Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

L'objectif général de cette expérience est de différencier des cellules souches pluripotentes humaines en cardiomyocytes avec une efficacité et une reproductibilité élevées. Ce protocole peut être amplifié dans un bioréacteur ou modifié pour différencier des lignées cellulaires sensibles à la culture en cellules isolées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la modélisation des maladies cardiaques à l'aide de cellules souches pluripotentes induites humaines.

Les principaux avantages de cette technique sont son faible coût ainsi que son efficacité, sa reproductibilité et son applicabilité élevées, tant pour les cellules souches embryonnaires humaines que pour les cellules souches pluripotentes induites. Notre démonstratrice aujourd'hui est Hananeh Fonoudi, actuellement doctorante à l'Institut de recherche cardiaque Victor Chang, venue du Royan Institute. Avant le revêtement, utilisez une brosse de nettoyage et de l'eau distillée pour éliminer soigneusement toute poussière ou résidu de culture d'un flacon agité de 100 millilitres en verre équipé d'un pendule.

Ensuite, remplir le flacon avec de l'éthanol à 70 %. Après 30 minutes, rincer le flacon à l'eau distillée, puis le remplir avec de l'hydroxyde de sodium à cinq molaire. Le lendemain matin, rincer le flacon à l'eau courante pendant cinq minutes, puis le remplir avec de l'acide chlorhydrique à un molaire.

Après 15 minutes, rincez le flacon à l'eau courante pendant cinq minutes supplémentaires, puis effectuez deux rinçages avec de l'eau doublement distillée. Placez le flacon dans une hotte de sécurité biologique pour le faire sécher. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de solution de silanisation dans le flacon, puis faites-le tourner horizontalement afin de recouvrir toutes les surfaces de silicium.

Chauffer le flacon enduit dans une étuve sèche pendant une heure à 100 degrés Celsius. Une fois que le flacon a refroidi, le rincer trois fois pendant 15 minutes avec de l'eau déionisée. Ensuite, stériliser le récipient en autoclave à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Après avoir repiqué des sphéroïdes non différenciés par la méthode de repiquage en cellules individuelles au moins trois fois, utilisez une pipette de cinq millilitres pour transférer tous les sphéroïdes non différenciés dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les puits avec un millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines afin de récupérer les sphéroïdes restants, puis rassemblez le lavage avec les sphéroïdes récoltés. Laissez les sphéroïdes se sédimenter pendant cinq minutes afin de former un culot lâche.

Ensuite, aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas retirer de sphéroïdes. Puis, rincez les sphéroïdes avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes, et incubez-les dans 5 millilitres de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius. Après quatre à cinq minutes, arrêtez la réaction avec un millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines, et utilisez une pipette P1000 pour dissocier les sphéroïdes en une suspension monocellulaire.

Après avoir effectué un dénombrement par exclusion au bleu de trypan, resuspendre les cellules à une concentration de 200 000 cellules par millilitre dans un milieu conditionné supplémenté en facteur de croissance des fibroblastes de base et en inhibiteur de ROCK, puis transférer 100 millilitres de la suspension cellulaire dans un flacon bioréacteur siliconé. Placer le flacon sur l'agitateur à 35 tr/min. Après 24 heures, augmenter l'agitation à 40 tr/min.

Après 48 heures, arrêter l'agitation pendant cinq à dix minutes jusqu'à ce que toutes les sphéroïdes reformées se soient déposées au fond du flacon, puis remplacer la moitié du milieu par un milieu conditionné supplémenté en facteur de croissance des fibroblastes de base. Ensuite, redémarrer l'agitateur à 40 tr/min pendant encore 24 heures, en remplaçant la moitié du milieu selon le même procédé chaque jour pendant les trois jours suivants. Au jour cinq, arrêter l'agitateur pendant cinq à dix minutes.

Ensuite, transférez toutes les sphéroïdes dans un tube de 50 millilitres contenant 50 millilitres de milieu ou moins. Éliminez tout milieu restant dans le flacon, en veillant à ce qu'aucune sphéroïde ne demeure dans le récipient. Puis, retirez soigneusement le surnageant des sphéroïdes décantées et lavez les agrégats cellulaires dans 25 millilitres de PBS contenant du calcium et du magnésium.

Après cinq à dix minutes, éliminer la solution de lavage et resuspendre les sphéroïdes dans 40 millilitres de milieu RPMI-B27 supplémenté en inhibiteur de la glycogène synthase kinase-3, inhibiteur de la ROCK et d'alcool polyvinylique. Transférer tous les sphéroïdes dans le flacon du bioréacteur. Ensuite, ajouter du milieu RPMI-B27 frais jusqu'à un volume total de 100 millilitres et redémarrer l'agitation à 40 tr/min.

Après 24 heures, suivez le même processus pour changer le milieu par du milieu RPMI-B27. Après 24 heures supplémentaires, suivez le même processus et changez le milieu par du RPMI-B27 contenant IWP2, purmorphamine et SB43. Incubez pendant 48 heures.

Les premières contractions sont généralement observées après sept jours. Pour la différenciation rapide de lignées de cellules souches pluripotentes humaines qui n'ont pas été adaptées à la culture en cellules simples, traitez d'abord une culture de cellules souches pluripotentes humaines ayant atteint une confluence de 70 à 80 %, cultivée sur des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris, avec 5 millilitres de solution de dissociation pendant 30 à 60 secondes. La solution de dissociation ne doit être laissée en place que jusqu'à ce que les MEFs s'arrondissent et que les bords des colonies de CSPH deviennent visibles.

Si les cellules restent trop longtemps, elles ne se différencieront pas correctement. Au moment opportun, remplacez rapidement la solution de dissociation par 75 millilitres de collagénase de type IV, puis incubez les cellules de cinq à 15 minutes à 37 degrés Celsius, en examinant la culture au microscope toutes les quelques minutes. Lorsque les colonies entières commencent à se détacher, remplacez la collagénase par 1,5 millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines, et utilisez une pipette P1000 pour détacher délicatement les colonies entières de cellules du fond de la plaque.

Les cellules doivent être détachées avec précaution afin que les colonies ne se fragmentent pas en petits morceaux. Ensuite, utilisez une pipette de cinq millilitres pour transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres, et lavez les puits avec un millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines, en regroupant les cellules restantes dans le tube de 15 millilitres. Après cinq minutes de sédimentation, remplacez soigneusement le surnageant par deux millilitres de milieu frais pour cellules souches embryonnaires humaines supplémenté en facteur de croissance des fibroblastes de base.

À l’aide d’une nouvelle pipette de cinq millilitres, transférez les cellules dans une plaque à attachement ultra-faible et incubez les colonies pendant six à douze heures. À la fin de l’incubation, utilisez une pipette de cinq millilitres pour transférer délicatement les agrégats de colonies dans un nouveau tube de 15 millilitres, et récupérez les agrégats restants à l’aide d’un lavage avec du milieu RPMI-B27. Une fois les colonies sédimentées, remplacez le surnageant par du milieu RPMI-B27 frais supplémenté d’un inhibiteur de la glycogène synthase kinase-3, puis transférez soigneusement les colonies dans des plaques revêtues de laminine pour leur attachement à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures, changer le milieu par du milieu RPMI-B27. Après encore 24 heures, changer le milieu par du milieu RPMI-B27 contenant de l'IWP2, de la purmorphamine et du SB43. Les premiers battements sont généralement observés après sept jours.

Jusqu'à présent, le protocole de différenciation en suspension statique a été testé sur cinq lignées de cellules souches embryonnaires humaines et quatre lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines, produisant plus de 90 % de sphéroïdes battants pour chaque lignée, démontrant ainsi la forte reproductibilité de ce protocole parmi différentes lignées de cellules souches pluripotentes humaines. Les sphéroïdes en cours de différenciation présentent un comportement similaire dans un environnement de bioréacteur en suspension agitée comparé au système statique, environ 100 % des sphéroïdes étant observés en contraction au jour 10. En effet, l'analyse de sections de sphéroïdes battants prélevées au jour 30 révèle respectivement l'expression cytoplasmique de la troponine T cardiaque et l'expression nucléaire du facteur de transcription cardiaque NKX2.5.

En outre, lorsque les sphéroïdes non différenciés sont remplacés par des agrégats cellulaires non différenciés, des agrégats battants apparaissent sept jours après la différenciation. Parmi 42 lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines testées, on observe en moyenne plus de 60 % de populations cellulaires positives pour la troponine T cardiaque au jour 15. Les agrégats battants montrent également une expression cytoplasmique similaire de la troponine T cardiaque et une expression nucléaire de NKX2.5, comme celle observée dans les sphéroïdes générés par un bioréacteur à agitation en suspension.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des hPSC qui ont été adaptées à la culture en cellules uniques pendant au moins trois passages avant la différenciation dans le bioréacteur. Cette procédure peut être combinée à d'autres méthodes d'enrichissement des cardiomyocytes afin d'obtenir une population cellulaire pure. Cette technique a ouvert la voie à la commercialisation des cardiomyocytes dérivés des hPSC.

Il présente un potentiel d'utilisation dans des applications cliniques, pharmaceutiques, en ingénierie tissulaire, ainsi que dans le développement d'organes ou d'organoides. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines en cardiomyocytes et d'agrandir la culture dans un bioréacteur.