40</td><td>Pour utilisation en immunobuvardage</td></tr><tr><td>Anti-HA (IgG monoclonales de souris 16B12)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Pour utilisation en immunobuvard</td></tr><tr><td>Anti-souris IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>Pour utilisation en immunobuvard</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>Pour utilisation en immunobuvardage</td></tr><tr><td>ECL Western Blot Substrate</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>Pour utilisation en immunobuvardage</td></tr></tbody></table>

approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; in vivo</em&gt; et<em&gt; in vitro</em&gt; Évaluation de protein oligomérisation: Étude de cas ryanodine receptor

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

L’oligomérisation est souvent une exigence structurelle pour que les protéines accomplissent leur fonction cellulaire spécifique. Par exemple, la tétramérisation du récepteur de la ryanodine (RyR) est nécessaire à la formation d’un pore fonctionnel du canal de libération de Ca2+. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour l’évaluation de l’auto-association des protéines, y compris les tests de bi-hybridation de levure (Y2H), de co-immunoprécipitation (co-IP) et de réticulation chimique. Dans le système Y2H, l’auto-interaction protéique est détectée par le dosage de la β-galactosidase dans l’appât GAL4 co-exprimant la levure et les fusions cibles de la protéine testée. L’auto-interaction protéique est évaluée par co-IP à l’aide de fusions marquées HA- et cMyc de la protéine testée co-exprimée dans les cellules HEK293 de mammifères. La stœchiométrie précise de la protéine homo-oligomère est examinée par réticulation et analyse SDS-PAGE après expression dans les cellules HEK293. En utilisant ces techniques différentes mais complémentaires, nous avons constamment observé l’auto-association du domaine N-terminal RyR et démontré sa capacité intrinsèque à former des tétramères. Ces méthodes peuvent être appliquées à l’étude de l’interaction protéine-protéine et de l’homo-oligomérisation d’autres protéines membranaires intégrales de mammifères.

Dans le système de Y2H, l&#39;appât: proie interaction est d&#39; abord testé par la sélection de la levure de croissance dans un milieu dépourvu (tryptophane, la leucine et) histidine et ensuite évaluées par le β-Gal activité enzymatique des dosages (Figure 1). Levure cultivées dans histidine manque moyen a un taux de croissance lente qui dépend de la force de l&#39;appât: une protéine d&#39;interaction de proie. Le dosage de β-Gal est réalisée dans la levure (cultivées dans un milieu dépourvu de tryptophane et de leucine seulement), soit de plus en plus sur un support solide (plaques de gélose) ou dans une culture liquide, ces derniers résultats quantitatifs rendement. Nous avons utilisé avec succès pour identifier les interactions Y2H de domaine au sein du domaine RyR2 ainsi que de nouveaux partenaires protéiques 2-4,12,21,22. Par exemple, nous avons criblé une série de constructions se chevauchant couvrant toute la longueur de la séquence peptidique RyR2 pour une interaction avec un fragment N-terminal (AD4L: résidus RyR2 1-906 fusionnée avec GAL4 AD). 3 tests papier filtre Colony lift-β-Gal produit colonies vives de couleur bleue levure seulement pour le BT4L: AD4L paire (figure 2A), montrant que AD4L interagit avec lui - même, à savoir la BT4L construire (résidus RyR2 1-906 fusionné avec GAL4 ADN-BD). des colonies bleu pâle ont été détectés pour la BT8: paire AD4L suggérant une association secondaire plus faible avec le domaine C-terminal extrême (BT8), tandis que la levure co-transformée avec une autre construction est restée blanche et donc négatif pour appât: l&#39;interaction de la protéine de proie. Les résultats quantitatifs obtenus par liquides essais β-Gal (figure 2B), indiqué BT4L robuste: AD4L équivalent d&#39;interaction dans la force de l&#39;association connue entre la protéine p53 (pVA3) et SV40 grand antigène T (pTD1), alors que le BT8: AD4L interaction a été considérablement plus faible (&lt;10% par rapport au contrôle). Nous réalisons régulièrement des expériences de co-IP (Figure 3) fuite expression transitoire dans une lignée cellulaire de mammifère (HEK293), comme un dosage biochimique indépendante pour renforcer les résultats de Y2H 2-4,12-14,21-24. Pour vérifier RyR2 N-terminale auto-interaction, deux plasmides séparés codant pour des résidus RyR2 1-906 marquées soit avec l&#39;épitope cMyc ou peptide HA (BT4L et AD4L, respectivement), ont été co-transfectés dans des cellules HEK293 en utilisant le procédé au phosphate de calcium de précipitation, 3. La fraction post-nucléaire de cellules homogénéisées a été solubilisé avec le détergent CHAPS et le matériau insoluble a été éliminé par centrifugation pour produire le lysat cellulaire. Le lysat cellulaire traité avec l&#39;agent réducteur dithiothréitol, a été ensuite mis en incubation avec Ac HA et des billes de protéine A -sépharose à immunoprécipiter AD4L HA-étiquetée. Échantillons Co-IP, éluées avec un tampon contenant du SDS, ont été chargés sur deux gels SDS-PAGE séparés (1/10 e et 9/10 e fendues) et analysées par immunotransfert avec Ab HA et Ab cMyc, respectively. Réussi IP directe de AD4L (~ 100 kDa) par Ab HA a été vérifiée par immunotransfert, mais pas dans le témoin négatif en utilisant une IgG de lapin non immun (figure 4A). Surtout, cMyc marqués BT4L (~ 100 kDa) a été récupéré seulement dans le HA IP Ab, et non pas dans le témoin négatif en l&#39;absence de AD4L immunoprécipité (figure 4B). Y2H et co-IP tests ont fourni des preuves cohérentes pour RyR2 N-terminale auto-interaction, mais ils n&#39;ont pas informé sur l&#39;état d&#39;oligomérisation du domaine N-terminal, à savoir si elle forme seulement des dimères ou des complexes plus élevés. Il convient de noter que les complexes se dissocie et que seuls les sous-unités comprenant sera détectée par SDS-PAGE, en raison de SDS et de la dénaturation des protéines induites par la chaleur, supprimant les interactions protéine-protéine. Pour y remédier, on utilise une reticulation (figure 5) qui fait converger de manière stable chimiquement et pré-existante protein oligomères, dont la masse moléculaire peut ensuite être examiné par SDS-PAGE la taille de séparation 2-5. Par exemple, les cellules HEK293 exprimant homogénat-cMyc BT4L, traité avec l&#39;agent réducteur dithiothréitol, on a fait réagir avec du glutaraldéhyde et on l&#39; analyse par SDS-PAGE et immunoblot en utilisant Ab cMyc (figure 6). En plus du monomère (~ 100 kDa), une bande de protéine moléculaire de masse élevée de ~ 400 kDa a été détectée d&#39;une manière dépendante du temps, ce qui indique RyR2 N-terminale formation de tétramère 3. Notamment, tétramère était l&#39;espèce prédominante oligomériques, avec un dimère minimal et bandes trimères observées. Pour déterminer sa masse moléculaire apparente, l&#39;oligomère BT4L a été séparé à 4 - 15% gradient SDS-PAGE gels 3. Nous avons produit la masse / gel courbe standard de retard moléculaire en utilisant des normes de protéines avec une gamme de 30-460 kDa, et nous avons calculé l&#39;oligomère à être 358 kDa 15 (n = 4). Cette masse moléculaire apparente est compatible avec un tétramère BT4L disposé dans unla mode circulaire fermée plutôt que sous forme linéaire, comme prévu à partir de l&#39;agencement des quatre sous-unités dans le canal natif RyR2. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figure 1. Y2H Flowchart. Levure, co-transformé avec des appâts et des cibles plasmides, est sélectionné pour la croissance dans un milieu sans histidine et / ou testés pour β-Gal activité enzymatique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figure 2. Y2H suggère RyR2 extrémité N-terminale du domaine d&#39; auto-interaction. (A) Représentation schématique illustrant le (appât) RyR2 série de fragments de protéines humaines testées se chevauchent dans le système pour Y2H<html> interaction avec la construction AD4L RyR2 N-terminal (proie). Les résultats qualitatifs obtenus par filtre colonie-lift papier β-Gal tests sont indiqués dans les multiples &quot;+&quot; ou &quot;-&quot; pour une interaction négative des essais (B) liquide quantitative β-Gal normalisée par rapport à la commande positive (pVA3 code pour l&#39; ADN de GAL4-BD. la fusion avec la protéine p53; pTD1 code pour GAL4 AD fusion avec l&#39;antigène T de SV40). Modifié à partir de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> La figure 3. Co-IP diagramme de flux. Les cellules mammaliennes cotransfectées avec des plasmides X et Y, sont homogénéisés et un détergent solubilisé pour produire le lysat cellulaire utilisé dans le test de co-IP, suivi par SDS-PAGE et immunotransfert.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figure 4. Co-IP Indique RyR2 N-terminale du domaine d&#39; auto-interaction dans les cellules de mammifères. HEK293 cellules ont été co-transfectées pour la co-expression transitoire de cMyc-étiqueté (BT4L) et HA-tagged domaine (AD4L) RyR2 N-terminale ( résidus 1-906). AD4L a été immunoprécipité avec Ab HA de CHAPS solubilisées et dithiothréitol traités HEK293 lysat, alors que les essais négatifs de contrôle, co-IP ont été réalisées avec des non-immunitaire IgG de lapin. Les protéines immunoprécipitées ont été chauffés à 85 ° C pendant 5 min et résolus à 20 mA pendant 3 heures à 6% de gels SDS-PAGE distincts chargés de 1/10 ou 9/10 e des échantillons IP. Après transfert des protéines à 80 V pendant 2 heures sur polyvinyune membrane de difluorure de lidene, l&#39; analyse immuno - empreinte a été réalisée en utilisant (1: 1000 dilution) Ab HA (A) ou Ab cMyc (B), respectivement, suivie par la peroxydase de raifort conjugué IgG anti-souris (1: 10000 dilution) et la détection de chimioluminescence amplifiée (1 min exposition). Une aliquote de lysat cellulaire, 1/50 ème du volume traité dans des échantillons IP, a également été inclus pour servir comme étalon de masse moléculaire. Modifié à partir de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figure 5. Diagramme de reticulation. Des cellules de mammifères transfectées par le plasmide X, sont homogénéisés et soumis à une réaction avec du glutaraldéhyde dans l&#39;essai de réticulation, suivi par SDS-PAGE et immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figure 6. Cross-linking Indique RyR2 N-terminale Formation Domaine tétramère cellules HEK293 ont été transfectées pour l&#39; expression transitoire de cMyc-tagged domaine (BT4L) RyR2 N-terminale (résidus 1 - 906).. Homogénat cellulaire, traité avec l&#39;agent réducteur dithiothréitol, a été mis en incubation avec du glutaraldéhyde pour les points temporels indiqués. Les échantillons ont été chauffés à 85 ° C pendant 5 min et résolues par SDS-PAGE (gel à 6%) ​​à 20 mA pendant 3 h. Après transfert de la protéine à 80 V pendant 2 heures sur une membrane de difluorure de polyvinylidène, l&#39; analyse immuno - empreinte a été réalisée en utilisant (1: 1000 dilution) Ab cMyc, suivie par la peroxydase de raifort conjuguée anti-souris IgG (1:10.000 dilution) et la détection de chimioluminescence amélioré (1 min d&#39;exposition). Monomérique (M: ~ 100 kDa) et tétramère (T) forme sont indiquées par les flèches. Modifié à partir de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’oligomérisation du récepteur de la ryanodine, un canal ionique homo-tétramérique médiant la libération de Ca2+ à partir des réserves intracellulaires, est essentielle pour la contraction des muscles squelettiques et cardiaques. Ici, nous présentons des méthodes complémentaires in vivo et in vitro pour détecter l’auto-association des protéines et déterminer la stœchiométrie des homo-oligomères.

Approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

L'objectif général de ces trois techniques expérimentales complémentaires, à savoir le système deux-hybride chez la levure, la co-immunoprécipitation et le réticulation chimique, est d'évaluer les interactions entre protéines, en particulier l'auto-association, et de déterminer la composition stœchiométrique des homo-oligomères protéiques. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés dans le domaine des cardiopathies, telles que l'oligomérisation des récepteurs ultrasecrets, à l'origine des arythmies cardiaques et de la mort subite. Les principaux avantages de ces techniques résident dans leur criblage relativement haut débit, leur simplicité d'utilisation et la forte reproductibilité de leurs résultats, tout en nécessitant un équipement et des réactifs minimaux.Les implications de ces techniques s'étendent à la thérapie des maladies cardiaques arythmogènes, car elles permettent d'établir le mécanisme moléculaire d'action des médicaments antiarythmiques. En général, les personnes novices en co-immunoprécipitation éprouvent des difficultés, notamment en risquant de jeter les billes d'agarose liées aux protéines, qui sont très petites, lors du prélèvement du surnageant pendant les étapes de centrifugation. Dans cet essai de double hybride chez la levure, des cellules de levure en phase logarithmique moyenne sont utilisées pour la transformation.Récupérez les cellules par centrifugation, resuspendez chaque culot dans cinq millilitres d'eau stérile et mélangez les suspensions cellulaires. Centrifugez la suspension cellulaire. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez le culot de levure dans un millilitre d'acétate de lithium et de TE stériles, fraîchement préparés, à une concentration une fois. Les cellules de levure compétentes doivent être utilisées dans l'heure suivant leur préparation.Préparer les échantillons de plasmide en mélangeant l'ADN plasmidique appât et cible avec 100 microgrammes d'ADN témoin de testicules de hareng. Ajouter à chaque tube de 1,5 millilitre 100 microlitres de la suspension de levure compétente et 600 microlitres de solution d'acétate de lithium et de PEG à une fois, puis vortexer pendant environ 30 secondes. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes, sous agitation.Ajouter 80 microlitres de diméthylsulfoxyde et mélanger soigneusement par retournements doux. Effectuer un choc thermique de 15 minutes dans un bain-marie à 42 degrés Celsius, en mélangeant toutes les deux à trois minutes. Refroidir la suspension cellulaire sur de la glace pendant deux minutes, puis centrifuger pour récupérer les levures.Réhydrater chaque culot cellulaire dans 100 microlitres de tampon TE à une fois. Ensemencer les cellules sur des boîtes de milieu minimal SD approprié afin de maintenir une pression de sélection sur les plasmides d'appât et de cible. Incuber les boîtes retournées à 30 degrés Celsius pendant quatre à cinq jours. Les colonies de levure sont prêtes pour ce test lorsqu'elles atteignent un diamètre d'environ deux millimètres.Prélèvez 2,5 millilitres de solution de tampon Z et de X-gal fraîchement préparée et versez-les dans une plaque propre de 100 millimètres. Placez un papier filtre en cellulose dans la plaque. Disposez un nouveau papier filtre à la surface de la plaque contenant les colonies de levure à analyser. À l’aide de pinces, appuyez délicatement le papier filtre contre la plaque, puis laissez reposer environ cinq minutes afin que les colonies adhèrent. En portant des équipements de protection individuelle appropriés, soulevez délicatement le papier filtre et immergez-le dans un bain d'azote liquide pendant 30 secondes. Laissez décongeler le papier filtre congelé à température ambiante pendant deux minutes. Placez le papier filtre côté colonies vers le haut sur le papier filtre préalablement imbibé à l'intérieur de la boîte de 100 millimètres et incubez à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition de colonies bleues.Un jour avant la transfection, nourrissez les cellules HEK293 dans une boîte de Pétri de 100 millimètres, afin que les cellules atteignent une confluence de 60 à 70 pour cent le jour suivant. Incubez pendant 16 à 18 heures dans un incubateur humide. Le jour de la transfection, diluez 24 microgrammes d'ADN plasmidique avec 60 microlitres de chlorure de calcium 2,5 molaire et de l'eau stérile déionisée pour obtenir un volume total de 600 microlitres.Vortexer pour mélanger. Ajouter la solution d'ADN plasmatique et de calcium goutte à goutte dans un tube de 50 millilitres contenant 600 microlitres de solution saline tamponnée au HEPES 2X, en agitant constamment et vigoureusement par vortexage. Incuber 20 minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes d'ADN plasmatique au phosphate de calcium.Après une incubation de 20 minutes, vortexer brièvement, puis ajouter la solution goutte à goutte sur les cellules HEK293 afin de recouvrir toute la surface de la boîte de Pétri. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Après environ six heures, changer le milieu de croissance et replacer les cellules dans l'incubateur.24 heures après la transfection, récolter les cellules comme décrit dans le texte du protocole. Resuspendre le culot cellulaire dans 500 microlitres de tampon d'homogénéisation glacé et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre contenant des billes de verre. Utiliser une aiguille fine fixée à une seringue d'un millilitre pour homogénéiser les cellules sur glace.Avec le bouchon du tube fermé, percer le bouchon avec l'aiguille et disperser vigoureusement la suspension cellulaire à travers les billes de verre. Centrifuger à 1500 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d'éliminer les noyaux et les cellules non rompues. Conserver le surnageant, représentant la fraction post-nucléaire, pour une utilisation ultérieure dans des expériences de co-immunoprécipitation ou de réticulation.Pour commencer cette procédure, solubilisez la fraction subcellulaire post-nucléaire avec 0,5 pour cent de chaps et incubez pendant au moins deux heures à quatre degrés Celsius avec un mélange constant. Centrifugez à 20 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot avec le matériel insoluble. Conservez le surnageant.On appelle cela le lysat cellulaire. Préparez les billes d'agarose protéine A dans le tampon d'immunoprécipitation comme décrit dans le texte du protocole. Ajoutez un microgramme d'anticorps d'immunoprécipitation à un tube contenant de la protéine A.En tant que témoin négatif, ajoutez un microgramme d'IGG non immunitaire à l'autre tube contenant de la protéine A. Incubez pendant au moins deux heures à quatre degrés Celsius, avec un mélange constant. Récupérez les billes par centrifugation et éliminez soigneusement le surnageant à l'aide d'une pipette.Transférez 200 microlitres du lysat cellulaire dans chacun des deux tubes contenant l'anticorps et les billes de protéine A. Incubez pendant au moins deux heures à quatre degrés Celsius avec un mélange constant afin de permettre la liaison antigène-anticorps. Récupérez les billes et lavez-les avec 200 microlitres de tampon d'immunoprécipitation.Incuber pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec agitation. Après trois lavages, éliminer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 30 microlitres de tampon de charge des protéines sur les billes et centrifuger à 1500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Conserver le surnageant contenant l'échantillon de co-IP mentionné pour une analyse ultérieure par électrophorèse SDS-PAGE et immunoblotting. Pour effectuer la réticulation chimique, centrifuger la fraction subcellulaire post-nucléaire afin d'obtenir un culot d'agrégats protéiques. Conserver le surnageant et le diviser en huit aliquotes de 20 microlitres chacune.Ajouter 0,0025 % en volume par volume de glutaraldéhyde à un seul échantillon uniquement. Démarrer le chronomètre et laisser le glutaraldéhyde réagir à température ambiante pendant la durée indiquée. Arrêter la réaction du glutaraldéhyde au moment spécifié à l’aide d’hydrazine à 2 % en volume par volume et ajouter cinq microlitres de tampon de charge protéique 5X pour dénaturer les protéines.Le système deux-hybrides chez la levure a été utilisé pour analyser des constructions chevauchantes couvrant toute la longueur de la séquence peptidique du récepteur de la ryanodine, afin de détecter une interaction avec AD4L et le fragment terminal. Des tests colorimétriques à la bêta-galactosidase sur papier filtre par méthode de transfert de colonies ont produit des colonies de couleur bleue intense uniquement pour la paire BT4L/AD4L, indiquant que AD4L interagit avec lui-même. Des colonies de couleur bleue pâle ont été observées pour la paire BT8/AD4L, suggérant une association secondaire, plus faible, avec le domaine C-terminal extrême.Les résultats quantitatifs des dosages bêta-gal en milieu liquide ont indiqué une interaction forte entre BT4L et AD4L, équivalente en intensité à l'association connue entre la protéine P53, pVA3, et l'antigène T grand du SV40, pTD1. L'interaction entre BT8 et AD4L était nettement plus faible. Les résultats du test d'interaction deux-hybride chez la levure sont confirmés par des expériences de co-immunoprécipitation réalisées après l'expression transitoire d'AD4L marquée par une étiquette HA et de BT4L marquée par une étiquette cMyc dans une lignée cellulaire de mammifère.L'immunoprécipitation directe de l'AD4L marquée par un marqueur HA à l'aide d'un anticorps anti-HA a été observée, et la BT4L marquée par un marqueur cMyc n'a été récupérée que lors de l'immunoprécipitation anti-HA. Un réticulation chimique a été réalisée sur un homogénat cellulaire exprimant la BT4L marquée par un marqueur cMyc, suivie d'une électrophorèse SDS-PAGE et d'un immunoblotting à l'aide d'un anticorps dirigé contre cMyc. En plus du monomère de 100 kilodaltons, une bande protéique de masse moléculaire élevée d'environ 400 kilodaltons a été détectée de manière dépendante du temps, indiquant la formation d'un tétramère du récepteur de la ryanodine et du terminus.Lors de la transfection de cellules de mammifères par précipitation au phosphate de calcium, il est important de ne pas oublier d'agiter constamment et vigoureusement le tampon phosphate dans un grand tube afin d'assurer une aération efficace, tout en ajoutant très lentement la solution d'ADN plasmidique. Après avoir suivi ces procédures, d'autres méthodes comme la microscopie confocale en imagerie calcique peuvent être réalisées. Ces techniques devraient permettre de répondre à des questions supplémentaires, telles que la localisation et les propriétés de libération du calcium par les canaux récepteurs de la ryanodine dans des cellules vivantes.Après leur développement, ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans divers domaines de la signalisation cellulaire pour évaluer l'homooligomérisation des protéines, un processus biologique fondamental qui régule l'activité des facteurs de transcription, des enzymes, des canaux ioniques et des récepteurs.

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