Name: Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à laide dun Escherichia coli Système de transcription-traduction libre Cell- (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Découvrez l'incorporation spécifique d'acides aminés non canoniques dans des protéines modèles grâce à un système de transcription-traduction sans cellule Escherichia coli. Cette méthode permet d'étudier la structure et la fonction des protéines.

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E.G. Worst et A. Ott reconnaissent le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au sein du centre de recherche collaboratif SFB 1027 ainsi que de l’Université de la Sarre. E.G. Worst, A. Ott et V. Noireaux reconnaissent également l’aide financière de l’Organisation du programme scientifique Human Frontiers (HFSPO). Les auteurs remercient Tobias Baumann et Stefan Oehm (Institut de chimie, Technische Universität Berlin) pour leur lecture critique.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un facile à utiliser le système d&#39;expression sans cellule comme une stratégie viable au résidu spécifiquement incorporer NCAAs en protéines, est présenté. A cet effet, l&#39;extrait brut est complété par de l&#39;ADN codant vecteur pour la protéine d&#39;intérêt, le tampon d&#39;énergie et les acides aminés correspondants. A noter que le volume de l&#39; aliquote de l&#39; extrait brut dépend de l&#39;extrait brut de la concentration en protéines 34. L&#39;efficacité d&#39;expression acellulaire est optimisée en fonction de la concentration de la construction d&#39;ADN de vecteur. Les volumes des composants tampons d&#39;énergie varie en fonction de la concentration optimale de Mg et K-glutamate afin de permettre à des rendements élevés de la protéine exprimée modèle acellulaire. Une évaluation préliminaire de l&#39;expérience d&#39;incorporation peut être obtenue en effectuant une SDS-PAGE du milieu réactionnel acellulaire non purifié. Pour une analyse plus détaillée, la spectroscopie de masse HPLC-ESI est proposé comme un moyen pour vérifier complète, incor spécifique de résidusporation de la NCAA. Comme préparation pour ces derniers, les systèmes de colonnes de spin sont utilisés pour permettre His-tag purification et échange de tampon avec les petits volumes que nous utilisons dans ce protocole. Y compris la spectroscopie de masse HPLC-ESI le protocole entier peut être effectuée dans les 2 jours. Il ne comprend pas les étapes particulièrement critiques. Cependant, les optimisations de concentration de Mg et K-glutamate, ainsi que du vecteur ADN sont cruciales afin d&#39;exprimer des rendements élevés de la protéine modèle. L&#39;utilisation du vecteur d&#39;expression très efficace pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 est fortement recommandé. Elution de marquage His protéines est généralement due à une forte concentration d&#39;imidazole (&gt; 150 mM) et d&#39; autres sels tels que NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mM) ou NaCl (&gt; 50 mM) qui génèrent un bruit de fond élevé dans la masse analyse spectroscopique 49 . L&#39;échange de ces tampons d&#39;élution avec un tampon de stockage de protéine appropriée stabilise le modèle proteet considérablement réduit le bruit de fond lors de l&#39;analyse par spectroscopie de masse. Par conséquent, Can remplace Arg à six positions dans la protéine modèle. Dans le système d&#39;expression, pas de résidus Arg peuvent être détectés. Cela simplifie l&#39;incorporation spécifique de résidus d&#39;analogues Arg par rapport à d&#39; autres systèmes d&#39;expression qui nécessitent de nouvelles stratégies d&#39;épuisement 29,30. L&#39;approche sans cellule présentée contourne les limites inhérentes aux approches in vivo qui sont dues à la toxicité Can ou une forte dépendance à l&#39; égard séquence d&#39;ARNm dans les stratégies 24,31 de production de protéines unique. Contrairement à l&#39;emploi dans le système in vitro, le clivage in vivo de Can à homosérine et hydroxyguanidine ne se produit 31. Cependant, le système acellulaire conserve une quantité suffisante de Lys en concurrence avec des analogues tels que Hyl. L&#39;analyse par HPLC-ESI spectrométrie de masse montre que la protéine modèle contient à la fois, le canonical ainsi que l&#39;analogue non canonique dans des proportions différentes. L&#39;incorporation spécifique du résidu de Lys est possible en général, mais pour une substitution complète, de nouvelles stratégies d&#39;épuisement, ou aaRS spécialement conçus et ARNt optimisé pour la reconnaissance de NCAAs doivent être développées. Nous avons obtenu d&#39;excellents rendements exprimés protéines modèles exempts de cellules, modifiées en ajoutant la NCAA à la même concentration que ceux canoniques. L&#39;efficacité d&#39;incorporation dépend de la nature de la ncaa à incorporer. Même les rendements plus élevés pourraient encore être réalisables en optimisant la concentration du ncaa. Les résultats présentés démontrent l&#39;applicabilité du système utilisé pour l&#39;incorporation spécifique de résidus de NCAAs aussi longtemps qu&#39;ils sont acceptés par le système de translation endogène canonique. Pour l&#39;incorporation spécifique de résidus de NCAAs spécifiques, un des besoins supplémentaires pour vérifier si les résidus de la cAA perturba analogueb le système d&#39;expression. Systèmes de transcription-traduction exempts de cellules peuvent être conçus à partir de différents organismes pour répondre aux différentes demandes 54. Le tout E. coli transcription-traduction machineries du système sans cellule présentée ici permettent l&#39;utilisation de bactériophages et E. promoteurs coli, et ils peuvent agir en parallèle ou consécutivement en cascades 55. L&#39;applicabilité générale et la facilité d&#39;utilisation font de la méthode, un outil puissant pour la recherche dans la toxicité des acides aminés et de l&#39;application thérapeutique.

Le code génétique est universel à la biosphère. Il code pour un ensemble de 20 acides aminés canoniques, qui est parfois prolongé par sélénocystéine 1 ou 2 pyrrolysine. Il est ribosome qui se traduit par le code génétique à l&#39;aide d&#39;ARNt dans des chaînes d&#39;acides aminés qui se replient en protéines. Les groupes fonctionnels des acides aminés canoniques, en combinaison avec des modifications post - traductionnelles, contribuent à une gamme exceptionnellement large de la fonction de la protéine 3,4. En principe, les limitations fonctionnelles dues à l&#39;ensemble limité d&#39;acides aminés canoniques peuvent être surmontés en incorporant en outre, des acides aminés non canoniques (NCAAs) qui permettent de nouvelles chimies et de nouvelles fonctionnalités 3,4. Il existe deux approches complémentaires pour l&#39;incorporation de NCAAs: le site- ou l&#39;incorporation spécifique de résidus. La première méthode implique des difficultés techniques considérables, puisque l&#39;ensemble canonique de aminoacyl-ARNt-synthetases (RAA) et ARNt doivent être élargis par une paire aaRS-ARNt orthogonal qui ne doit pas interagir avec la machinerie de traduction endogène. Sur la base de l&#39;ingénierie minutieuse, cette approche intègre les NCAAs que des mutations ponctuelles au niveau des sites de protéines désirées. Incorporation de NCAAs spécifique au site est génétiquement codé par un codon qui ne sont pas affectés à un acide aminé canonique (CAA), généralement un codon stop 5-9. Cette méthode implique des changements dans la fonction à un site donné , plutôt que sur l&#39;ensemble de la protéine 10-13. En revanche, l&#39;incorporation spécifique au résidu repose sur la reconnaissance erronée de l&#39;aminoacide non canonique par la machinerie de traduction canonique. L&#39;incorporation se produit en raison de l&#39;absence de spécificité de substrat des aaRS. L&#39;incorporation spécifique de résidus de NCAAs, construit sur ​​les travaux de Cohen et ses collègues 14, a conduit à d&#39;importantes applications 3,10, entre les bio-orthogonale étiquetage 15-17 de protéinesou élucidation de la structure des protéines en cristallographie aux rayons X 18. Comme aaRS naturels préfèrent généralement leur acide aminé apparenté sur une ncaa isostructurales, efficace in vivo incorporation spécifique de résidus nécessite généralement un hôte d&#39;expression auxotrophe pas capable de synthétiser l&#39;analogue canonique de la NCAA. Les cellules hôtes sont cultivées dans un milieu de croissance qui fournit seulement une faible concentration du PQA analogue. Son épuisement en combinaison avec la supplémentation consécutive avec la NCAA oblige l&#39;hôte d&#39;expression pour incorporer la NCAA dans la protéine de modèle à de multiples sites canoniquement prescrits. Contrairement à l&#39;approche spécifique du site, ce qui a généralement un impact profond sur la structure de la protéine entière, conduisant à considérablement modifié les propriétés physiques et chimiques des protéines 19,20. Cependant, la plupart des NCAAs sont des inhibiteurs de croissance de l&#39;hôte d&#39;expression 3, car elles sont incorporées dans beaucoup d&#39; autres proteins en plus de ceux d&#39;intérêt au cours de l&#39;expression du gène recombinant. Cela limite clairement l&#39;approche in vivo. L&#39;incorporation in vivo d&#39;acides aminés qui sont toxiques ou qui ont une forte influence sur la structure des protéines demeure particulièrement difficile. Cependant, ces molécules sont parmi les plus prometteuses pour concevoir des protéines avec des fonctions extraordinaires. Un exemple est la, noncanonical, naturel L-canavanine toxiques (Can), un analogue de L-arginine (Arg). Elle affecte et bloque Arg voies réactionnelles réglementaires et catalytiques associés, et sa présence dans la cellule vivante peut entraîner la mort immédiate 3,21-23. Son incorporation dans les protéines à des positions d&#39;arginine peut réduire la stabilité des protéines 21-23. En raison de la toxicité résultant, l&#39; expression de canavanine contenant des protéines dans Escherichia coli (E. coli) et d&#39; autres hôtes d&#39;expression commune reste un défi. Pour ces raisons, complète in vivo incorporation de Can à toutes les positions Arg a été confirmée de manière appropriée une seule fois 24, en utilisant un système de production unique protéine élaborée. Cependant, Can a été proposée comme un agent anti-cancer 25-27, et comme un stimulateur pour les maladies auto - immunes chez les humains 28. En outre, il fait l&#39; objet de diverses études sur ses propriétés anti-métabolique, antibactériens, antifongiques et antivirales 25. Ces propriétés soulèvent une demande pour efficace et facile à exécuter des méthodes pour exprimer Peut contenant des protéines pour pharmacie, médicaux et des études fonctionnelles. Bien que de nombreux problèmes qui sont liés à la production in vivo peuvent être contournés en utilisant des systèmes d&#39;expression sans cellules, dans les approches in vitro spécifiques de résidus ont seulement été mal exploré. L&#39;incorporation sans cellules spécifiques reste d&#39;un L-tryptophane analogique 29 et multiple NCAAs 30 ont été rapportés. Ces méthodes sont basées sur la très efficpolymérase ient T7 RNA. La T7 ARN polymérase du bactériophage comporte en forme de transcription, ce qui réduit la fonctionnalité génétique par rapport à la transcription endogène. L&#39;incorporation spécifique du résidu complet de Can dans une protéine de modèle à toutes les positions Arg a été récemment rapporté 31, en ​​utilisant un système d&#39;expression sans cellule 32. Une légère modification du même système a permis l&#39; incorporation spécifique du site de différents analogues de pyrrolysine dans une protéine modèle via codon stop suppression 33. Le système exempt de cellules utilisé 31 - 33 est basé sur un ensemble E. coli système de transcription-traduction. Néanmoins, il permet l&#39; expression des protéines aussi efficacement que dans les systèmes de bactériophage courant (0,5 à 1 mg / ml de protéine recombinante) 32 tout en conservant une grande partie de la modularité originale de transcription-traduction. Dans ce travail, un protocole détaillé est fourni sur la manière dont le résidincorporation spécifique de NCAAs-ue peut être réalisée en utilisant tout cela E. système sans cellule coli 32. En outre, de nouvelles mesures pour préparer les protéines exprimées pour une évaluation appropriée par spectroscopie de masse HPLC-ESI sont proposées. Pour développer les propriétés de ce système sans cellule, ce travail ne se réfère pas seulement à l&#39;incorporation publiée de Can 31 , mais présente également de nouvelles données relatives à la L-lysine analogique L-hydroxy-lysine noncanonical. Le protocole suivant pour l&#39;incorporation spécifique du résidu d&#39;NCAAs est une adaptation d&#39;un protocole publié récemment dans JoVE 34. Le dernier protocole décrit comment effectuer l&#39;expression sans cellule très efficace avec des acides aminés standard. En outre, il présente la préparation de l&#39;extrait exempt de cellules brut, la solution d&#39;acide aminé, la solution d&#39;énergie de stock et le tampon de l&#39;énergie utilisée dans cette approche. Le protocole qui suit se concentre sur les étapes modifiées par rapport à la précédente protocol afin de permettre l&#39;incorporation spécifique de résidus de NCAAs. pipettes étalonnées, conseils faible liaison pipettes et tubes micro-centrifugeuse sont recommandées pour la préparation. Dans ce qui suit, les abréviations IUPAC pour les acides aminés sont utilisés.

<table><tbody><tr><td>Lunettes de protection</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Gants en nitrile (taille S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>Numéros de catalogue autres tailles : Z768979 pour M, Z768987 pour L et Z768995 pour XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hambourg, Allemagne</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Microspatule 80104140</td><td></td><td></td>Suisse</tr><tr><td>(L 6 5/8 po, acier inoxydable, diamètre de la tige 0,09 po)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>C9758</td><td>Toxicité aiguë : porter des lunettes de protection, un masque anti-poussière, des gants de protection</td></tr><tr><td>Hydroxylysine (mélange racémique)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Gants cryogéniques (taille S, résistants à l’eau)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>Z183490</td><td>Autres tailles : Z183512 pour M, Z183520 pour L et Z183539 pour XL</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Allemagne</td><td>BR1401801</td><td>Pour la préparation maison de solutions mères d’acides aminés, suivez ce protocole35 et utilisez le kit d’acides aminés solides LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cystéine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) et L-lysine (L5501-5G)&nbsp ; (tous de Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, États-Unis</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, États-Unis</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, États-Unis</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>ARNt (à partir de E. coli, taille de l’emballage 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>Le numéro de catalogue pour un emballage de 500 mg est 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (à partir de levure</td>)<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide folinique</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>Plasmide #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20 % de gels de tris-glycine préfabriqués (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 rangées)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig ;-Bieberau / Rodau, Allemagne</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de course SDS (10 x concentré, 5 000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig ;-Bieberau / Rodau, Allemagne</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de chargement SDS (2 x concentré, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig ;-Bieberau / Rodau, Allemagne</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur protéique non coloré, large gamme (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1060091011</td><td>Toxique par inhalation, par contact avec la peau et en cas d’ingestion : porter des gants de protection et travailler sous une hotte</td></tr><tr><td>Acide acétique (99,8 %)</td><td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep kit</td><td>Zymo Research Europe, Fribourg, Allemagne</td><td>P2002</td><td>Produit également distribué par Zymo Research Corporation, Irvine, États-Unis.</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol, 99 %</td> <td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 mini spin columns</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Allemagne</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur 5301</td><td>Eppendorf, Hambourg, Allemagne</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, États-Unis</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, États-Unis</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de battage de billes (microflacons en polypropylène)</td><td>Biospec, Bartlesville, États-Unis</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Perles, 0.1&nbsp; mm dia.</td><td>Biospec, Bartlesville, États-Unis</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli souche</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA protein assay Kit</td><td>Bio-Rad, M&uuml ; nchen, Allemagne</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes, 1.5&nbsp ; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin</td><td>Bio-Rad, M&uuml ; nchen, Allemagne</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Plaques inférieures optiques Nunc 384 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, États-Unis</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Solution dibasique de phosphate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Solution monobasique de phosphate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-Unis</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp ; Bouteille centrifuge L</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp ; L Erlenmeyer flask</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP centrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>Ou centrifugeuse équivalente capable de centrifuger des bouteilles de 1 L.</td></tr><tr><td>Agitateur orbital Forma 480</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>Ou un agitateur équivalent capable de secouer la poitrine de la taille d’une poitrine 6 x 4 L .</td></tr><tr><td>Rotor JLA-8.1000</td><td>Beckman-Coulter, Brea, États-Unis</td><td>363688</td><td>Ou un rotor équivalent de 5 000 x g pour la centrifugeuse ci-dessus, capable de centrifuger des bouteilles de 1 L.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>Ou centrifugeuse équivalente capable de centrifuger des tubes réactionnels de 2 ml.</td></tr><tr><td>Bloc chauffant HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Allemagne</td><td>24465</td><td>Ou bloc chauffant équivalent capable de chauffer des échantillons dans des tubes à réaction jusqu’à 100 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf MiniSpin</td><td>Eppendorf, Hambourg, Allemagne</td><td>5452000018</td><td>Ou centrifugeuse équivalente capable de centrifuger des tubes de réaction de 2 ml.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (4 mm de diamètre de vibrateur orbital, 0 - 2 500 tr/min)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>Z654760</td><td>Ou vortex équivalent.</td></tr><tr><td>Scotsman AF103 machine à floconner à glace</td><td>K&auml ; lte-Berlin, Berlin, Allemagne</td><td>AF103</td><td>Ou une machine à floconneuse de glace équivalente.</td></tr><tr><td>Mini incubateur numérique MyTemp</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>Ou incubateur équivalent capable de chauffer des échantillons à 29 °C.</td></tr><tr><td>Cellule / chambre d’électrophorèse EcoCell</td><td>nommée Elektrophorese, Gro&szlig ;-Bieberau / Rodau, Allemagne</td><td>AN12005</td><td>Ou une chambre d’électrophorèse équivalente capable d’effectuer une électrophorèse sur gel vertical avec les gels préfabriqués ci-dessus ou d’autres gels utilisés.</td></tr><tr><td>Alimentation Power-phor pour cellule / chambre d’électrophorèse</td><td>Anommé Elektrophorese, Gro&szlig ;-Bieberau / Rodau, Allemagne</td><td>AN12001</td><td>Ou une alimentation équivalente capable d’alimenter au-dessus de la cellule / chambre d’électrophorèse utilisée avec puissance</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td><td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>613-5278</td><td>Ou des micropipettes équivalentes permettant de pipeter des volumes similaires avec la même précision</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>613-5279</td><td>Ou des micropipettes équivalentes permettant de pipeter des volumes similaires avec la même précision</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0,1 - 10 & micro ; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171101</td><td>Ou des pointes de pipette équivalentes à faible liaison permettant de pipeter des volumes similaires avec la même précision</td></tr><tr><td>Pointes Pipetman Diamond D200ST (2 - 200 &micro ; l)</td><td>Gilson, Middleton, États-Unis</td><td>F171301</td><td>Ou des pointes de pipette équivalentes à faible liaison permettant de pipeter des volumes similaires avec la même précision</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1 000 € ; et micro ; l)</td><td>Gilson, Middleton, États-Unis</td><td>F171501</td><td>Ou des pointes de pipette équivalentes à faible liaison permettant de pipeter des volumes similaires avec la même précision</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 ml avec bouchons à vis (stériles)</td><td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 ml avec bouchons à vis (stériles)</td><td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène de 14 ml (fond rond, bouchon d’aération à deux positions, stérile)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Discovery BIO Wide Pore C5 Colonne HPLC (3 & micro ; m taille des particules, L x D.I. 10 cm x 2,1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Machine HPLC Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>6500 Series Precision-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne</td><td>415-101</td><td>Ou un lecteur de microplaques équivalent capable de mesurer la fluorescence de la protéine modèle exprimée</td></tr><tr><td>Hanna Checker PH-mètre</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>Z351091&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Additif éluant à l’acide formique pour LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; escherichia coli</em&gt; système de transcription-traduction libre cell-

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

L&#39;ensemble canonique des acides aminés conduit à un niveau exceptionnellement large éventail de fonctionnalités de protéines. Néanmoins, l&#39;ensemble des résidus impose encore des limitations sur les applications de protéines potentielles. L&#39;incorporation d&#39;acides aminés non canoniques peut élargir ce périmètre. Il existe deux approches complémentaires pour l&#39;incorporation d&#39;acides aminés non canoniques. Pour l&#39;incorporation spécifique du site, en plus des mécanismes endogènes de translation canoniques, une paire aminoacyl-ARNt synthétase-ARNt orthogonal doit être prévu qui ne réagit pas avec ceux canoniques. Par conséquent, un codon qui ne soit pas affecté à un acide aminé canonique, habituellement un codon d&#39;arrêt est également nécessaire. Cette expansion du code génétique permet l&#39;incorporation d&#39;un aminoacide non canonique à un seul site donné au sein de la protéine. Le travail présenté ici décrit l&#39;incorporation spécifique de résidus où le code génétique est réaffecté au sein du système de traduction endogène. Le mécanisme de traduction d&#39;unccepts l&#39;acide aminé noncanonical comme un substitut pour l&#39; incorporer à des endroits canoniquement prescrits, à savoir, toutes les occurrences d&#39;un acide aminé dans la protéine canonique sont remplacées par une noncanonical. L&#39;incorporation d&#39;acides aminés non canoniques peuvent modifier la structure des protéines, ce qui provoque des propriétés physiques et chimiques considérablement modifiés. Non canoniques des analogues d&#39;acides aminés agissent souvent comme des inhibiteurs de la croissance cellulaire pour les hôtes d&#39;expression , car ils modifient les protéines endogènes, ce qui limite la production de protéines in vivo. In vivo incorporation d&#39;acides aminés non canoniques toxiques dans des protéines demeure particulièrement difficile. Ici, une approche sans cellule pour un remplacement complet de L-arginine par l&#39;acide aminé L-canavanine noncanonical est présenté. Elle contourne les difficultés inhérentes à l&#39;expression in vivo. En outre, un protocole pour préparer des protéines cibles pour l&#39;analyse spectrale de masse est inclus. Il est montré que la L-lysine peut être remplacée par la L-hydroxy-lysine,mais avec une efficacité moindre. En principe, tout analogue d&#39;aminoacide non canonique peut être incorporé en utilisant la méthode présentée tant que la endogène in vitro système de traduction reconnaît.

Ce protocole guide à travers l&#39;incorporation spécifique du résidu exempt de cellules de NCAAs en protéines modèles. Il propose SDS-PAGE pour une évaluation préliminaire de l&#39;expérience d&#39;incorporation et d&#39;autres mesures pour préparer les protéines modèles pour une HPLC-ESI analyse spectroscopique de masse appropriée. Ici, des résultats représentatifs de l&#39;incorporation sans cellules spécifiques résidu de l&#39;analogue Arg Can, ainsi que la Lys analogique L-hydroxy-lysine (Hyl) sont présentés. Les différentes solutions d&#39;acides aminés, le tampon d&#39;énergie, le codage de l&#39;ADN vecteur pour la protéine de modèle et des réactions sans cellules sont préparées comme décrit ci-dessus. La réaction sans cellule référence est fournie avec la solution d&#39;acides aminés constituée des 20 CAAS. Pour chaque expérience, une réaction négative sans cellule est fournie avec la solution d&#39;acide aminé qui n&#39;a pas l&#39;analogique canonique de la NCAA en question. Pour chaque approche, une réaction sans cellule exprime la protéine modèle en présence de la solution d&#39;acides aminés, où le cAA est substitué par l&#39;analogue non canonique. His-tag purification, l&#39;échange de tampon et HPLC-ESI analyse spectrométrique de masse sont effectuées selon le protocole décrit ci-dessus. La protéine de modèle est le C-terminal marqué par His deGFP 32, une version tronquée de 53 EGFP. Sa séquence d&#39;acides aminés à une lettre peut être trouvée dans (Matériau supplémentaire 2). Cette protéine modèle contient 6 Arg et 18 positions Lys, respectivement. Le vecteur d&#39;expression est pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Dans le cas de l&#39;incorporation complète de la NCAA, on peut supposer que la réaction de contrôle négatif ne se prononce pas deGFP, puisque l&#39;un des 20 CaaS est manquant. Contrairement, deGFP doit être détectable dans les deux autres réactions: celle native dans le référence réaction exempt de cellules et la protéine modifiée dans la réaction sans cellule qui est fourni avec la NCAA. La figure 1A montre l&#39;évaluation préliminaire SDS-PAGE de l&#39;expérience d&#39;incorporation Can. La réaction cellulaire sans référence a le niveau d&#39;expression de deGFP plus haut. Dans la réaction acellulaire qui est pourvue de canettes, deGFP est exprimé à des concentrations légèrement plus faible. Aucune expression de deGFP peut être détectée dans le témoin négatif. Ce résultat SDS-PAGE est une bonne indication pour une intégration réussie de Can dans le deGFP de protéine cible. Pour prouver l&#39;incorporation complète de l&#39; hypothèse peut dans deGFP, les deux protéines modèles purifiés, visualisées sur la figure 1B, sont analysés par spectrométrie de masse HPLC-ESI. La figure 1C montre les spectres de masse déconvoluée des molécules de deGFP purifiés. La masse déconvoluée de degF<html> P qui est exprimé dans la réaction sans cellule référence est 26,192.8 Da. Pour deGFP exprimé dans le Can contenant la réaction sans cellule une masse de 26202,5 ​​Da apparaît. Les masses attendues pour le deGFP6Arg natif et le deGFP6Can modifié avec Arg étant entièrement remplacés par Can sont 26.193 Da et 26.204 Da, respectivement. La différence de masse de 1,5 Da pour deGFP6Can est dans l&#39;erreur de déconvolution du spectre. Ainsi, l&#39;intégration complète de Can en deGFP à tous les 6 positions Arg est confirmée. Les deux pics d&#39;intensité réduite correspondent à la deGFP6Arg native et deGFP6Can modifiés qui n&#39;a pas atteint leur fluorophore mature. Le fluorophore est généré de façon autocatalytique par élimination d&#39;une molécule H 2 O, suivie par une oxydation. Cela conduit à une augmentation de la masse de 20 Da si ce processus ne se déroule pas. pg &quot;/&gt; Figure 1. SDS-PAGE évaluation de l&#39;expérience peut l&#39; incorporation et la spectroscopie de masse HPLC-ESI des exprimés et purifiés de molécules deGFP sans cellules. (A) L&#39; évaluation préliminaire de l&#39;expérience peut l&#39; incorporation en utilisant SDS-PAGE. De gauche à droite: norme de protéines, la réaction sans cellule référence, contrôle négatif et de réaction sans cellule fournissant Can au lieu de Arg. (B) SDS-PAGE après His-tag purification et échange de tampon des molécules deGFP exprimées. De gauche à droite: standard Protein, deGFP purifiée à partir de la réaction de référence, purifié deGFP de la réaction de Can contenant. (C) Confirmation de la pleine intégration de Can par spectroscopie de masse HPLC-ESI. Les masses attendus du deGFP natif et le deGFP modifié avec Arg entièrement remplacée par Can sont 26.193 Da et 26.204 Da, respectivement. Chaque spectre est normalisé à son intensité maximale (chiffres). Les positions des pics sont indiquésDa. Pour des fins de visualisation, les pistes de gel sont extraites des images de gel, réunis, sont convertis en format échelle de gris, la taille est optimisée et le contraste ainsi que la luminosité sont améliorées. Pistes de gel originales sont présentées dans Matériel supplémentaire 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> La figure 2A montre l&#39;évaluation préliminaire SDS-PAGE de l&#39;expérience d&#39;incorporation Hyl. Dans la réaction acellulaire qui est munie Hyl, deGFP est exprimé. Contrairement à la première expérience, une faible bande de deGFP peut être observée dans la réaction témoin négatif. Cela peut être dû à des résidus Lys dans les réactions sans cellules. Cela permet une expression de deGFP faible dans la réaction de contrôle négatif, où ni Lys ni Hyl sont ajoutés. Pour H<html> La spectroscopie de masse API-ESI, les molécules deGFP de la réaction exempt de cellules munies Hyl sont purifiés et le tampon est échangé (figure 2B). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Figure 2. Évaluation SDS-PAGE de l&#39;expérience d&#39;incorporation Hyl (A) De gauche à droite:. Réaction sans cellule témoin négatif, la réaction sans cellule contenant Hyl et le niveau de la protéine. (B) SDS-PAGE après His-tag purification et échange de tampon des molécules deGFP exprimées. De gauche à droite: Purifié deGFP du Hyl contenant la réaction et le niveau de la protéine. Pour des fins de visualisation, les pistes de gel sont extraites des images de gel, réunis, sont convertis en format échelle de gris, la taille est optimisée et le contraste ainsi que la luminosité sont améliorées. pistes de gel originales sont présentées dans Matériel supplémentaire 3.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. La figure 3 représente le spectre de masse des molécules d&#39;déconvoluée deGFP purifié. La figure 3A confirme l&#39;hypothèse de résidus Lys déjà présents dans les réactions sans cellules. Le pic prédominant du spectre correspond à la native (masse attendue: 26193 Da) deGFP. Encore une fois, les molécules deGFP d&#39;un 20 Da supérieur de masse qui ne développent leur fluorophore peuvent être détectés. Les résidus Lys sont préférentiellement chargés sur l&#39;ARNt Lys en conduisant à un niveau d&#39;expression élevé des deGFP18Lys indigènes lysyl-ARNt-synthétase. La différence de masse entre Hyl et Lys est de 16 Da. Grâce à la présence de Hyl qui est en concurrence avec les résidus Lys toutes les espèces possibles sont générés deGFP (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., + deGFP16Hyl 2Lys) (figure 3B). Il est vrai que le pic de deGFP1Hyl + 17Lys chevauche le sommet de la deGFP native qui ne produit pas de son fluorophore (figure 3A) et la masse de certains pics diffère de plus de 2 Da de la masse attendue. Ces différences de masse peuvent être attribués à un bruit élevé en raison des faibles quantités de l&#39;espèce deGFP. Cependant, Hyl est généralement constituée par le système acellulaire. D&#39;autres améliorations ont à faire pour supprimer les résidus Lys dans les réactions sans cellules. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Figure 3. HPLC-ESI spectroscopie de masse des molécules d&#39;deGFP purifiées de la réaction sans cellules contenant Hyl (A) Les deGFP18Lys indigènes est principalement détectée (masses attendues: avec fluorophore 26.193 Da, sans fluorophore matures 26.213 Da). (B)Grossissement révèle l&#39;existence de toutes les espèces possibles de deGFP (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Leurs masses sont attendues 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Le spectre est normalisé à son intensité maximale (chiffres). Les positions des pics sont indiquées dans Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Supplemental modèle de calcul 1. Matériel. Dans la section 2, la préparation du mélange maître tampon d&#39;énergie est illustrée en utilisant aliquotes brut extrait de 30 ul et optimale MG- et concentrations K-glutamate de respectivement 3 mM et 30 mM. Cet exemple conduit à un volume de mélange maître qui donne 3 fractions aliquotes de tampon d&#39;énergie. Dans section 3, la préparation de la réaction sans cellule est illustré à l&#39; aide d&#39; une solution à 90 nM d&#39; ADN stock conduisant à une concentration d&#39;ADN de vecteur optimal de 10 nM dans la réaction sans cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a> Pour une traçabilité appropriée, l&#39;utilisation du modèle de calcul est illustré par l&#39;insertion de ces valeurs typiques qui diffèrent de l&#39;exemple ci-dessus: le volume brut extrait: 28 pi, optimal Mg-glutamate: 2 mM, optimal K-glutamate: 40 mM, nombre des aliquotes tampons souhaitées: 100, concentration de vecteur optimal en réaction exempt de cellules: 8 nM, vecteur solution stock d&#39;ADN: 150 nM. Entrez d&#39;abord 28 pi que le volume d&#39;extrait brut dans le champ d&#39;orange de la première section de modèle. Ensuite, entrez dans la seconde section de modèle 2 mM und 40 mM de Mg comme optimale et les concentrations de K-glutamate dans les champs oranges. En tenant compte de la valeur optimale de K et Mg-concentration, la composition d&#39;un tampon d&#39;énergie de 15 ul, ainsi qu&#39;un correspondant, ajusté aliquote de 16 ul est calculée. Ci-dessous, en conséquence entrer 100 comme nombre souhaité d&#39;aliquotes de tampon d&#39;énergie (16 pi). Le modèle adapte les volumes des différents composants du tampon pour le mélange maître de 1700 pi comme suit: 204 pi de solution mère 100 mM Mg-glutamate, 136 pi de solution de stock 3 M K-glutamate, 728.73 ul de 14x solution d&#39;énergie, 510 pi de 40% de PEG-8000 et 121.27 ul stérile ddH 2 O. Enfin, dans la troisième section de modèle, entrez 8 nM et 150 nM comme concentration de vecteur optimal dans la réaction sans cellule et respectivement, ADN vecteur concentration de la solution de stock. Le modèle adapte les volumes des différents composants qui doivent être ajoutés aux 28 ul d&#39;extrait brut pour finaliser la préparation d&#39;un 90 piréaction acellulaire comme suit: 15 ul de tampon d&#39;énergie, 15 pl d&#39;une des solutions d&#39;acides aminés composition différente 3, 4,80 ul de solution d&#39;ADN de vecteur (150 nm) et 27,20 pi de ddH stérile 2 O. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Matériel supplémentaire 2. Une lettre séquence d&#39;acides aminés de la protéine modèle deGFP. Cette protéine modèle contient 6 Arg et 18 positions Lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Matériel supplémentaire 3. longueur et pistes de gel non modifiées qui correspondent aux images de gel présenté pleine figure 1 et 2. Les voies de gel présentées dans chaque individu s<html> ubfigure sont extraits du même gel de polyacrylamide-SDS. Dans la figure 1 et 2 ces voies ont été réunies à des fins de présentation. Les poids moléculaires des bandes de protéines standards sont indiquées à côté des chiffres. (A.1) des pistes de gel de la figure 1A entières papillotées. De gauche à droite: norme de protéines, la réaction sans cellule référence, contrôle négatif et de réaction sans cellule fournissant Can au lieu de Arg. (A.2) des pistes de gel de la figure 1B entières papillotées. De gauche à droite: standard Protein, deGFP purifiée à partir de la réaction de référence, purifié deGFP de la réaction de Can contenant. (B.1) des pistes de gel de la figure 2A entières papillotées. De gauche à droite: réaction sans cellule témoin négatif, la réaction sans cellule contenant Hyl et le niveau de la protéine. (B.2) des pistes de gel de entières papillotées figure 2B. De gauche à droite: Purifié deGFP du Hyl contenant la réaction et le niveau de la protéine.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Un protocole d’expression acellulaire facile à utiliser pour l’incorporation spécifique de résidus d’analogues d’acides aminés non canoniques dans les protéines, y compris l’analyse en aval, est présenté pour des études médicales, pharmaceutiques, structurelles et fonctionnelles.

Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Système de transcription-traduction libre Cell-

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

L'objectif général de cette procédure est d'incorporer de manière spécifique à chaque résidu des analogues d'acides aminés non canoniques dans des protéines modèles à l'aide d'un système d'expression in vitro et de fournir une analyse en aval. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la pharmacologie médicale et de la biologie structurale, notamment concernant le rôle des acides aminés non canoniques dans la structure des protéines. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'en l'absence d'un hôte vivant, des acides aminés toxiques peuvent être incorporés dans des protéines modèles. Pour commencer l'expérience, préparez des solutions mères complètes des 20 acides aminés canoniques, ou AAC, et de la solution mère d'acide aminé non canonique, ou AANC, préparée précédemment, à température ambiante. Une fois les solutions décongelées, vortexez-les fréquemment pour redissoudre les acides aminés précipités et placez-les sur glace. Ensuite, transférez 1,4 millilitre d'eau doublement distillée stérile dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et placez-le sur glace. Ajoutez 175 microlitres de chaque solution mère d'acide aminé, un par un, en vortexant soigneusement le tube après chaque ajout, puis replacez la solution sur glace. Une fois tous les acides aminés ajoutés, vortexez soigneusement le tube. Incubez le tube jusqu'à ce que la solution soit aussi limpide que possible. Répartissez la solution mère d'acides aminés en trois volumes égaux de 1,35 millilitre dans des tubes réactionnels de 1,5 ml et conservez-les sur glace. Ajoutez 50 microlitres de la solution mère de 168 millimolaire de l'AAC analogue à l'AANC au premier volume fractionné, afin de créer une solution d'acides aminés contenant les 20 AAC. Vortexez soigneusement la solution, puis replacez le tube sur glace. Répartissez la solution en aliquotes dans des tubes réactionnels et étiquetez-les « + AAC ». Congelez rapidement les aliquotes dans l'azote liquide et stockez-les à −80 °C. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d'eau doublement distillée stérile au second volume fractionné du mélange mère d'acides aminés afin de préparer un mélange d'acides aminés contenant 19 AAC, vortexez soigneusement la solution, puis replacez-la sur glace. Répartissez la solution en aliquotes et étiquetez les tubes « − AAC ». Enfin, ajoutez 50 microlitres de la solution mère de 168 millimolaire de l'AANC au dernier volume de 1,35 millilitre, afin de préparer un mélange d'acides aminés contenant 19 AAC et l'AANC. Vortexez soigneusement le mélange, puis replacez-le sur glace. Répartissez, étiquetez et congelez les tubes. Sur glace, décongelez trois aliquotes de 30 microlitres d'extrait brut, une aliquote « + AAC », une aliquote « − AAC », une aliquote AANC, trois aliquotes de tampon énergétique et la solution d'ADN vecteur. Placez l'eau doublement distillée stérile sur glace. Ajoutez ensuite 15 microlitres de tampon énergétique et pipetez doucement de haut en bas, puis vortexez délicatement la solution pour homogénéiser. Ajoutez 15 microlitres de l'aliquote de solution d'acides aminés « + AAC », 10 microlitres de solution d'ADN vecteur à 90 nanomolaire et 20 microlitres d'eau doublement distillée stérile aux 30 microlitres d'extrait brut. Préparez le témoin négatif en ajoutant 15 microlitres de tampon énergétique, 15 microlitres de « − AAC », 10 microlitres de solution d'ADN vecteur à 90 nanomolaire et 20 microlitres d'eau doublement distillée stérile aux 30 microlitres d'extrait brut. Poursuivez la réaction AANC en combinant 15 microlitres de tampon énergétique, 15 microlitres de « + AANC », 10 microlitres de solution d'ADN vecteur à 90 nanomolaire et 20 microlitres d'eau doublement distillée stérile aux 30 microlitres d'extrait brut. Incubez ensuite tous les tubes. Dix minutes avant d'effectuer l'électrophorèse SDS-PAGE, diluez un microlitre de chacune des réactions visqueuses in vitro dans quatre microlitres d'eau doublement distillée stérile dans des tubes réactionnels. Vortexez soigneusement, puis centrifugez brièvement les liquides avec une mini-centrifugeuse. Ajoutez cinq microlitres de tampon de charge 2X aux cinq microlitres de réaction in vitro diluée. Vortexez soigneusement, puis centrifugez les liquides avec une mini-centrifugeuse. Placez les tubes réactionnels dans un bloc chauffant et assurez-vous que les couvercles sont bien fermés. Pendant ce temps, transférez le tampon de migration dans la cuve d'électrophorèse. Après chauffage, centrifugez les liquides avec une mini-centrifugeuse. Après la centrifugation, vortexez brièvement les tubes et répétez la centrifugation. Transférez 15 microlitres d'échelle protéique et 10 microlitres de chaque échantillon dans les puits, puis démarrez l'électrophorèse. Extrayez soigneusement le gel de la cassette et fixez-le pendant 30 minutes. Transférez ensuite le gel dans la solution de coloration pendant 60 minutes. Après coloration, transférez le gel dans la solution de décoloration pendant 60 à 120 minutes. Mélangez des volumes égaux de tampon de liaison his et de la réaction in vitro, puis pipetez doucement de haut en bas. Vortexez ensuite délicatement le tube. Assemblez ensuite le système de colonne. Vortexez soigneusement la solution mère du gel d'affinité his jusqu'à ce que la résine soit complètement dissoute. À l'aide d'une pipette de 1 millilitre, transférez 250 microlitres de résine dans la colonne. Centrifugez la colonne pendant cinq à dix secondes à 13 000 à 15 000 × g. Assurez-vous que la résine est complètement vidée, puis transférez 150 à 300 microlitres du mélange réaction in vitro/tampon de liaison his dans la colonne. Centrifugez la colonne. Jetez le flux passant, puis replacez la colonne dans le tube de collecte. Ajoutez 250 microlitres de tampon de lavage his, puis tapez doucement et vortexez délicatement la colonne pour resuspendre la résine. Centrifugez le tube de colonne. Jetez le tube de collecte, puis placez la colonne dans un nouveau tube réactionnel standard de 1,5 millilitre. Ajoutez 150 microlitres de tampon d'élution et resuspendez la résine en tapotant et en vortexant doucement. Centrifugez ensuite la colonne pour diluer la protéine purifiée dans le tampon d'élution. Retirez d'abord le bouchon inférieur de la colonne de filtration sur gel, puis retirez le bouchon supérieur. Placez la colonne dans un tube de lavage de 2 millilitres et centrifugez-la pour éliminer le tampon de stockage du gel. Jetez le flux passant, puis ajoutez jusqu'à 400 microlitres de tampon de stockage des protéines et centrifugez la colonne. Répétez cette étape une fois afin que tout le tampon de stockage des protéines soit chargé dans le gel. Placez la colonne dans un tube de collecte neuf et ajoutez soigneusement jusqu'à 100 microlitres de la solution de protéine modèle purifiée directement au centre du lit de gel. Centrifugez la colonne. Après l'échange de tampon, placez les 100 microlitres complets de la solution de protéine modèle dans un tube ouvert dans le concentrateur sous vide rotatif. Fermez le couvercle du concentrateur et démarrez la rotation à 30 °C. Ce SDS-PAGE illustre l'incorporation réussie de la L-canavanine, ou Can, dans la protéine cible deGFP, la réaction in vitro de référence présentant le niveau d'expression le plus élevé de deGFP. La réaction in vitro Can produit une concentration légèrement inférieure de deGFP, tandis qu'aucune expression de deGFP n'est détectée dans le témoin négatif. Un SDS-PAGE a été réalisé après purification par étiquette his et échange de tampon des molécules de deGFP exprimées. HPLC

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