Name: In Vitro perméation de ferritines FITC-chargés sur un Rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l étude de la prestation de Nanoformulated Molecules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Apprenez une méthode validée pour étudier la perméation de nanoformulations fluorescentes à travers la barrière hémato-encéphalique chez le rat. Ce modèle in vitro utilise des nano-cages de ferritine chargés de FITC pour améliorer la livraison de médicaments.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs remercient Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia et l’hôpital Sacco (projet NanoMeDia) pour le financement de la recherche.

1. Mise en place du modèle BBB Remarque: Pour établir le modèle BBB, nous vous suggérons d&#39;utiliser RBMECs primaires disponibles dans le commerce et RCAs. Toutes les étapes doivent être effectuées avec des réactifs et consommables stériles, manipulés dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Culture de cellules <ol><li> Manteau des flacons de culture cellulaire avec poly-L-lysine 100 pg / ml (1 h à température ambiante) ou fibronectine 50 pg / ml (1 heure à 37 ° C) afin de promouvoir l&#39;attachement des RCAs ou RBMECs, respectivement. Ensuite, décongeler 1 x 10 6 et 5 x CR 10 5 RBMECs dans des cellules endothéliales supplémenté avec 5% de sérum de fœtus bovin, le supplément de croissance cellulaire endothélial à 1% et 1% de pénicilline / streptomycine (SecM). RCAs de semences dans un flacon T175 dans 20 ml SECM et RBMECs dans un flacon T75 dans 10 ml SECM. Note: La décongélation et passages d&#39;ensemencement de RCAs et RBMECs doivent être ajustés, en termes de densité et de temps dans la culture cellulaire, en fonction du nombre de conditions expérimentales à tester avec le modèle du Bureau. En débutment avec une fiole de 1 x 10 6 et CR 1 flacon de 5 x 10 5 RBMECs, il est possible d&#39;obtenir jusqu&#39;à 20 plaquettes BBB roulement. </li><li> Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée pendant environ 6 jours, jusqu&#39;à environ 80% de confluence pour RCAs et plus de 90% de confluence pour RBMECs. Détacher les cellules en utilisant une solution de trypsine-EDTA (trypsine 1: 250) pendant 5 min (1 ml de trypsine pour les flacons T75 et de 2 ml pour les flacons T175). Arrêtez l&#39;activité de la trypsine avec SECM (2: 1), les suspensions cellulaires de centrifugation à 750 g pendant 5 min et remettre les pastilles dans 60 ml SECM. </li><li> Divisez les RBMECs dans 3 flacons T175 et la culture en SECM pendant encore 3 jours avant le semis sur inserts. Compter le nombre total de la vie RCAs, en observant une suspension cellulaire diluée 1: 1 avec le bleu trypan sous un microscope optique dans une chambre Burker. </li></ol></li><li> Cellule Semis sur Inserts <ol><li> Traiter un côté du polyéthylène téréphtalate (PET) membrane de transpa 6 multi-puitsinserts ent de poly-L-lysine 100 pg / ml et de l&#39;autre côté de fibronectine à 50 ug / ml, pour permettre la fixation de RCAs et BMECs. Manipuler les inserts avec des pinces afin d&#39;éviter tout contact avec la membrane PET. <ol><li> Placez les inserts dans une plaque à 6 puits et ajouter la solution de fibronectine (minimum 500 pi) dans la chambre supérieure. Après 1 heure d&#39;incubation à 37 ° C, retirer la solution de fibronectine, prendre les inserts au large de la plaque multi-puits et mettez - les à l&#39; envers sur le fond d&#39;un 150 cm plat 2 Petri, qui est utilisé ici comme un support stérile pour la déjà revêtu des inserts. </li><li> Ajouter doucement 800 ul de poly-L-lysine sur la face inférieure de l&#39;insert (comme représenté sur la figure 1A, dénommé CR ensemencement), et maintenir la solution sur les inserts pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution et laisser les inserts sécher à température ambiante pendant 15-30 min. Les inserts sont maintenant prêts pour l&#39;ensemencement des cellules, mais ils peuvent également être stockés dans la plaque multi-puits pour plusieursjours à 4 ° C, avant de procéder à la construction BBB. Note: Rappelez-vous de garder au moins 3 inserts enrobés exempts de cellules, pour être utilisés comme témoins pour valider BBB établissement par FD40 mesures de flux. </li></ol></li><li> RCAs graines (35 000 / cm 2) sur le côté inférieur des plaquettes de poly-L-lysine, en déposant 800 pl de suspension cellulaire sur la plaquette à l&#39; envers (figure 1A). Laisser la suspension RCA sur les inserts pendant 4 heures à la température ambiante, afin de permettre la fixation efficace des cellules à la membrane. </li><li> Aspirer la solution résiduelle, on place les inserts dans les puits contenant 2 ml de SecM et de maintenir la plaque multi-puits à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée, en changeant la SecM tous les 2 jours. </li><li> Après 3 jours, lorsque les RCAs ont revêtu la face inférieure de l&#39;insert, RBMECs de semences sur la face supérieure de l&#39;insert, suivant ces étapes: <ol><li> Détachez RBMECs de flacons T175 et compter leles cellules vivantes totales, tel que rapporté dans les étapes 1.1.2 et 1.1.3. </li><li> RBMECs de graines (60,000 / cm 2) sur la surface supérieure de l&#39;insert dans SECM (1000 pi) (figure 1B), laissant 3 inserts avec seulement les astrocytes, à utiliser comme TEER fond. Placer la plaque multi-puits dans des conditions de culture standard. Maintenir le système à la culture pendant au moins 3 jours, en changeant la SecM dans la chambre intérieure inférieure et tous les 2 jours. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. BBB Validation <ol><li> TEER mesure <ol><li> Sur le 3 ème jour de co-culture, vérifiez la TEER en insérant les inserts BBB portant dans une chambre appropriée (qui a une casquette et où à la fois la chambre et le bouchon contiennent une paire de tension de détection et électrodes de courant), rempli de 4 ml de SECM. Se connecter à un épithéliale volts de tissu / ohmmètre. </li><li> Ensemble avec les mesures de TEER des cellules BBB-systèmes, enregistrer les valeurs TEER des 3 inserts portant les RCAs eà sera soustrait des valeurs obtenues avec le BBBs. Multipliez les valeurs TEER résultant par la surface de l&#39;insert (4,2 cm 2) afin d&#39;exprimer les résultats sous forme de Ω x cm 2. </li><li> De la 3 ème jour de co-culture, mesurer la TEER chaque jour. Remarque: Après une première période où le TEER augmente, les valeurs enregistrées devraient rester stables pendant au moins deux jours consécutifs (généralement entre le 5 e et le 7 e jour de co-culture). À ce stade, le BBB est prêt pour la deuxième étape de validation (section 2.2) et / ou pour les expériences trans-BBB. Remarque: La procédure décrite dans la section 2.1 peut être effectuée sur les mêmes BBB-systèmes dédiés aux expériences de perméabilité suivantes (section 3). Faire fonctionner dans des conditions stériles. </li></ol></li><li> Trans-BBB Flux de FITC-dextran 40 (FD40) <ol><li> Mesurer le flux FD40 de la partie supérieure à la chambre inférieure des modèles BBB par rapport à celle sur 3 inserts vides(Voir la note de la section 1.2.1) selon les étapes suivantes: <ol><li> Ajouter 1 mg / ml FD40 (dilué dans SECM) dans le compartiment supérieur du BBBs, et après 1, 2 et 3 h retirer 200 pi SECM de la chambre inférieure et de mesurer l&#39;intensité de fluorescence par spectrofluorimètre (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, fente 5). </li><li> Obtenir les valeurs de SECM fond fluorescenceby mesurant 500 pi de milieu vierge en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustraire la SECM fluorescence de fond de toutes les valeurs de fluorescence FD40. </li><li> Déterminer la quantité de FD40 pénétrée par comparaison des valeurs de fluorescence observée avec une courbe d&#39;étalonnage réalisée avec des concentrations connues (p. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 pg / ml) du traceur fluorescent dissous dans 500 ul de SecM. </li><li> Calculer le coefficient de perméabilité apparente (P APP) à partir des valeurs moyennes de flux selon l&#39; équation : P app = J / AC <br/&gt; Où J est le flux de la molécule (mole / s), A est la surface de perméation (cm 2) et C est la concentration de la molécule dans le compartiment supérieur (mole / cm 3). Note: Trois ou plus BBB-systèmes qui ont atteint des valeurs TEER appropriées, doivent être exclusivement consacrés à cette procédure de validation, et ne doivent pas être utilisés pour les expériences de perméabilité suivantes (section 3). Stérilité est pas obligatoire. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trans-BBB perméation de FITC-chargé ferritines (FNN) Remarque: Une variante recombinante de ferritine humaine (Fn), produite dans Escherichia coli et assemblé en nanocages (FNN) pour l&#39;encapsulation de différentes molécules fluorescentes, est disponible à partir du NanoBioLab du Prof. Prosperi (Université de Milan-Bicocca, Italie). FNN sont chargés avec FITC, selon un protocole décrit précédemment 13 et les concentrations des deux Fn et les molécules chargées sont exactement détermined. <ol><li> Trans-BBB Flux de FITC et FITC-FNN <ol><li> Mesurer le flux FITC FNN de la partie supérieure à la chambre inférieure de modèles BBB validés (habituellement au 5 ème - 7 ème jour de co-culture), par rapport à celle du colorant libre après 7 et 24 heures d&#39;incubation, selon les étapes suivantes: <ol><li> Ajouter FITC-FNN (50 pg / ml FNN, 1,1 uM FITC) ou un montant égal à la libre FITC dans la chambre supérieure d&#39;au moins 6 systèmes BBB pour chaque formulation, afin de retirer 2 ml de solution SECM de la chambre basse du au moins 3 inserts après 7 h, et de la chambre basse du 3 autres inserts après 24 h. </li><li> Mesurer l&#39;intensité de la fluorescence de 500 ul des échantillons prélevés par spectrofluorimètre (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, fente 5). </li><li> Obtenir la fluorescence de fond SECM en mesurant 500 pi de milieu en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustraire la fluorescence de fond SECMde toutes les valeurs de fluorescence FITC ou FITC FNN. </li><li> Déterminer la concentration de FITC infiltrée ou FITC FNN en comparant les valeurs de fluorescence obtenues avec deux courbes d&#39;étalonnage différentes produites avec des concentrations connues (p. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nm) du colorant libre ou nanoformulated dissous dans 500 SecM ul. </li></ol></li></ol></li><li> FITC-FNN Localisation dans RBMECs <ol><li> Retirer SECM de la chambre supérieure des systèmes BBB, se laver les inserts avec PBS et fixer les RBMECs sur au moins deux inserts pour chaque groupe expérimental en ajoutant 500 ul paraformaldéhyde (4% dans un tampon phosphate salin-PBS) dans le compartiment supérieur pour 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les inserts trois fois avec du PBS pour éliminer le paraformaldehyde résiduel. Remarque: A partir de ce point, la stérilité est pas nécessaire. </li><li> Coupez des morceaux appropriés de la membrane PET, et procéder à la immunodecoration des cellules selon les étapes suivantes: <ol><li> PermeabiRBMECs liser avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes. Effectuer une étape de blocage pendant 1 heure à température ambiante avec une solution contenant 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), le sérum de chèvre à 2% dans du PBS. Incuber les échantillons avec un anticorps anti-facteur Von Willebrand (VWF), à une dilution 1:20, pendant 2 heures à la température ambiante. </li><li> Après trois lavages avec du PBS, exposer les cellules pendant 2 heures à température ambiante à une BSA 2%, une solution de sérum de chèvre à 2% contenant un anticorps secondaire approprié à une dilution 1: 300 dans le but de mettre en évidence l&#39;anticorps anti-REO, et DAPI à 1: 1500 dilution pour la détection des noyaux. </li></ol></li><li> Monter les pièces d&#39;insertion sur des lames de microscope en utilisant une solution de antifade de montage (une goutte par fragment d&#39;insert), puis fermez l&#39;échantillon avec une lamelle. Analyser par microscopie confocale en utilisant une lentille à immersion d&#39;huile à un grossissement de 40X, 1,5 zoom et 1,024 x 1,024 pixels de résolution. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+compounds+that+cross+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier.</a> BMC Neurol. 9 (1), 3(2009).</li>
<li>Löscher, W., Potschka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+brain+disease+and+the+role+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).</li>
<li>Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+quantum+dots+for+crossing+blood-brain+barrier+in+vitro+and+providing+therapy+of+HIV-associated+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy.</a> Front Pharmacol. 15 (4), 140(2013).</li>
<li>Masserini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+Brain+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for Brain Drug Delivery.</a> ISRN Biochem. , (2013).</li>
<li>Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomedicines+for+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Towards nanomedicines for neuroAIDS.</a> Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritins%3A+a+family+of+molecules+for+iron+storage%2C+antioxidation+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).</li>
<li>Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+denaturation%2Frenaturation-based+production+process+for+ferritin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).</li>
<li>Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+on+endothelium+of+brain+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries.</a> Nature. 312, 162-163 (1984).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).</li>
<li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li>
<li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells.</a> J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).</li>
<li>Fiandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulation+of+antiretroviral+drugs+enhances+their+penetration+across+the+blood+brain+barrier+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice.</a> Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).</li>
<li>Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+an+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+%28BBB%29%3A+a+focus+on+BBB+impermeability+and+receptor-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport.</a> J. Vis. Exp. , e51278(2014).</li>
<li>Perrière, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+for+molecular+analysis+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters.</a> Brain Res. 1150, 1-13 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode in vitro décrite ici représente une approche validée utile d&#39;étudier la livraison trans-BBB de molécules fluorescentes sur nanoformulation avec des nanoparticules. Ici, nous utilisons FNN, ce qui représente un bon candidat pour étudier la translocation de molécules de fret à travers la BHE. FNN est considéré comme le nanovecteur d&#39;or trans-BBB fourniture de médicaments / agents puisqu&#39;il est spécifiquement reconnu par le récepteur TfR1, qui est exprimé sur la membrane luminale des BMECs e...

La résistance du système nerveux central (SNC) , des maladies ( par exemple. Le cancer, l&#39; épilepsie, la dépression, la schizophrénie et le trouble neurologique associée au VIH) à des thérapies pharmacologiques est due à divers mécanismes, y compris la perméation du médicament difficile à travers la barrière hémato-encéphalique (BBB) . La BHE est la limite qui permet d&#39;isoler les tissus cérébraux des substances qui circulent dans le sang. Au sein de cette barrière, une couche de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs), soutenus par péricytes et astrocytes endfeet, est responsable de la grande sélectivité de la BHE à ces médicaments hydrosolubles avec un poids moléculaire supérieur à 400 Da 1. Un autre mécanisme de résistance liée à la drogue est liée à la présence sur BMECs des transporteurs à efflux (protéines P-glycoprotéine et de résistance multidrogue), qui coopèrent pour réduire la pénétration du médicament dans le système nerveux central et faciliter leur extrusion du cerveau 2. Dans la dernière décennie, Un grand nombre d&#39;approches nanotechnologiques ont été développés pour relever le défi clinique et biologique de fournir des médicaments à travers le 3-6 BBB. Dans ce contexte, nanosphères ferritine (FNN) représentent une solution totalement innovante et prometteuse. FNN sont des sphères 12 nm de 24 ferritine auto-assemblage (Fn) des monomères qui sont disposés dans une structure sphérique creuse de diamètre intérieur 8 nm. les sous-unités de ferritine peuvent être démontées à pH acide et réassemblés de façon à mémoire de forme en amenant le pH à la neutralité, ce qui permet diverses molécules organiques à encapsuler. Par conséquent, FNN représente un modèle intéressant pour le développement de l&#39; administration de médicaments multifonctionnels systèmes 7,8. En outre, FNN peut interagir avec BMECs grâce à la reconnaissance spécifique du récepteur de la transferrine (TfR) 1, qui est exprimé sur la membrane luminale de ces cellules 9. Jusqu&#39;à présent, différents modèles in vitro du BBB ont été développés en order pour élucider trans-BBB perméabilité à divers médicaments, toxicité vers le BBB, ou l&#39;interaction des molécules avec des transporteurs d&#39;efflux. En effet, ces modèles sont considérés comme valides des approches in vitro pour un dépistage rapide de molécules actives avant de procéder à des études in vivo. Ces modèles sont constitués d&#39;une seule couche endothéliale de BMECs ou BMECs et astrocytes co-culture (plus rarement péricytes), obtenu à partir d&#39; animaux (rat, souris, porcs et bovins) ou des lignées cellulaires humaines 10,11,12. La résistance électrique transendothéliale (TEER) et la perméabilité apparente (P app) des traceurs avec un poids moléculaire défini représentent deux paramètres critiques qui sont utilisés pour déterminer la qualité du modèle in vitro. Ici , nous décrivons l&#39;emploi d&#39;un modèle BBB in vitro, sur la base d&#39; une co-culture de rat BMECs (RBMECs) et le rat astrocytes corticales (OIEC) pour étudier la pénétration trans-BBB de nanocages ferritine encapsuler isothi fluorescéineocyanate (FITC).

<table><tbody><tr><td>Cellules endothéliales microvasculaires du cerveau du rat&nbsp ;</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>isolé à partir de tissu cérébral de rat Sprague Dawley, cryoconservé au premier passage et délivré</td></tr> des <tr><td>astrocytes corticaux congelés&nbsp ;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>isolé à partir de tissu cérébral de rat de 2 jours, cryoconservé au premier passage et livré congelé.</td></tr><tr><td>Kit de milieu de cellules endothéliales</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) et sérum de bovin fœtal (25 ml), supplément de croissance des cellules endothéliales (5 ml) et pénicilline/streptomycine (5 ml). Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation et protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA sans Rouge de Phénol</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920D</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Fluorescéine isothiocyanate-dextran 40 000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>protègent de la lumière</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>diluition dans la cagoule chimique</td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin de Dulbecco sans Ca et Mg</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>sérum de chèvre&nbsp ;</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>souris monoclonale anti-facteur de von Willebrand</td><td>Dako</td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps conjugué à AlexaFluor 546 contre les IgG de souris</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>protègent de</td></tr><tr><td>la lumière DAPI (4' ,6-diamidino-2-phénylindole)&nbsp ;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>protéger de la lumière</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>la même solution peut être utilisée plusieurs fois</td></tr><tr><td>fibronectine à partir de plasma bovin</td>.<td>Sigma</td><td>F1141</td><td>la même solution peut être utilisée plusieurs fois Inserts</td></tr><tr><td>en polyéthylène téréphtalate (PET) Falcon</td><td></td><td>F3090</td><td>Membranes transparentes en polyéthylène téréphtalate (PET) ; surface : 4,2 cm2 ; taille des pores 0,4 & micro ; m/surface</td></tr><tr><td>T75 Primo TC flacon</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Primo TC flacon</td><td>EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Tissu épithélial Volt/Ohmmètre&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>World Precision Instruments Allemagne</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm- 24SNAP cup</td><td>World Precision Instruments Allemagne</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lumière/fluorescence avec caméra</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W Module de caméra</td><td>&nbsp ; Microscope inversé pour cellules vivantes avec caméra&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre</td><td>Jasco</td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro perméation de ferritines fitc-chargés sur un rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l&#39; étude de la prestation de nanoformulated molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, soutenues par les péricytes et les astrocytes aux extrémités, sont responsables de la faible perméation des grands médicaments hydrosolubles à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE), ce qui rend difficiles l’efficacité des thérapies pharmacologiques. Au cours des dernières années, différentes stratégies visant à promouvoir le ciblage du cerveau ont visé à améliorer l’administration et l’activité des médicaments sur ce site, y compris des nanosystèmes innovants pour l’administration de médicaments à travers la BHE. Dans ce contexte, une approche in vitro basée sur un modèle cellulaire simplifié de la BHE fournit un outil utile pour étudier l’effet des nanoformulations sur la perméation trans-BHE des molécules. Cette étude décrit le développement d’une BHE à double couche, composée de cellules endothéliales microvasculaires et d’astrocytes primaires de cerveau de rat disponibles dans le commerce. Une approche multiparamétrique pour la validation du modèle, basée sur la mesure de la résistance électrique transendothéliale et de la perméabilité apparente d’un dextran de haut poids moléculaire, est également décrite. Comme preuve de concept pour l’utilisation de ce modèle BBB pour étudier l’effet de différentes nanoformulations sur la translocation des molécules fluorescentes à travers la barrière, nous décrivons l’utilisation de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), chargé dans des nanoparticules de ferritine. La capacité des ferritines à améliorer la perméation trans-BHE de la FITC a été démontrée par des mesures de flux et des analyses de microscopie confocale. Les résultats suggèrent qu’il s’agit d’un système utile pour valider les nanosystèmes pour l’administration de médicaments à travers la BHE.

Au cours de la mise en place du modèle de BBB, l&#39;attachement et la croissance cellulaire sur les inserts peuvent être surveillés à l&#39;aide d&#39;un microscope optique grâce à la nature transparente de la membrane en PET. RCAs, ensemencées à une densité de 35.000 cellules / cm2, fixer efficacement à la face inférieure de l&#39;insert après 4 heures d&#39;incubation à la température ambiante (figure 2A) et se développer pour couvrir la surface de la membr...

Une méthode permettant d’établir un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique basée sur une co-culture de cellules endothéliales microvasculaires et d’astrocytes de cerveau de rat est décrite et validée. Ce système s’est avéré être un outil valable pour étudier l’effet de la nanoformulation sur la perméation trans-barrière des molécules fluorescentes.

In Vitro perméation de ferritines FITC-chargés sur un Rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l&#39; étude de la prestation de Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

L'objectif général de cette procédure est de décrire une approche validée pour étudier la traversée de la barrière hémato-encéphalique par des molécules fluorescentes formulées sous forme de nanovéhicules, en utilisant des nano-cages de ferritine chargées en FITC comme preuve de concept. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la résistance des maladies du système nerveux central aux traitements pharmacologiques, en raison de la faible perméabilité des médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de démontrer la capacité d'une formulation nanostructurée à améliorer la perméation transbarrière des molécules encapsulées, en utilisant une approche basée sur un modèle unique de barrière hémato-encéphalique.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des troubles présentant des effets neurologiques, car elle permet généralement de surmonter la forte sélectivité de la barrière hémato-encéphalique vis-à-vis de la plupart des médicaments. Cette méthode peut fournir des informations sur l'efficacité des nano-cages de ferritine en tant que système de transport de

in-vitro-permeation-fitc-loaded-ferritins-across-rat-blood-brain

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cette vidéo décrit un test de perméabilité permettant d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique in vitro à l’aide de molécules de fluorescéine sodique.

Essai de perméabilité mimétique de la barrière hémato-encéphalique : un essai in vitro pour évaluer la perméabilité de l’imitation de la BHE aux molécules traceurs

Cette vidéo présente une méthode pour étudier la perméation à travers un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique (BHE) utilisant des astrocytes et des cellules endothéliales sur un insert membranaire, avec du FITC libre et de la ferritine chargée de FITC. La FITC-ferritine s’est liée aux récepteurs des cellules endothéliales et a traversé la barrière membranaire jusqu’à la chambre inférieure, tandis que la FITC libre a montré une perméation restreinte et est restée dans la chambre...

Étude de la perméation de la FITC et de la FITC-Ferritine à l’aide d’un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d'un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L'expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l'inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato - encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

Dans cette étude, nous présentons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la rupture de la barrière hémato - encéphalique au titre de maladies neurodégénératives. Pour atteindre notre objectif, nous avons infusé de haut poids moléculaire isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine dans la jugulaire de souris de la veine et évalué sa fuite dans le parenchyme du cerveau par microscopie à fluorescence.

Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Médicament ciblant les tumeurs du système nerveux central est un défi majeur. Nous décrivons ici un protocole pour produire un imitateur in vitro de la tumeur-barrière hémato-encéphalique à l’aide de cellules murines ou humaines et discuter de leur pertinence pour la prévisibilité du système nerveux central ciblant les tumeurs in vivo.

Prédiction en prestation de charges utiles Vivo à l’aide d’une barrière hémato-encéphalique tumeur dans un plat

Ce protocole illustre un test in vitro de transcytose des cellules endothéliales comme modèle pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne en mesurant la capacité des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines à transporter la peroxydase de raifort à travers les cellules dans les processus de transport transcellulaire médiés par les cavéoles.

Essai de transcytose cellulaire endothéliale comme modèle in vitro pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne

Dans la présente étude, le dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) est administré à des souris par gavage oral pour évaluer la perméabilité intestinale à la fois in vivo et dans des échantillons plasmatiques et fécaux. Comme la fonction de barrière intestinale est affectée dans de nombreux processus pathologiques, ce test direct et quantitatif peut être utilisé dans divers domaines de recherche.

Évaluation de l’intégrité de la barrière intestinale chez la souris à l’aide de dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

Apprenez une méthode validée pour étudier la perméation de nanoformulations fluorescentes à travers la barrière hémato-encéphalique chez le rat. Ce modèle in vitro utilise des nano-cages de ferritine chargés de FITC pour améliorer la livraison de médicaments.

In Vitro perméation de ferritines FITC-chargés sur un Rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l étude de la prestation de Nanoformulated Molecules (Vidéo) | JoVE Journal

In Vitro perméation de ferritines FITC-chargés sur un Rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l' étude de la prestation de Nanoformulated Molecules

Explorer plus de vidéos